细胞计数方法------细胞计数板法

细胞计数法-细胞计数板法实验原理：当待测细胞悬液中的细胞均匀分布时，每毫升细胞悬液中的细胞数可以通过测量一定体积悬液中的细胞数来换算。具体操作：1.将计数板和盖板擦拭干净，并将盖板盖在计数板上。2.吸出少量细胞悬液，滴在盖板边缘，使悬液充满盖板和计数板之间的空间，静置3分钟。注意盖板下没有气泡，悬浮液不能流入侧油箱。3.计算平板中四个细胞的总数，只计算左边和上面的细胞。然后根据公式计算：细胞数/毫升=四个大细胞总数/410个细胞/毫升(注意：当有很多单元格时，可以从四个单元格中选择一定数量的较小单元格。由于每个大单元格中有16个较小的单元格，因此可以计算左侧和上方的单元格数，并计算每个较小单元格中的单元格数。平均值M，m16是每个单元的平均值。因此，细胞密度=1610个细胞/毫升)注意：公式除以4，因为计算的是4个大单元格中的单元格数。公式乘以10，因为计数板中每个大细胞的体积为：1.0毫米(长)1.0毫米(宽)0.1毫米(高)=0.1毫米，1毫升=1000微升=1000毫米(注意：偶尔在显微镜下可以看到由两个以上细胞组成的细胞群，这应根据单个细胞进行计算。如果细胞团超过10%，这意味着分散不好，需要再次制备细胞悬液。)=细胞计数板的使用一、血细胞计数板基本结构血细胞计数器是一种特殊的厚玻璃载玻片，有四个槽形成三个平台。中间的平台较宽，中间被一个短横槽分成两半。每一半都刻有一个小方格。每个正方形网格被分成九个大网格。中间的大网格用于计数，称为计数区。计数区有两个刻度：一是计数区分成16个大方块(大方块用三条线隔开)，每个大方块分成25个小方块；另一种是，一个计数被分成25个大方块(大方块由双线分隔)，每个大方块被分成16个小方块。然而，无论计数区是什么样的结构，它们都有一个共同的特点，即计数区由400个小方块组成。如果计数区的边长为1毫米，则计数区的面积为1平方毫米，每个小方块的面积为1/400平方毫米。盖玻片盖好后，计数区的高度为0.1毫米，所以每个计数区的体积为0.1毫米3，每个小方块的体积为1/4000毫米3。用细胞计数板计数时，应先测定每个小方块中的微生物数量，然后换算成每毫升菌液(或每克样品)中的微生物细胞数量。二。细胞计数板-用途1.根据待测细菌悬液的浓度，加入无菌水适当稀释(斜面通常稀释100倍)，以每细胞细菌数为度。2.取一块干净的细胞计数板，并在计数区盖上一个盖玻片。3.将细菌悬液摇匀，用滴管吸一点，从计数板中间平台两侧的凹槽中沿盖玻片下边缘挑一小滴(不要太多)。让细菌悬液充满液体表面张力的计数区，不要产生气泡，用吸水纸吸出从凹槽流出的多余细菌悬液。也可以将细菌悬液直接滴到计数区(不要用细菌悬液涂抹计数区两侧的平台，以免盖玻片后计数区的深度增加)，然后盖上盖玻片(不要产生气泡)。4.静置一会儿，让细胞停留在计数板上，不要随液体漂移。将细胞计数板放在显微镜载物台上并夹紧。在低倍率镜头下找到计数区域后，切换高倍率镜头进行观察和计数。因为活细胞的折射率与水的折射率相似，所以活细胞的折射率与水的折射率相似5.如果计数区由16个大方块组成，根据对角线方向，计算左上角、左下角、右上角和右下角4个大方块(即100个小方块)中的细菌数量。如果是一个由25个大方块组成的计数区，上述四个方块的除数就特别大，需要对中心大方块(即80个小方块)中的细菌数量进行计数。为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，对放在网格上的细胞计数应有统一的规定。如果菌体位于一个大正方形的双线上，则计数上一行，计数下一行，计数左一行，以减少误差。也就是说，网格的上、左行上的单元被计数到网格中，网格的下、右行上的单元根据规则被计数到相应的网格中。请参见下图：即，该单元格中有3个计数单元格。6.对于出芽酵母，当芽体达到母细胞一半大时，可以算作两个菌体。对每个样品重复计数2-3次(每个值不应相差太多，否则应重新操作)，并根据公式计算每毫升(g)细菌悬液中包含的细胞数。7.计数后，取下盖玻片，用水冲洗细胞计数板，不要用硬物清洗或擦拭，以免损坏网格刻度。清洗后，自己或用吹风机吹干，并储存在盒子里。三、细胞计数平板计数公式1.16格25格细胞计数板计算公式：细胞数/毫升=100格细胞数/10040010000的稀释倍数1.25格16格细胞计数板计算公式：细胞数/毫升=80格细胞数/8040010000稀释倍数4.血细胞计数板计数误差的主要来源是什么？我们应该如何最小化误差并努力提高准确性？