HPLC高效液相色谱法培训解析.ppt

1,高效液相色谱法,HighPerformanceLiquidChromatographyHPLC,2,讲授提纲,HPLC仪器HPLC基本操作HPLC使用注意事项HPLC分类分析中的实际问题,3,Agilent1100,仪器,4,1HPLC的组成及工作流程,1螺旋注射泵2往复柱塞泵3往复隔膜泵4气动放大泵,1自动进样器2手动进样器,1液固2液液3键合相色谱4离子交换5空间排阻,1紫外检测器2荧光检测器3蒸发光散射4示差折光检测器5电化学检测器6电导检测器7质谱检测器,色谱柱是高效液相色谱仪的“心脏”，是实现色谱分离的基础。,5,仪器组成,高压输液系统进样系统色谱分离系统检测系统数据处理系统,6,仪器组成,7,高压输液系统,溶剂贮液瓶溶剂脱气装置高压输液泵梯度洗脱装置,8,溶剂贮液瓶,用途：贮存流动相溶剂材料：玻璃或塑料，无色或棕色，容积：约为0.52.0L位置：高于泵，以保一定的输液静压差。,9,溶剂脱气装置,真空脱气机在线真空脱气机可实现流动相在进入输液泵前的连续真空脱气，适用于多元溶剂系统。简单的高效液相色谱仪无在线脱气装置，流动相必须用离线脱气法。,10,真空脱气机,11,溶剂脱气方法,离线脱气法抽真空脱气超声波振荡脱气吹氦脱气在线脱气法,12,抽真空脱气,常用方法用微型真空泵，降压至0.050.07MPa即可除去溶解的气体。使用真空泵连接抽滤瓶可以一起完成过滤和脱气的双重任务。滤膜常用0.45m，分有机相和水相膜，切不可用水相膜过滤有机相。,13,将流动相置于超声波清洗机中，用超声波振荡1030min，即可。,用在液体中比空气中溶解度低的氦气，以60mLmin的流速缓缓地通过流动相1015min，除去溶于流动相中气体。,超声波振荡脱气,吹氦脱气,14,高压输液泵,是HPLC系统中最重要的部件之一。输液泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。,15,输液泵应具备的性能,流量稳定，其RSD应0.5%。对定性定量的准确性至关重要。流量范围宽，分析型应在0.110ml/min范围内连续可调，制备型能达到100ml/min。输出压力高，一般可高达400500kg/cm2。液缸容积小，适于梯度洗脱。密封性好，耐腐蚀。,16,输液泵类型,1螺旋注射泵2往复柱塞泵3往复隔膜泵4气动放大泵,目前应用最多的是柱塞往复泵。,17,泵的使用与维护,防止任何固体微粒进入泵体，因此应过滤流动相。流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应停泵过夜或保留在泵内更长时间。必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于保存色谱柱和有利于泵维护的溶剂。,18,泵的使用与维护,防止流动相耗尽空泵运转，导致柱塞磨损、缸体或密封损环，最终产生漏液。输液泵的工作压力不能超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液(40MPa,400bar,5800psi)。流动相应脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。,19,梯度洗脱装置,用途：梯度洗脱。等度(isocratic)高效液相洗脱方式梯度(gradient)低压梯度（外梯度）梯度洗脱方式高压梯度（内梯度）,20,低压梯度,在常压下将两种或多种溶剂按一定比例输入泵前的比例阀中混合后，再用高压泵将流动相以一定的流量输出至色谱柱。常见的是四元泵，如waters2690/2695；Agilent1100。特点：只需一个高压输液泵，由计算机控制四元比例阀来改变溶剂比例，实现二元四元梯度洗脱，成本低廉、使用方便。由于溶剂在常压下混合，易产生气泡，需要良好的在线脱气装置。,21,梯度洗脱系统（低压梯度）,22,高压梯度,一般只用于二元梯度，即用两个高压泵分别按设定比例输送两种不同溶液至混合器，在高压状态下将两种溶液进行混合，然后以一定的流量输出。