蛋白相互作用研究技术 教育学习

第五章蛋白相互作用研究技术,1,优质课件,蛋白相互作用是指两个或两个以上蛋白质分子，通过非共价键形成蛋白复合物的过程。蛋白质间相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中。理解蛋白质相互作用的方式、作用程度、作用结果，将有助于蛋白功能分析、发育机制探索、疾病发生机制、药物研发等众多问题的解决。,2,优质课件,3,优质课件,第一节酵母双杂交法,酵母双杂交系统（yeasttwo-hybridsystem）：以酿酒酵母为实验宿主，基于对真核生物调控转录起始过程的认识和报告基因技术的发展而建立，是目前蛋白质相互作用研究的最有力工具。,4,优质课件,一、酵母双杂交系统的建立经典文献出处：FieldsS,SongO.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.Nature,1989,340(6230):245-246.1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述酵母双杂交系统（yeasttwo-hybridsystem）。,5,优质课件,该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。真核生物基于转录需要反式作用因子的参与，真核生物转录因子含有两个不同的结构域：,这两个结构域各具功能，互不影响，单独存在时均没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活因子的功能。,6,优质课件,报告基因(reportergene)：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。,7,优质课件,Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活因子，天然的Gal4分子是由一条由881个氨基酸残基组成的多肽链。两个结构域中的DNA-BD由位于N-末端的147个氨基酸组成，能识别位于Gal4基因的上游激活序列（upstreamactivationsequence,UAS）。AD由位于C端的768-881位多肽构成。他们将Gal4的BD与酵母SNF1融合，将Gal4的AD与酵母SNF4融合，这两个蛋白已知是可以相互作用的。当将两种重组质粒共转化含有Gal4结合位点的报告基因LacZ的酵母菌株后，激活了UAS下游的报告基因LacZ的表达。,8,优质课件,酵母双杂交系统的基础元件：与BD融合的蛋白-诱饵蛋白（bait）与AD融合的蛋白-猎物蛋白或靶蛋白（preyortargetprotein）基因组中整合了报告基因（reportergene）的酵母菌株-LacZ（编码B-半乳糖苷酶）,9,优质课件,（一）酵母双杂交实验原理,用于鉴定蛋白质-蛋白质之间的互作A蛋白（bait），B蛋白（prey），A蛋白和B蛋白可以互作A蛋白融合调节蛋白的DNA结合结构域（BD），B蛋白融合调节蛋白的激活域（AD）启动子带有调节蛋白结合位点的Reportergene在酵母中单独表达任一融合基因，报告基因不表达在酵母中同时表达两个融合基因，报告基因表达,二、酵母双杂交系统的基本原理和用途,10,优质课件,酵母双杂交技术在发展的过程中对报告基因、“诱饵”载体、“猎物”载体等做了很多改进。其中一个重要改进是引入了多个报告基因，如广泛采用的HIS3基因等。目前，大多数酵母双杂交系统往往同时使用2个甚至3个报告基因，但都含有最基本的lacZ基因。这种多重筛选提高了检测的灵敏度并减少了假阳性现象。,11,优质课件,半乳糖苷酶基因,12,优质课件,Mel1：catalyzesthehydrolysisofmelibiosetogalactoseandglucose.Usingp-nitrophenyl-D-galactoside(PNP-Gal),acolorlesscompoundthatyieldsayellowproduct(p-nitrophenol)uponhydrolysis.,13,优质课件,（二）用途一方面可以用于确认两个已知蛋白质的相互作用。另一方面，更重要的是可以从cDNA文库中寻找与已知蛋白质相互作用的未知分子。,该方法的优点：一是具有很高的灵敏度，可以检测到生物化学方法检测不到的相对较弱以及瞬时的蛋白质相互作用；另一个优点是在酵母的体内环境中进行分析，更接近天然状态。