第六章-固定化酶、固定化细胞

第七章固定化酶、固定化细胞,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,酶催化剂的优点：专一性强，反应条件温和，反应速度较快。弱点：溶液酶在反应后，分离困难，重复利用困难；溶液酶稳定性差，易失活。,1969出现了固定化酶技术。固定化酶就是把原来游离的水溶性酶，固定于某一局部的空间或者固定于载体上。,概述,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,发展历史,1953年，德国，Grubhofer、Schleith，聚氨基苯乙烯树脂为载体，重氮法；1969年，日本，千畑一郎，固定化氨基酰化酶，从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，首次工业规模应用固定化酶，促使酶工程作为一个独立的学科从发酵工程中脱离出来；1971年，第一次国际酶工程会议确定固定化酶统一英文名称为ImmobilizedEnzyme。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,1973年，日本首次在工业上成功应用固定化大肠杆菌菌体中天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精；1978年，日本用固定化枯草杆菌细胞生产淀粉酶，开始了固定化细胞产酶的先例。1979年，固定化毛地黄细胞和长春花细胞成功；1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,固定化酶：,酶的固定化：将酶和菌体与不溶性载体结合的过程；固定化酶：在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续进行反应，反应后的酶可回收重复使用；概念发展“水不溶酶”（waterinsolubleenzyme)“固相酶”（solidphaseenzyme)1971年第一届国际酶工程会议正式采用“固定化酶（immobilizedenzyme)”,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,固定化酶的特点具有生物催化剂的功能，又有固相催化剂的功能。可多次使用；反应后，酶底物产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高；反应条件易控制；酶的利用效率高；比水溶性酶更适合于多酶反应；,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶（固定化酶）,固定化技术,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,固定化酶生物反应器,实际应用中，固定化酶可以装在反应器中，连续生产有利于生产的自动化，提高生产率。鉴于此，70年代以来，该技术受到各国学者的瞩目，纷纷开展固定化酶的研究。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,第一节酶、细胞的固定化方法及固定化后的性质,一、固定化的原则和方法酶催化作用依靠它的高级结构及活性中心。固定化时，活性中心的必需基团应避免参加反应；避免高温、强碱、有机溶剂以及高浓度盐的处理，保护靠氢键、离子键、疏水键等弱键维系的酶蛋白质的高级结构。尽可能在温和条件下进行固定化反应。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,固定化方法：载体结合法；交联法；包埋法；其他方法；,载体结合法：将酶（细胞）固定在不溶性载体上。靠共价结合、离子结合、和物理吸附。常用的载体：纤维素、葡聚糖、琼脂糖等多糖衍生物颗粒或多孔玻璃等。,交联法：使酶与具有两个以上官能团的试剂（如：戊二醛）进行反应，应用化学键把酶固定。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,包埋法：将酶包在凝胶微小格子内，或是将酶包裹在半透性聚合物膜内的固定化方法。常用的凝胶为聚丙烯酰胺、海藻酸钙、胶原、卡拉胶等。包埋法简单，可适用于大多数酶。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,固定化方法与载体的选择依据固定化酶应用的安全性；固定化酶在操作中的稳定性；固定化的成本；,固定化酶的形状颗粒状固定化酶；纤维状固定化酶；膜状固定化酶；管状固定化酶；,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,二、固定化酶、细胞的性质,1、固定化后的活性酶经固定化后，活力降低。原因是：a.酶和载体结合时，活性中心的氨基酸也或多或少地参与了结合，使得酶的结构发生部分变化，酶活力有一部分丧失。b.由于载体的存在，有空间位阻，影响底物和酶接触，酶的活性得不到全部表达。细胞固定化后，一般酶活力不下降。细胞内酶受细胞膜、壁的保护。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,固定化酶结构的改变,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,2、稳定性酶或细胞被固定化后，由于载体的存在，酶分子的结构或细胞被约束，对外部恶劣环境的敏感性下降，使其稳定性增加（对热、对各种化学试剂等）。而且有时稳定性增加的幅度比较大。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,3、催化特征,a.底物专一性：当底物为大分子时，酶或细胞对底物专一性下降；当底物为小分子时，酶或细胞对底物专一性变化不大。,b.最适pH：依固定化载体与酶分子、细胞上所分布电荷的相互作用不同而异。