主要优点：只要通过梯度程序控制器控制每个泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，且精度很高，易实现自动化控制。如：waters515,23,梯度洗脱系统（高压梯度）,24,进样系统,作用：将试样引入色谱柱位置：在高压泵和色谱柱之间类型：手动或自动进样器：六通阀,25,进样器,手动六通阀经注射器进样自动六通阀圆盘式自动进样器链式自动进样器,26,27,六通阀手动进样器原理示意图,LoadInject,28,六通阀,有6个接口，1和4之间接定量环，2接高压泵，3接色谱柱，5、6接废液管。定量环常见体积有5、10、20、50L等，可以根据需要更换不同体积的定量环。,29,手动进样器,用微量注射器将样品溶液注入六通阀注意必须使用HPLC专用平头微量注射器，不能使用气相色谱尖头微量注射器，否则会损坏六通阀。进样方式：有部分装液法和完全装液法,30,进样方式,部分装液法：注入的样品体积应不大于定量环体积的50%，并要求每次进样体积准确、相同。完全装液法：注入的样品体积应最少是定量环体积的3倍，以完全置换定量环内流动相，消除管壁效应，确保进样准确度及重现性。,31,32,自动进样器,由计算机自动控制进样六通阀、计量泵和进样针的位置，按预先编制的进样操作程序工作，自动完成定量取样、洗针、进样、复位等过程。,33,色谱分离系统,保护柱色谱柱柱温箱柱切换阀,34,色谱柱,色谱柱是分离好坏的关键使用时，流动相的方向应与柱的填充方向一致。色谱柱的柱管外壁都以箭头显著地标示了该柱的使用方向，安装和更换色谱柱时要使流动相按箭头所指方向流动。,35,色谱柱(尺寸),分析型：4.6mm制备型：5mm以上微径柱：2.1mm柱长：1025cm，30cm少见柱体：直型优质不锈钢柱管,36,色谱柱(装填),1)方法干法装柱、匀浆法装柱2)装柱要求均匀紧密、不破坏颗粒、不形成裂缝、颗粒粗细不可分级,37,色谱柱(规格),填料品牌选择性填料粒径柱效，dp小，n大。(dp:5um3umUPLC1.7um)色谱柱尺寸流动相线速度一致，分离行为一致。,38,色谱柱的使用与维护,应避免压力、温度和流动相的组成比例急剧变化及任何机械震动经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质如硅胶柱以正己烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗（所有溶剂都必须严格脱水）甲醇能洗去残留的强极性杂质，己烷能使硅胶表面重新活化,39,色谱柱的使用与维护,经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或三氯甲烷）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗（如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后用水冲洗这一步）一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射100200l四氢呋喃数次，有助于除去强疏水性杂质（类脂）用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脱能除去蛋白质污染,40,柱温箱,用于使色谱柱恒温的装置，一般其控温范围高于室温，也可低于室温，通常控制柱温在3040。有些柱温箱还具有柱切换装置。色谱柱的工作温度对保留时间、相对保留时间、溶剂的溶解能力、色谱柱的性能、流动相的粘度都有影响。一般升高柱温，可增加组分在流动相中的溶解度，减小分配系数K，缩短分析时间；还可降低流动相的黏度，降低柱压与提高柱效。