,14,优质课件,三、酵母双杂交基本实验步骤,1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。,15,优质课件,16,优质课件,四、酵母双杂交系统存在的缺陷及相应对策,核内作用融合蛋白必须转至核内才能活化转录。这是影响双杂交系统进一步推广的主要障碍。对于胞外受体配体作用。以及需要核外加工修饰等翻译后介导的蛋白质作用而言，该系统应用受到限制。一般而言，膜蛋白也不适于此，已出现通过改变某些细胞膜定位序列，在载体中添加核定位信号序列的方法以及专门研究非核内蛋白作用的统。,17,优质课件,假阳性,指诱饵和靶蛋白在没有发生作用的情况下，报告基因被激活进行文库筛选时，这是最常见的干扰实验准确性的问题。,18,优质课件,产生假阳性的可能原因,(1)靶蛋白本身含转录活化成分(如可结合报告基因上游DNA)，即prey-AD自身可激活报告基因转录。(2)诱饵蛋白本身有激活作用。对以上情况，可通过严格对照实验，排除假阳性；或对诱饵和靶蛋白分别作单独活性检测。,19,优质课件,(3)prey-AD对bait-BD无特异性，与无关的DNA结合域杂交体共转化酵母亦表现阳性。在筛出阳性克隆后，将Prey-AD与无关DNA结合域杂交体作共转化酵母测试。以排除假阳性。Harper采取一种快速鉴别假阳性的方法：用选择性培养基去除阳性克隆的bait-BD质粒，只剩prey-AD质粒，与不同性别的含无关DNA结合域杂交体的酵母交配，以二倍体酵母是否表现阳性来鉴别假阳性。省去了回收质粒共转化酵母的烦琐步骤。,20,优质课件,(4)由于未被发现的调控途径激活报告基因，这种假阳性需用其它实验排除。(5)假阳性也可能是双杂交设计的原因:cDNA文库的构建中，如使用随机引物，可能使蛋白中一些非暴露区域暴露，并被筛选出来；一对不在同一时间、同一种组织表达的蛋白可能发生作用，而不是生理意义上的作用。,21,优质课件,假阴性,两个蛋白之间本应发生相互作用但报告基因不表达或表达程度低检测不到。常见原因：(1)融合蛋白对细胞有毒性。这时，应选敏感性低的菌株或拷贝数低的载体；采取共转化的方法也可以降低毒性。(2)若蛋白间相互作用效果弱，则应选高敏感菌株或高拷贝载体。,22,优质课件,转化率,如何提高转化率是文库筛选成败的关键，尤其是低丰度cDNA文库筛选，必须提高转化率。(1)共转化较依次转化省时省力，并可减弱或消除融合表达蛋白对酵母毒性。,23,优质课件,(2)酵母两性接合是更为有效的方法。将诱饵蛋白载体与靶蛋白载体分别转入不同接合型单倍体酵母中再杂交。将诱饵蛋白与靶蛋白带入同一二倍体细胞中。(3)构建文库也非常重要，体内重组技术成功率高。,24,优质课件,第二节标签融合蛋白结合实验,25,优质课件,原理,标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和层析原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。该方法利用一种带有特定蛋白序列标签（tag）的纯化融合蛋白作为钓饵，在体外与待检测的纯化蛋白质温育，然后用可结合蛋白标签的琼脂糖珠将融合蛋白沉淀回收，洗脱液经电泳分离并染色。如果两种蛋白质有直接的结合，待测蛋白质将与融合蛋白同时被琼脂糖珠沉淀（pull-down），在电泳胶中可见到相应的条带。目前最常用的标签是GST，有各种商品化的载体用于构建GST融合基因，并在大肠杆菌中表达为GST融合蛋白。利用GST与还原型谷胱甘肽（glutathione）的结合作用，可以用共价偶联了还原型谷胱甘肽的琼脂糖珠一步纯化GST融合蛋白。另一个常用的标签是His标签。,26,优质课件,27,优质课件,优点：1.灵敏度高。可以检测到生化方法检测不到的较弱的蛋白相互作用。2.实验材料比较容易获得。实验周期短。3.可以排除其他蛋白的干扰。反映出蛋白间直接的相互作用。用途：1.证明一对蛋白质分子是否存在直接物理结合。2.分析一对相互作用蛋白间相互作用结构域。3.用已知蛋白作为钓饵，筛选细胞内与之结合的未知蛋白。,28,优质课件,用该法检测到的互作蛋白，其丰度往往很低，因此可以用抗体进行检测，当进行筛选时，可以进行银染，之后切下条带进行质谱检测。,29,优质课件,局限：高等生物的蛋白要求正确的翻译后修饰，因此，GST融合蛋白在大肠杆菌中的折叠和修饰往往不能反映其在天然环境中的状况，检测到的蛋白相互作用也不能充分说明在天然环境中的状况，还需要其他实验相互验证。