有的变化，有的不变化，有的向pH小的方向移动，有的向pH大的方向移动。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,c.反应的最适温度固定化酶、细胞的最适温度往往升高，升高的幅度不同，215不等。,d.动力学常数固定化酶的表观Km(app)与游离酶的Km相比有些不变，有的变化很大。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,原因可能是：载体间的静电作用，以及扩散效应。如果固定化酶区域的底物浓度比外部液相主体溶液高，Km(app)下降。相反，用包埋法的固定化酶的Km(app)值，可较游离酶多两个数量级。这是由于凝胶中的扩散效应使底物浓度减少，导致内部底物浓度低于外部区域的浓度，Km(app)上升。对于固定化细胞，情况类似。Vmax一般不变化。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,第二节固定化酶、固定化细胞的应用,在上世纪70年代初，出现固定单一的酶，催化单一反应；随后同时固定两种酶或两种以上的酶，以及固定化酶和辅酶，催化复杂一些的反应；再后来发展起来的固定化细胞技术，使得不易提取的不稳定的酶的利用有了方便条件，还可以利用活细胞的完整代谢体系来完成复杂的反应，如乙醇的生产。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,在固定化酶、固定化细胞的研究中发展起来的亲和层析技术，已经远远超出了利用酶和微生物进行催化反应的范畴。例如抗体抗原的提纯是利用了特异的免疫吸附反应。,固定化酶和细胞技术的显著特点：p801.连续反应；2.获得的产物纯度高；3.固定化酶或细胞可重复使用，减少了浪费；4.易实现自控,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,应用实例：DL-氨基酸的光学拆分。人体只能利用L-氨基酸，所以L-氨基酸在食品医药领域的应用非常广泛，并且需要量不断增加。化学合成法是生产氨基酸的方法之一，该法成本低，但生产出来的氨基酸是DL外消旋体。要想把L-氨基酸分离出来，需要进行光学拆分。,外消旋体：对映体的右旋体和左旋体等量混合后，它们的旋光性相互抵消，不再有旋光性。这样的混合物称为外消旋体，以D、L表示。外消旋体可以用适当方法拆开或分开。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,外消旋化：在一般情况下，和不对称碳原子相连的四个原子或原子团，不能随意调换位置，因此对映体不能相互转换，旋光度维持不变。但在热、光、或者化学试剂的影响下，不对称碳原子上的原子或原子团可发生调换现象，使旋光物质转化为它的对映体，最后得到外消旋体，原来100%的左旋体，经变化后，变成50%左旋体和50%的右旋体，这种现象称为外消旋化。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,DL-氨基酸光学拆分中，以酶法最佳，它是利用酰化氨基酸水解酶，制备纯度高的L-aa，且收率高。,氨基酰化EDL-R-CHCOOH+H2OL-R-CHCOOH+D-R-CHCOOH不对称水解NH2NH2NHCOR溶解度小酰化-DL-aaL-aa酰化D-aa,外消旋化,外消旋体,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,固定化酶光学拆分DL-氨基酸生产流程,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,1969年，日本，千钿一郎成功地利用固定化酰化氨基酸水解酶，由酰化-DL-氨基酸连续生产L-aa获得成功。这是世界上固定化酶在工业生产上应用的第一个实例。各种光学活性氨基酸都用这种方法生产。该项技术成功的关键是制造出适合于工业化要求的固定化酶。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,果葡糖浆的生产,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,葡萄糖不能直接代替蔗糖，因甜度不够，但葡萄糖和果糖是同分异构体，葡萄糖可以异构为果糖。,高果糖浆的甜味是蔗糖的2倍。这一应用是目前世界上使用固定化酶规模最大的生产上的实例。,(高果糖浆),生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,L-苹果酸的生产：p85,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,消血栓：纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,人工肾：原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,酶传感器固定化酶和电化学传感器的结合。优点：既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度；酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定。,1967年Updike等采用酶的固定化技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器葡萄糖氧化酶电极。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,酶电极示意图-D-葡萄糖O2D-葡萄糖酸-1,5-内酯H2O2,半透膜,酶胶层,感应电极,根据反应中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧电极、pH电极和H2O2电极来测定葡萄糖的含量。