干细胞分选技术(综述)

干细胞分选技术（综述）引言干细胞是一类具有自我复制和分化潜能的细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞。新近研究表明干细胞可以为临床细胞替代治疗和移植治疗提供新的细胞来源，有广阔应用前景。背景资料干细胞的概念干细胞是指那些具有自我更新能力，在一定的条件下又能产生各种高度分化的子代细胞的增殖性细胞。目前公认的干细胞所应具备的几点主要的细胞生物学特点：（1）具有自我更新能力与自我维持能力，也就是说它可以分裂，分裂后的子细胞与母细胞一样不但能保持其原有的各种细胞生物学特性，而且还可以不断地分裂下去。干细胞一旦形成，在机体内终生都具有自我更新能力，不同于那些具有有限自我更新能力的祖细胞。这对于维持机体组织器官的稳定性有很重要的意义。（2）具有多向分化的能力（多能性或全能性），即可以分化发育成各种胚层组织的细胞（ES细胞），或可以分化成为本系统各谱系的细胞（特定组织干细胞，如造血干细胞）。（3）具有高度增殖能力，在体内干细胞的高度扩增具有非常重要的意义，如造血干细胞通过高度扩增补充由于细胞正常衰老而丧失的细胞；同时由于干细胞虽具有多能性但数量不多，因而只有通过体外扩增才能对其进行研究。因此干细胞高度扩增不但对机体正常功能的维持起着非常重要的作用，而且对干细胞的研究和应用也有着非常重要的作用。（4）既具有生理性的更新能力，也具有对损伤或疾病导致的反应与修复能力，如骨髓间充质干细胞等。（5）干细胞的自我更新与分化需要特定的微环境，即nitches，也就是说干细胞往哪一种方向分化，必须在该细胞生存的特定微环境前提下进行分化。已有诸多的实验表明，如将ES细胞种植入小鼠大脑内，这些干细胞将向神经系统分化。干细胞的分类根据干细胞的来源、发育阶段、分化趋势将它们分为两大类：ES细胞和成体干细胞（或称之为特定组织干细胞，如造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞等）。ES细胞 ES细胞是从附置前早期胚胎内细胞团或附置后胚胎原始生殖细胞分离克隆的一类具有自我更新能力和发育全能性的，并能产生分化后代能力的早期胚胎细胞，包括畸胎瘤干细胞(EC细胞)，ES 细胞,胚胎生殖细胞(EG细胞)。它们的基本特性是具有发育的全能性，能分化为属于外胚层、中胚层和内胚层的各种分化细胞，即具有分化成为机体内任何一部分组织和器官的能力，因而有人称之为“万能”细胞。EC细胞具有恶性生长并显示出类似于胚胎细胞发育全能性或多能性的双重性质，早在20世纪七八十年代，EC细胞常常被用来作为研究哺乳动物发育和遗传的模型，以及作为诱导细胞分化的模型，并且已经成功地诱导出了神经细胞，肌细胞,软骨细胞及上皮细胞等包括( 个胚层在内的各种类型分化细胞。但是EC细胞具有核型异常等恶性肿瘤的特性，难以参与嵌合体胚胎的发育，用它们作为研究正常人体细胞分化的模型并不合适。故在20世纪90年代初期，科学家们从小鼠的早期胚胎的桑葚胚中分离并建立了ES细胞系，并逐渐趋向以大动物如猪,狨等为研究对象，力图解决哺乳动物的细胞分化的模型难题。终于在1998年，人们迎来了梦寐以求的喜讯：美国的威斯康星大学的Thomson等和霍普金斯大学的Gearhart实验小组分别报道用不同材料,不同方法成功地分离并建立具有多向分化潜能和永久生殖能力的ES细胞系和EC细胞系。研究模型的解决，为人类的健康和现代生命科学的发展、研究开创了一个新时期。EG细胞是从人和小鼠的生殖脊分离培养出来的类似于ES细胞的一类具有发育全能性的细胞系。它具有与来自IEM的ES细胞相同的特征，包括细胞的体外分化和产生生殖系嵌合体后代，但它们并非完全一样：首先EG细胞的培养与建系较ES细胞困难，EG细胞所需的培养条件特别是饲养层细胞的培养较ES细胞的培养苛刻得多；其次EG细胞与ES细胞在形态特征上也不同。成体干细胞 成体干细胞也称为特定组织干细胞，是指成体组织中所存在的具有自我更新与产生本系统后继续分化能力的那类细胞，它们在特定的条件下，可以对称地分裂为2个新的子代干细胞或2个功能细胞，也可以不对称地分裂成1个子代干细胞和1个功能干细胞，从而使组织分化成与器官保持生长和衰退的动态平衡。