生物化学 第二章 核酸化学

.,第二章,核酸的化学,.,本章内容,概述DNARNA核酸的性质,.,第一节核酸的发展历史及研究现状,.,核酸化学研究史（1）,1869年Miescher,博士论文工作中测定淋巴细胞蛋白质组成时,发现了不溶于稀酸和盐溶液的沉淀物,并在所有细胞的核里都找到了此物质,故命名核质(Nuclein)1879年Kossel经过10年的努力,搞清楚核质中有四种不同的组成部分:A,T,C和G；,核酸研究史1,.,核酸化学研究史（2）,1889年Altman建议将“核质”改名为“核酸”,因为已经认识到“核质”乃“核酸”与蛋白质的复合体。1909年Levene发现酵母的核酸含有核糖1930年Levene发现动物细胞的核酸含有一种特殊的核糖脱氧核糖,得出了一个错误概念:植物核酸含核糖,动物核酸含脱氧核糖。这个错误概念一直延续到1938年，这时方清楚RNA和DNA的区别。Levene还提出了核酸的“磷酸核糖(碱基)磷酸的骨架结构,解决了DNA分子的线性问题,还在1935年提出四核苷酸,认为这四种碱基的含量是一样的。,核酸研究史2,.,核酸化学研究史（3）,1950年Chargaff,E和Hotchkiss,R.D.采用纸层析法仔细分析了DNA的组成成分,得知A=T,G=C,A+G=C+T1953年Watson,Crick根据DNA的X射线图谱的研究结果,提出了DNA的双螺旋模型(Doublehelix)。几星期后提出了半保留式复制模型。1957年Meselsnhe又称热解链温度。,四、核酸的性质,.,3、影响Tm的因素：,1）DNA的均一性；2）G-C含量：Tm与G-C含量成正比。3）介质中的离子强度：离子强度低，Tm低，熔解温度范围窄。,.,DNA分子的Tm与GC含量的关系,.,盐浓度对DNA变性的影响,.,五、核酸的复性,概念：变性DNA在适当条件下（缓慢降温），可使两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结构的过程。复性后，许多物化性质可得到恢复，生物学活性部分恢复。影响因素：温度、DNA片段大小、DNA浓度、碱基重复序列多少、离子浓度。,四、核酸的性质,.,DNA变性与复性,.,第五节、分子生物学技术,一、分子杂交与探针技术1、概念：1）分子杂交（hybrization):利用核酸变性、复性性质，根据碱基配对原则，将二条不同来源的nt链形成杂合双链的过程。DNA-DNA：DNA-RNA:,.,2)探针（probe),一小段（十几至数百）多聚核苷酸单链用32P、35S或生物素标记其末端或全链。制备：用确诊病人细胞中提取的DNA；用病毒DNA；用肿瘤组织提取的DNA。,.,上：探针标记右：放射自显影,.,.,二、限制性内切酶：,1、核酸的工具酶有：水解酶类；聚合酶类；连接酶；碱性磷酸酯酶；反转录酶；,.,2、水解酶：水解磷酸二酯键,1）按专一性分：DNA水解酶、RNA水解酶2）按作用方式分：外切酶：从核酸链3或5一个个水解。内切酶：作用于核酸链内部。,.,3、限制性内切酶,在核苷酸链内特定序列切开DNA双链的酶。因切法不同，产生三种产物：交错切产生粘性末端：平切产生平头末端：,.,粘性末端,.,应用于克隆、测序、检测DNA等,.,DNA凝胶电泳,.,三、Southern印迹法,分子生物学技术,用于检测DNA方法：如图,.,Northernblot：用于检测RNAWesternblot：用于检测蛋白质,.,四、聚合酶链式反应（polymeerasechainreaction,PCR),.,原理：碱基配对；聚合酶