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,生物识别元件是酶、抗原(体)、细胞器、组织切片和微生物细胞等生物分子经固定化后形成的一种膜结构，对被测定的物质有选择性的分子识别能力。,生物传感器(酶传感器)原理由生物识别单元（如酶、微生物、抗体等）和物理转换器相结合所构成的分析仪器。,换能器将识别元件上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光或热等转换为电信号，并呈现一定的比例关系。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,酶传感器工作原理示意图,酶传感器主要由固定化酶膜和变换器组成：固定化酶膜：选择性地“识别”并催化被检测物质发生化学反应；变换器：把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,固定化技术的限制：5个方面见p88,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,第三节固定化酶、细胞反应动力学,影响固定化酶反应动力学的因素可归纳下列几个方面：,酶活性与酶分子的三维空间结构有关。酶分子被固定时，其构象将发生改变，酶活性部位的三维结构可能改变，从而改变酶的活性。,1、酶分子构相的改变和载体屏障效应,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,1.酶分子构相的改变和载体屏障效应,载体的存在引起屏蔽效应，使酶分子的活性基团不易与底物或效应物接触，从而影响固定化酶的活性。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,2.微环境效应分配效应,固定化酶处于主体溶液中，形成非均相反应系统。在固定化酶附近的环境称为微环境，而主体溶液则称为大环境。由于载体和底物的疏水性、亲水性以及静电作用，使微环境与大环境有不同的性质，从而形成底物和各种效应物的不均匀分布，这种效应称为分配效应。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,3.扩散阻力,用固定化酶进行反应时，底物必须从主体溶液传递到固定化酶内部的催化部位。反应后，产物又沿着相反路线从酶的催化部位传递到主体溶液。这些传递过程包括被动分子扩散和对流扩散，传递过程中存在着一个扩散速率限制因素。这种扩散限制效应在扩散效率很低时，而酶的催化活力又相当高时特别显著。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,固定化酶、细胞催化系统是一种非均相反应系统，包括：底物从反应液移向载体表面（外扩散）底物从载体表面移向酶活性中心（内扩散）酶反应产物由反应位点移向载体表面（内扩散）产物移到反应液中（外扩散）总的反应速度取决于最慢的步骤,限速步骤有可能是外扩散、内扩散或酶反应。存在的扩散效应会使固定化酶、固定化细胞的动力学行为偏离其液态下的动力学行为。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,4.外扩散及对酶反应动力学的影响,外扩散发生在固定化酶周围的处于停滞状态的液膜层。由于存在外扩散阻力，底物将在固定化酶周围形成浓度梯度。滞流层的厚度在一定限度内，它受固定化酶界面周围溶液的相对速度的影响。外扩散限制随反应体系搅拌速度的增加而减少。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,存在外扩散限制的固定化酶反应动力学方程为：,Vm=KE，E为固定化酶浓度Km(app)：表观米氏常数，=Km+/KLKL=De/y(见p94)在操作上使流体的湍动程度大，能改变或消除外扩散的影响。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,5.内扩散及对酶反应动力学的影响,内扩散阻力发生在多孔性固定化酶载体的内部，它是底物传递到固定化酶内部时的一种扩散限制效应。,在微环境内底物的消耗和产物的积累程度，和这些物质的分子量大小有关。,大分子物质在多孔介质中扩散时，其扩散系数较小，以致在微环境中形成严重的底物枯竭和产物的大量积累，这会严重影响酶促反应速度。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,内扩散限制对酶促反应动力学的影响，比外扩散更为突出，因为外扩散限制可以通过搅拌来基本消除，而内扩散限制无法消除。在固定化酶、固定化细胞的内部，不存在流体流动，其传质完全依赖于分子被动扩散作用。,定义为有效系数：,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,固定化酶、细胞的反应速度：,Sa：载体表面底物浓度是与内扩散系数有关的因子,R为固定化颗粒半径,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,6.扩散的判定,判断出固定化酶、固定化细胞在反应过程中究竟属于哪种扩散效应，对反应动力学的解析和应用非常重要。最简单的判断方法是Arrhenius图解法，见p96。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,第四节固定化酶、细胞反应器,1.影响酶反应速度的因素，通常有下列三方面：,（1）浓度因素酶浓度、底物浓度、产物浓度浓度因素是所有影响因素中最基本的因素；是均相酶反应动力学的主要内容。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,（2）外部反应环境因素反应环境的温度、压力、pH以及溶剂的介电常数、离子强度等。（3）内部结构因素底物和酶的结构。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,2.