传统的观点曾认为成体干细胞的分化潜能较弱，只能分化成与其组织来源一致的某种特定的组织细胞。然而在某些情况下，干细胞的分化并不遵循这一规律。文献报道在实验中分离出小鼠的肌肉干细胞，经过体外培养5d后，将它与小量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉干细胞会分化成为各种造血干细胞系。这种现象被称为干细胞的可塑性分化。迄今对成体干细胞研究较多的是造血干细胞和骨髓间充质干细胞；其次神经干细胞的研究也较多；以及成肌干细胞和皮肤干细胞。也许是人们渴望找到一种对于神经系统退行性疾病的有效治疗方法，近年来对于神经干细胞的研究颇多也颇深入，并且已经有实验表明神经干细胞的移植可以治愈帕金森病。干细胞的应用随着细胞替代治疗的发展，干细胞移植治疗已成为临床上治疗某些疾病的重要手段，利用干细胞在体外扩增培养并诱导成所需要的细胞后移植入患者体内，用于组织损伤的修复、退行性器官的替代及改善遗传性缺陷组织器官的功能。而成体干细胞可塑性分化的发现，为细胞替代治疗提供了新的种子细胞。干细胞的分离纯化 所谓细胞分离（cell isolation）,指的是将组织分散制成细胞悬液后从中获取目的细胞的过程。而所谓细胞纯化更进一步强调从原代培养前成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。通过细胞的分离和纯化过程，使培养物成为单一类型培养物，甚至是遗传特性完全一致的培养物，后者即细胞系。分离和纯化两个概念之间没有截然的界限，许多情况下，细胞分离和纯化并不是完全彻底的，培养物中只能达到以某种细胞为主的程度，所以也成称为富集(enrichment)。 分离和纯化细胞的过程不仅仅在原代培养之前进行的，有时分离和纯化细胞的过程还贯穿于原代培养和继代培养的过程中，甚至是主要依赖培养过程实现分离和纯化细胞的目的。培养物中细胞成分是否单一或者目的细胞在培养物中的比例如何，常是衡量某一培养工作是否成功的重要指标。 从成分混杂的细胞悬液中将不同的细胞区分开来达到分离纯化，主要是依据不同的细胞具有各种不同的特性来实现的，也可利用细胞的物理特性如密度，体积，电荷等，以及细胞生物学特性如特异的表面标志和功能。一种细胞，其数量稀少又难以识别往往就更不容易被分离纯化。因词虽然已经对造血干细胞的特性了解得比较清楚，但人们仍在努力探索更简单，更快捷的干细胞分离方法，因为通过常规方法富集到的干细胞远不能满足干细胞生物学和调控研究对干细胞数量和纯度的要求。将基于干细胞的物理特性和生物学特性的分离纯化方法相结合，通常可以获得较好的效果，也只有通过合理的综合应用两种以上不同的分离纯化方法，才可能在细胞回收率，细胞纯度及细胞活力等方面达到比较满意的效果。尤其是干细胞在组织中比例极低，也使人们不得不采用多步骤的分离方法，通常每一步骤都采用一种不同的分离参数。例如，在抗体介导的分离技术之前常西安用密度梯度法对目的细胞进行富集。 最初的“预富集”步骤可以看作是减少体积的步骤，纸样可以减少随后分离步骤中世纪的用量。当采用多级分离步骤时，预先估计整个过程中的细胞损失是非常重要的，因为为了获得高纯度的细胞可能会影响到细胞的回收率。细胞分离纯化的常用技术与基本原理解离组织制备细胞悬液 为了分离目的细胞首先必须将目的细胞所在的动物组织材料制备成单细胞悬液。细胞分散一方面是细胞分离纯化的前提；另一方面，在分散细胞的过程中，通过一定的辅助性方法，也能对组织细胞起到一定的分离纯化作用。 机械分离以及酶学分离是组织分散成单细胞最常用的方法。在机械风力方法中，常用的技术包括用吸管或针头吹打，用组织研磨器或注射器研磨，用不锈钢或尼龙筛网搓洗等。其中按照组织内不同细胞的大小差异，亦一定孔径的不锈钢或尼龙筛网过滤细胞起到了对细胞的初步分离纯化目的。在酶学解离的方法中，常用的技术包括用胰蛋白酶消化，用螯合剂处理，永不涵钙镁离子的溶液浸泡等。用酶学方法达到部分分离纯化的主要依据是不同组织细胞和间质的构成不同。