血细胞计数的误差分别来自技术误差和内在误差。其中，操作人员采血不顺畅、设备操作和使用不当、稀释不准确、细胞识别错误等因素造成的误差属于技术误差。然而，由不准确和不精确的仪器(计数板、盖子、吸管等)引起的误差。)被称为仪器误差，由诸如细胞分布不均匀等因素引起的细胞计数误差属于分布误差或场误差。仪器误差和分布误差统称为固有误差或系统误差。通过标准化操作、提高熟练程度和校正仪器，可以避免或校正技术误差和仪器误差，但细胞分布误差很难完全消除。因此，红细胞计数的质量控制一般需要以下措施。1.避免技术错误并纠正仪器错误(1)所用设备应清洁干燥，计数板、血盖片、微量移液器和刻度移液器的规格应符合要求或予以校正。(1)计数板的标识：计数室的台面应光滑透明，计数室的标记清晰，标记区域准确。必要时，用经过严格校正的目镜测微计测量计数室的边长和底面积，用测微计测量计数室的深度。美国国家标准局(NBS)规定，每个大方块的边长误差应小于1%，即10.01毫米，深度误差应小于2%，即0.10.002毫米。如果超过上述标准，应将其丢弃。(2)血盖应具有一定的重量，平整、光滑、无裂纹、厚度均匀，可用卡尺多点测量(至少9点)，不均匀在0.002毫米以内.必要时，平面平行度用于测量和评估，需要密集的平行直干涉条纹。最简单的评估方法是将干净的盖板贴在干燥的平板玻璃上。如果它能被吸附一段时间而不脱落，它会在落下时以弧形旋转，表明盖板是平的且厚度均匀。同时，合格的盖板放置在计数室表面后，在与支撑柱紧密接触的位置可以看到彩虹。选定的封面与其他封面紧密重叠后，在掠光下观察。如果你看到完整和平行的彩虹条纹，另一个封面的质量也(3)严格操作，从消毒、采血、稀释、灌装池到计数都应规范，尤其应注意血样稀释和灌装池应充分混合，并防止剧烈休克破坏红细胞。计数室必须一次充满，以防止产生气泡。待填充的细胞悬液的量不应超过计数室的相对表面和血液覆盖片之间的矩形边缘。(4)报告法定计量单位。2.计数域误差或分布误差的减少由于血细胞在注入计数室后的随机分布或泊松分布引起的计数误差称为计数域误差或分布误差，因为我们可以计数的细胞分布范围是有限的。减少这种误差的有效方法是尽可能扩大细胞计数范围和计数数量。通常，首先进行误差估计，然后确定计数所需的数量和计数范围，只要误差可以控制在允许的范围内。伯克森指出，当使用相同的移液器和相同的侧计数室来计数面积为0.2mm2的细胞数时，变异系数被控制在可接受的7%以内。对于红细胞计数来说，由于红细胞的数量很大，所以在计数室是“拥挤”的，这是从泊松公式推导出来的。为了将误差控制在5%的变化范围内，在计数室中至少需要对400个红细胞进行计数，因此需要对红细胞进行五格计数。事实上，柏克森还通过实验证明，红细胞计数域误差为s=0.92，小于理论误差(泊松分布误差)。3.当排除异常标本的干扰白细胞数在正常范围内时，其影响相对于红细胞数可以忽略不计，但如果白细胞过高(100109/L)，则应校正计数结果。方法是：实际红细胞=计算红细胞-白细胞。例如，当红细胞转化率为3.51012/升，白细胞转化率为100109/升时，患者的实际红细胞数应为3.41012/升.高倍镜下计数时避免有核细胞。有核细胞体积大于正常红细胞，中心无凹陷，无麦秆黄色折射。可以隐约看到细胞核。此外，急性重度贫血患者可提前大量释放网织红细胞，这也给红细胞计数带来一定的干扰，影响网织红细胞的绝对值计算结果。校正方法需要讨论。使用计数室对于微生物学、细胞培养和许多需要使用细胞悬浮液的应用，有必要确定细胞浓度。人们通常可以用分光光度法测定悬浮细胞的密度，但是这种测定方法不能评估细胞的生存能力，也不能区分细胞类型。一种用于测定单位体积悬浮液中细胞数量的装置称为计数室。最广泛使用的腔室类型被称为血细胞计数器，因为它最初是为进行血细胞计数而设计的。为了准备计数室，用透镜纸仔细清洁镜面抛光表面。盖玻片也被清洁。安装室的盖玻片是特制的，比传统显微镜的盖玻片更厚，因为盖玻片必须足够重以克服一滴液体的表面张力。在将g放入细胞悬液之前，将盖玻片放在计数表面上。用巴氏灭菌器或其他类型的移液管将悬浮液引入其中一个V形孔中。盖玻片下的区域通过毛细作用填充。应该引入足够的液体，使镜面刚好被覆盖。然后将充电的计数室放置在显微镜载物台上，并以低功率聚焦计数网格。由于计数室比传统的载玻片厚得多，因此必须非常小心地使用更高功率的物镜。如果用户不小心，腔室或物镜可能会损坏。在40倍(4倍物镜)处可以看到标准血细胞计数器上的一个完整网格，带有纽鲍尔刻度。主要的