,41,检测系统,通用型检测器示差折光检测器（RID）蒸发光散射检测器（ELSD）专属型检测器紫外检测器（UVD）荧光检测器（FD）电化学检测器（ECD）,42,紫外检测器,可变波长紫外检测器（VWD）,43,紫外检测器,光电二极管阵列检测器（DAD）,44,紫外检测器,45,荧光检测器,46,蒸发光散射检测器,47,蒸发光散射检测器,利用将含有待分离组分的流动相雾化、蒸发形成固体微粒后对光的散射现象来检测色谱流出组分流动相必须是可挥发的如果流动相含有缓冲盐，则必须使用挥发性盐如醋酸铵等，而且浓度要尽可能低,48,蒸发光散射检测器,优点消除了因溶剂和温度变化而引起的基线漂移，特别适合于梯度洗脱应用范围适用于任何挥发性小于流动相的组分的检测不适于检测挥发和半挥发性的化合物其他检测器难以检测的化合物如磷脂、皂苷、糖类和聚合物等,49,HPLC分析基本操作,1准备：流动相配制、脱气，样品制备。2开机：依次打开计算机、泵、检测器、柱温箱电源开关，仪器自检。3装柱：将吸液头插入已经过滤和脱气处理的甲醇中，开启泵，使液体流出，调流速在0.2mL/min，连接色谱柱（注意方向），待液体流出色谱柱后，再与检测器连接。,50,HPLC分析基本操作,4平衡：升高流速（常规分析柱一般至1mL/min），大约15min后，换上准备的流动相（若流动相含盐或甲醇比例较低，中间需适当过渡），待基线走稳。5仪器面板或色谱工作站设置分析条件，如设置泵参数：工作流速、流动相比例、高压限和低压限；设置检测器参数：如检测波长（nm）、灵敏度（AUFS）等；编辑样品名、采集时间、进样体积等。,51,HPLC分析基本操作,6待基线走稳后，进样分析，采集图谱。7建立数据处理方法，选择峰宽、积分阈值、处理区间、指定最小峰面积和峰高等；处理色谱图，记录色谱信息（色谱峰面积）。8冲洗全部测定完毕后，冲洗色谱柱和管路（调节溶剂洗脱强度从小到大冲洗柱子）。,52,HPLC分析基本操作,9降流速用面板功能或用色谱管理软件调控，流速每次降0.2mL/min，柱压稳定后再降0.2mL/min，降到0.0mL/min为止。10退出工作站，关闭工作站后再关闭计算机。关闭各部件电源。11登记使用记录。,53,仪器使用注意事项,1HPLC分析所用水均需纯化处理，用新鲜二次蒸馏水或蒸馏水经脱离子处理。2流动相需经过滤、脱气后方可使用。样品需经过滤或高速离心后方可进样分析。3做完实验后，反相色谱柱需用甲醇冲洗2030min。若流动相中含盐类或缓冲溶液，应先配制相同比例的无盐流动相冲洗，逐渐变化到95%水溶液冲洗，再逐渐变化到用甲醇冲洗，以保护色谱柱和高压输液泵。,54,HPLC的分类,液固色谱液-液色谱键合相色谱离子交换色谱体积排阻色谱,55,56,HPLC的分类,液-液色谱即分配色谱。固定相是一种机械吸附在载体上的溶剂，流动相是与固定相互不相溶的另一种溶剂。样品分子根据在固定相和流动相之间进行分配的差异情况进行分离。,57,HPLC的分类,键合相色谱吸附分配色谱，液-液色谱进行改进所得的一种色谱方法。固定相是使用一种被化学共价键结合到载体颗粒上的有机固定相，代替在液-液色谱中使用机械涂敷保持的液相。样品分子根据在固定相和流动相之间的分配和吸附的差异情况进行分离。,58,键合相色谱分类,正相色谱反相色谱离子对色谱,59,A正相色谱,（1）基本概念（2）正相色谱分离原理（3）正相色谱的固定相（4）正相色谱的流动相（5）正相色谱的应用,60,（1）基本概念,正相色谱固定相为极性基团，流动相为非极性溶剂。固定相极性大于流动相的一种色谱方法。由于固定相极性大于流动相，这种相对关系正好与液-固色谱法相同，因而这种色谱方法被称为正相色谱法。被共价结合在载体上的固定相，是常见的一级氨基和氰基。,61,（2）正相色谱分离原理,正相色谱法的分离原理与液-固色谱法并不一样，主要根据所分离化合物在固定相及流动相中分配系数的不同进行分离。正相色谱的选择性特点虽然在某些方面与液-固色谱法有相似之处，但是它不适于分离几何异构体，这一点与液-固色谱法显然不同。,62,（3）正相色谱的固定相,正相色谱的固定相最常见的是被共价结合在载体上的一级氨基和氰基，此外还有二醇基、二甲氨基和二氨基。