例如，欲从皮肤材料中获取上皮细胞，就可利用皮肤的表皮和表皮结缔组织间的细胞间质构成不同的差异，就可先用胰蛋白酶消化这样就可以得到大量的上皮细胞。密度梯度离心技术 利用细胞体积和密度进行分离纯化的技术均基于沉降作用。其基本原理是，在离心力的作用下，细胞在一定介质中的的沉降速率与细胞的体积及细胞密度和其周围介质的密度之差成正比。细胞的体积越大，其余分离介质的密度差越大，则细胞的沉降速率越快。对于特定的待分离细胞来说，其体积和密度是恒定的，可供选择的只是具有一定密度与黏度的分离介质。使之沉降的细胞密度应该比介质大，而使之漂浮的细胞密度应该比介质小。因此实施沉降技术分离细胞的关键在于选择密度梯度形成介质，故称将技术也称为密度梯度离心技术。 逆流淘析分离技术是通过含细胞介质溶液的流力和福利与细胞所受离心力之间相互作用而分离细胞的一种技术。细胞置于一特殊的离心室中，离心室成锥形状，其定点指向沉降方向，细胞悬浮于以向心方向连续流动的介质溶液中，同时受到离心力的作用。当向外的离心力于内向的流立即浮力达到平衡时，每个细胞将按照它的的沉降速率达到其平衡位置。通过这一技术可进一步分离淋巴细胞和单核细胞。选择性细胞凝集 羟乙基淀粉和甲级纤维素可以使红细胞形成大的“钱串”，加速其沉降，从而比其他细胞更快地从造血细胞悬液中沉降出去。这一方法通常用于快速去除大量成熟红细胞，而不会对有核细胞群造成太大的损失。但是，与上面提到的密度梯度离心和逆流淘析步骤一样，这一方法并没有使干细胞群相对于有核细胞发生太多的富集。基于不同粘附特性的细胞分离方法 粘附于某些固相物质如玻璃或塑料的表面，使某些类型细胞的基本生物学特性之一，但另一些细胞却缺乏这种能力；或某些细胞的粘附能力强，粘附作用快，而某些细胞的粘附能力弱或粘附作用慢。根据这些差异，可以分离或消除某些类型的细胞。这种将粘附较快的细胞与粘附较慢的细胞（货物粘附能力）的细胞分离开来并分别收集的处理过程就称为差粘附处理。差速粘附处理常用于分离细胞悬液中的成纤维细胞与其它组织细胞。利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法 单克隆抗体的特异性和多样性是利用不同抗体的合理组合分离不同类型的细胞成为可能。目前抗体介导的细胞分离技术主要有：抗体/补体介导细胞溶解法，流式细胞仪分选法，平面粘附分离法，免疫磁珠分离法等。从抗体介导技术获得细胞的家渡看，又可分为阳性细胞分选法和阴性细胞分选法。拟从混杂细胞群体中获得表达与抗体相应膜抗原的细胞群，称为阳性细胞分选法；反之，拟除去表达与抗体相应膜抗原的细胞，而收集其余的细胞群体，称为阴性细胞分选法。其中上述抗体/补体介导细胞溶解法为阴性细胞分选法，其余3种方法既可以作为阳性细胞分选技术，也可以作为阴性细胞分选技术。免疫溶解法 当补体存在时，用抗细胞某一表面标志的特异性抗体与异质性细胞一起孵育，可以是具有该特异性表面标志的细胞溶解。利用这一原理，将消除细胞的特异性表面标志的抗体和补体加入细胞须阿毕业或细胞培养物中，使抗体及补体作用于具有相应抗原的细胞并溶解之，而对该抗原阴性的细胞进行富集。细胞溶解法适用于细胞悬液或细胞培养物中待消除细胞数量不是很大的情况。流式细胞分选术流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是70年代初发展起来的一项高新技术，综合应用光学、机械学、流体力学、电子计算机、细胞生物学、分子免疫学等学科技术，对高速流动的细胞或亚细胞进行快速定量测定和分析的方法。80年代开始从基础研究发展到临床医学研究及疾病的诊断和治疗监测。流式细胞术是对单个微粒（如细胞、微生物和人工合成微球等）进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号（分别代表荧光、散射光、光吸收或细胞光阻抗），送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flowcytometer）。免疫磁珠分选技术用免疫磁珠做细胞分选(MAC