酶反应器的设计原理及操作参数,为了设计酶反应器以及确定反应操作条件，首先必须了解：反应速度特性以及温度、pH等因素的影响，建立反应速率方程式；反应器的形式和反应器内流体流动状态以及传热特点；产物的产量和质量。,物料平衡、热量平衡、反应速率和流动特性等各关系式都可同时应用于反应器设计。参与反应的各组分均服从于质量守恒定律，这是设计的出发点。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,表示反应器性能的重要操作参数：空间时间、转化率和生产率；当有副反应发生时，选择率也是重要的参数。空间时间（简称空时，spacetime）表示反应物在连续操作反应器内停留的时间。,空时的倒数称为空速(spacevelocity)。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,PFR:,CSTR:,VR：反应器容积(L)；,Q：加入反应器的底物溶液体积流量。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,转化率x，又称为反应率。表示加入反应器中底物的转化率。间歇操作:,S0:初始浓度；St:经反应时间t后的浓度,连续操作:,Sin:流入反应器溶液中的底物浓度Sout:流出反应器溶液中的底物浓度,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,生产率Pr（生产能力productivity）反应器单位体积单位时间内的产物生成量。,间歇式反应器：,连续式反应器：,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,选择率Ssp(selectivity)当反应过程中有副反应发生，还生成其它产物时，通常使用选择率这个概念。Ssp是实际转化成目的产物量与全部底物可生成产物的理论量之比。,式中asp代表1摩尔底物能生成目的产物P的理论量（摩尔），其数值取决于反应的计量式,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,3.理想的均相酶反应器的动力学,对三种最基本的反应器型式进行讨论。间歇全混流反应罐（BSTR）活塞流反应器（PFR）全混流反应器（CSTR）,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,（1）PFR的操作特性方程,物料在PFR反应器中的停留时间,dl,F,F,S0,S,dV=Adl,l=0,l=L,S+dS,S,以底物S进行物料衡算：,流入量=流出量+反应量+积累量FSF（S+dS）-rsdV0,dl,F,F,S0,S,dV=Adl,l=0,l=L,S+dS,S,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,边界条件：,L=0，S=S0；l=L，S=S，积分：,这是BSTR和PFR的酶反应动力学操作方程式。,将米氏方程代入，积分。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,（2）CSTR的操作特性方程,稳态时，对于底物S进行物料衡算：流入量=流出量+反应量+积累量FS0FSt-rsV0,F,F,S0,St,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,将米氏方程代入,整理：CSTR操作特性方程为：,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,工程上要求，在最短的操作时间内，用最少量的（固定化）酶，达到最大的产物生成量、最高的底物转化率，以使生产成本最低。(这些条件称之为反应器效率。)下面比较CSTR和PFR的反应器效率：,（3）PFR和CSTR反应器的生产时间比较为了方便比较，把操作方程改写为：,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,x应在80以上。达同样的转化率，F值差别很大。而且S0/Km越小，差别越显著。,结论：PFR的停留时间小于CSTR的停留时间,同一反应，工艺条件相同，转化率相同，PFR和CSTR所需的时间不同。转化率越高，两者差距越大。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,（4）PFR和CSTR反应器的用酶量比较,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,反应器体积一定，达到相同转化率时，ECSTR/EPFR与转化率的比较,转化率x愈高，Km/S0越大，用酶量的差别越大。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,在给定的反应体系下，反应器中的装酶量为定值，达一定x下反应器所需酶量愈少；反应器的反应有效容积也就愈大。可见PFR的生产能力比CSTR的大。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,第五节固定化酶、细胞反应器及其动力学,1.固定化酶、细胞反应器,反应器的类型和特点(1)间歇式搅拌罐反应器用于游离酶反应后随即放料。(2)连续流动搅拌罐反应器连续进料、连续出料(3)填充床反应器固定化酶填充于床层内。反应器内的流体的流动形态为活塞流形。底物以恒定流速通过反应床。,生物工程专业课程,生化工程第七章固定化酶固定化细胞,(4)流化床反应器底物以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态。(5)循环反应器部分反应液流出和新加入底物流入液混合，在进入反应床进行循环。(6)连续流动搅拌罐-超滤膜反应器由连续流动搅拌罐反应器和超滤装置组合而成。在连