正相色谱常用固定相结构氰基-(CH2)3CN氨基-(CH2)nNH2(n=3or4)二醇-(CH2)3OCH(OH)CH2OH二甲氨基-(CH2)3N(CH3)2二氨基-(CH2)3NH(CH2)2NH2,63,（4）正相色谱的流动相,正相色谱的流动相最常用的是烷烃溶剂。如：正戊烷、正乙烷、正庚烷、环已烷等。流动相的极性越强洗脱能力越强，也就是强溶剂。反之为弱溶液剂。,64,（5）正相色谱的应用,正相色谱适用于分离极性化合物。如：酚类、胺类、多环化合物、染料、炸药、羟基化合物、氨基酸和药物等。这些样品在正乙烷或其它烷烃溶剂中的溶解度很小，在极性溶剂中的溶解度良好。用正相色谱分离可得到较好的效果。在使用正相色谱时一个值得注意的问题是在用氨基作固定相分离糖时，一些还原糖容易与固定相的氨基发生化学反应，产生席夫碱（Schiffsbase)。,65,3)反相色谱,（1）基本概念（2）反相色谱分离原理（3）反相色谱的固定相（4）反相色谱的流动相（5）流动相与固定相之间的关系（6）实验条件对分离的影响（7）反相色谱的特点（8）反相色谱的应用,66,（1）基本概念,反相色谱固定相为非极性基团，流动相为极性溶剂。固定相极性小于流动相的一种色谱方法。由于固定相极性小于流动相，相对关系正好与液-固色谱法相反，因而这种色谱方法被称为反相色谱法。被共价结合在载体上的固定相是一些直链碳氢化合物，如正辛基等。,67,（2）反相色谱分离原理,反相色谱法的分离原理主要根据所分离化合物疏水性不同在固定相上所滞留的时间不同而得到分离。当水中存在非极性溶质时，溶质分子之间的相互作用以及溶质分子与水分子间的相互作用远小于水分子之间的相互作用，因此溶质分子从水中被“挤”了出去，整个系统的熵增加，自由能降低，使得疏水性强的化合物从流动相移出，因而在色谱柱中滞留的时间延长。,68,（3）反相色谱的固定相,反相色谱的固定相中最常见的是被共价结合在硅胶载体上的直链饱和烷烃，其链长短也不同，最长的是18烷基，也是使用得最多的固定相。反相色谱常用的微粒键合相官能团载体颗粒直径十八烷基Zorbax310mm辛烷基Nucleosil100A310mm苯基mporasil7mm二甲硅烷Lichrosorb310mm,69,（4）反相色谱的流动相,反相色谱的流动相最常用的是水、甲醇、乙腈、丙酮、异丙醇、四氢呋喃等。反相色谱流动相中主要组成是水，它的极性和表面张力最高，因此水是一种最弱的流动相，用它洗脱非极性组分时，表现出的滞留时间最长。甲醇和乙腈，是最常用的调节剂，主要在于甲醇和乙腈的紫外切点相对较低，而且粘度较小，以及易于提纯。,70,（5）流动相与固定相之间的关系,注意：缓冲离子不能产生沉淀。溶剂的紫外切点必须小于所使用的检测波长。避免使用卤族离子。pH值。,71,（6）实验条件对分离的影响,温度：反相色谱流动相当为含有机溶剂的水溶液时，粘度较高，最好在较高柱温下操作，以减少粘度，柱温一般可高达50600C，最高可达800C。pH值：对于可离解的组分，改变流动相pH值，可以改变分离的选择性，采用一定pH值的缓冲溶液作流动相，可以抑制组分的离解。减少峰的拖尾。,72,（7）反相色谱的特点,适于分离带有不同疏水基团的化合物。可通过改变溶剂组成和pH，来分离不同极性的化合物。可分离从极性到非极性的宽范围的化合物。,73,（8）反相色谱的应用,可分离极性到非极性的各种化合物。氨基酸、多肽和蛋白质的分离。碱基、核苷和核苷酸的分离。甾体化合物的分离。其它：儿茶酚胺、组胺、糖类、维生素、酶等。,74,4)离子对色谱,（1）基本概念（2）分离原理（3）离子对色谱的分类（4）离子对色谱的应用,75,（1）基本概念,离子对色谱以键合相作为固定相，以含有配对离子的溶剂为流动相的色谱方法。,76,（1）基本概念,一些样品在水溶液中可以离解为带电荷的离子。如果在水溶液中加入另一种带有与分离组分电荷相反的离子，使其成为中性的离子对，可使分离顺利进行。,77,（2）分离原理,（1）离子对形成原理：组分离子配对离子离子对A-水相+B+水相A-B+有机相由于离子对具有疏水性，因而被非极性固定相（即有机相）提取，组分离子的性质不同，它与配对离子形成离子对的能力大小不同，及离子对的疏水性不同，导致各组分在固有定相中滞留时间不同，因而得以分离。