但可以采用真核表达系统，如昆虫细胞表达系统等，弥补以上缺陷。,30,优质课件,常见问题及其解决1.不能有效纯化融合蛋白。2.检测不到特异性相互作用的目的蛋白条带。3.背景过高。4.标签对融合蛋白空间结构的影响。应用特殊的亲和层析系统，如串联亲和层析（tandemaffinitypurification，TAP），也是一个值得注意的趋势，该系统可增加对互作蛋白的纯化能力，加上质谱技术的应用，成为在细胞内进行蛋白复合物筛选的有力手段。,31,优质课件,第三节免疫共沉淀,免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,co-IP）：以抗体与抗原间的特异性结合为基础，用于测定蛋白质相互作用，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理相互作用的有效方法。,32,优质课件,原理：在保持蛋白相互作用条件下裂解细胞，在裂解液中加入已知蛋白的抗体，孵育后加入可与抗体结合的蛋白A/G-琼脂糖珠沉淀抗原抗体复合物，若细胞中有与已知蛋白互作的蛋白，就可以与上面的复合物一起被沉淀下来，经SDS-PAGE后，复合物可被分离，再经免疫印迹或质谱鉴定出互作蛋白。,33,优质课件,这种方法常用于测定两种蛋白质是否在体内结合，常使用针对这两种蛋白的抗体分别进行co-IP，以相互验证，与质谱技术结合，也可用于确定与特定蛋白结合的未知蛋白。,34,优质课件,优点：1.得到的蛋白质相互作用是在细胞内天然形成的，反应的是细胞的生理状态。2.可以得到天然状态的蛋白复合物。缺点：1.可能检测不到低亲和力和瞬时蛋白相互作用。2.不能证明两种蛋白质的直接结合，其他分子可能起到桥梁作用。3.依赖于高质量的可用于免疫沉淀的特异性抗体。,35,优质课件,常见问题1.细胞裂解液的选择。2.抑制剂的选择。3.细胞裂解操作。4.抗体的选择和使用。,36,优质课件,第四节物理学方法研究蛋白质相互作用,生物化学方法只能在裂解液中进行，无法做到在活细胞生理条件下实时动态观察蛋白间相互作用。而一些物理学方法在一定程度上改变了这一状态。,37,优质课件,一、荧光共振能量转移技术Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET，实现了单个活细胞蛋白质相互作用的在体实时动态的连续观察。,38,优质课件,荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。在生命科学领域，FRET技术是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。正如前述，当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在10nm范围以内时，就会产生FRET现象。而在生物体内，如果两个蛋白质分子的距离在10nm之内，一般认为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。,39,优质课件,青色荧光蛋白（cyanfluorescentprotein,CFP）、黄色荧光蛋白（yellowfluorescentprotein,YFP）为目前蛋白-蛋白相互作用研究中最广泛应用的FRET对。CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱相重叠。将供体蛋白CFP和受体蛋白YFP分别与两种目的蛋白融合表达。当两个融合蛋白之间的距离在5-10nm的范围内，则供体CFP发出的荧光可被YFP吸收，并激发YFP发出黄色荧光，此时通过测量CFP荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。两个蛋白距离越近，CFP所发出的荧光被YFP接收的量就越多，检测器所接收到的荧光就越少。,40,优质课件,41,优质课件,该技术可以用于：1.研究细胞内两种蛋白质间的相互作用，与基因突变和转染结合，可以分析这种相互作用所依赖的结构。2.研究膜受体的组装。3.实时分析酶活性。作为用于FRET的载体表达产物所提供的光学特性需满足以下条件：1.供、受体的激发光谱要分得足够开；2.供体的发射光谱与受体的激发光谱要有重叠；3.供、受体的发射光谱不能重叠。,42,优质课件,二、共振光散射技术和表面等离子共振技术Surfaceplasmonresonance,SPR是通过检测相互作用分子表面折射光系数的变化