,78,（2）分离原理,（1）通过离子键相结合，改变化合物的疏水特性，影响其分配系数，影响其保留行为。（2）通过配对离子的疏水作用可逆地吸附在柱上，产生动态离子交换，影响保留行为。,79,（3）离子对色谱的分类,（1）阳离型配对离子：A亲水性配对离子B疏水性配对离子（2）阴离子型配对离子A亲水性配对离子B疏水性配对离子,80,（4）离子对色谱法的应用,一般原则是亲水性太强以致滞留时间过短的化合物，在分离时可使用疏水性配对离子，以增加滞留时间，达到提高分辨率的目的。对于疏水性太强、滞留时间过长的化合物可以使用亲水性配对离子，以减少滞留时间，并通过选择特性的改变，来提高分辨率。离子对色谱常用于氨基酸、多肽、生物胺及核苷酸等物质的分离。,81,高效液相色谱法分类,离子交换色谱：固定相含有固定的离子基团，如-SO3-，同时含有相反电荷的反离子（如Na+）。这种反离子也以盐的形式存在于流动相（如NaCl）。具有和反离子同样电荷的离子型样品分子（如X-）就可被离子交换剂保留。X+-SO3-Na+Na+-SO3-X+,82,3离子交换色谱法,1基本概念2离子交换色谱的固定相3离子交换色谱的流动相4离子交换色谱的应用,83,1)基本概念,（1）离子交换色谱：以离交换剂为固定相，借助于样品中电离组分对固定在交换剂基体上带相反电荷的离解部位亲和力的不同，使用混合物彼此分离的色谱方法。（2）阴离子交换剂：固定相基团带正电荷，可与阳离子交换（3）阳离子交换剂：固定相基团带负电荷，可与阴离子交换。,84,2)离子交换色谱的固定相,（1）载体：A树脂：容量大，pH范围广，柱效较低，柱温高800C。B硅胶：容量小，pH不能超过7.5。柱效高，常温下分析。,85,2)离子交换色谱的固定相,（2）阴离子交换柱：A弱阴离子交换剂NH2-X（氨基）B强阴离子交换剂NR3-X（胺基）.（3）阳离子交换柱：A强阳离子交换剂SO3H（磺酸基）B弱阳离子交换剂COOH（羧基）.,86,3)离子交换色谱的流动相,（1）改变离子强度：增加缓冲离子强度或在缓冲液中加入其它盐来提高溶剂强度。离子强度大，洗脱能力强。不影响选择性。（2）改变pH：A能影响组分的保留时间。B影响分离的选择性。（3）增加有机溶剂：可改变组分的保留作用。有机溶剂常控制在510%。,87,4)离子交换色谱的应用,用于离解和可离解的物质及某些螯合物的分离，如：核苷酸、各种碱基、核苷、神经氨等。分离糖：寡糖和单糖以及一些醇类：甘露糖醇、木糖醇、以至甲醇、乙醇等。以树脂为载体的离子交换剂“分配作用和排阻作用”比正相色谱分析糖稳定，可得到较高的柱效，但要在高温下进行。,88,HPLC法分类,体积排阻色谱：即凝胶色谱或分子筛色谱。在该方法中，固定相填料是具有一定孔径的多孔物质。太大的分子被排斥在孔外，而小分子则进入大多数孔隙中。因而大分子能很快地通过柱子，而小分子则被填料保留。通常情况下，体积排阻色谱的分离是严格按分子大小进行的。,89,4空间排阻色谱,1)空间排阻色谱的固定相2)空间排阻色谱的流动相3)空间排阻色谱的分离原理4)空间排阻色谱的分类5)空间排阻色谱的特点6)空间排阻色谱的应用,90,1)空间排阻色谱的固定相,又称为凝胶色谱、分子筛色谱。固定相：为多孔凝胶。,91,2)凝胶色谱的流动相,流动相的选择：在排阻色谱中，常用水作为流动相，常用的有机溶剂有醇类、丙酮。流动相不是为了控制分离，而是为了使样品更好地溶解，或为了获得低粘度来提高柱效率。,92,3)空间排阻色谱的分离原理,其原理主要是根据分子的大小和形状对混合物进行分离的方法。,93,4)空间排阻色谱的分类,（1）凝胶过滤：色谱分离过程在水体系中进行。（2）凝胶渗透：色谱分离过程在非水体系中进行。,94,95,5)空间排阻色谱的特点,（1）分离方法容易掌握。无需考虑流动相对分离结果的影响，更没必要使用梯度洗脱。（2）分离条件温和、简单、快速。是蛋白质分析的一个有力工具。（3）可对分离物的分子量进