正葡萄糖钳夹实验PPT课件.ppt

.,1,口服胰岛素肠溶胶囊的药代动力学与药效动力学研究实验,.,2,一、高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术,.,3,（一）、历史背景1966年Andres等根据葡萄糖一胰岛素的负反馈原理，创立了一种可定量分析胰岛素分泌及作用的方法葡萄糖钳夹技术。1979年DeFronzo等对该技术从理论上作了详细的阐述，并给予技术指导，推动了世界范围的广泛应用。萄糖钳夹技术根据研究目的的不同又划分为高糖钳、正糖钳及低糖钳等不同方法。（二）、技术原理1、葡萄糖一胰岛素负反馈体系血糖升高时，胰岛素分泌增加，并通过增加摄取、储存和利用葡萄糖等方式，下调血糖；血糖下降，胰岛素分泌降低，胰高血糖素等升糖激素增加，促进代谢分解，加速糖原分解和葡萄糖异生作用，升高血糖。,.,4,2、钳夹技术原理正糖钳技术通过同时输注可控浓度及速率的外源性胰岛素和葡萄糖，打破体内葡萄糖一胰岛素的负反馈调控，使血浆外源性胰岛素维持在较高浓度水平，而血糖维持在基础稳态水平。由于血浆外源性胰岛素的优势浓度，抑制了内源性葡萄糖(肝糖分解和糖异生)和内源性胰岛素分泌，此时外源性葡萄糖输注速率等于外周组织的葡萄糖利用率，从而评价葡萄糖、胰岛素以及其他相关物质的代谢过程。,.,5,（三）、特点1、避免了内源性胰岛素缺乏(如糖尿病患者)及低血糖(如胰岛素耐量试验中)对胰岛素敏感性测定的影响。2、将内源性干扰减至最小，增加了实验的可控性与准确性，降低了结果的变异性。（四）、缺点1、不同受试者的应激反应和血管紧张度等诸多因素会对稳态的建立产生一定的影响。2、该技术复杂耗时、费用昂贵，实验中需频繁取血。（五）、实验方法1、建立静脉输液通道及采血通道在前臂静脉或正中静脉穿刺并留置导管建立输液通道，用于输入胰岛素和葡萄糖溶液。葡萄糖和胰岛素输注通道经三通管与静脉通道联接。采血通道由输液器、三通管、带延长的三通管、静脉留置针依次串连在一起，2个三通管的侧孔分别接上注射器，并保持管道通畅。,.,6,2、钳夹实验试验前比格犬禁食12h，试验时用巴甫洛夫吊带将比格犬固定于实验台上。在动物一侧前肢建立静脉通道，该通道连接三通管，一端连接胰岛素注射泵，一端连接葡萄糖输注泵。钳夹开始后10min内以较快的速度输注胰岛素，以使血胰岛素水平快速升高，而后以较低的速度持续输注维持一定血胰岛素浓度。在静脉通道对侧前肢取血测量血糖，每隔5min取血测量血糖一次，通过调节葡萄糖输注率以维持血糖水平恒定。经一段时间后、血糖恒定维持于平衡状态。给胰岛素制剂后,葡萄糖输注率随着胰岛素产生的作用变化，以此来评价胰岛素制剂的药效动力学特征。,.,7,3、正糖钳技术指标钳夹稳定状态下血糖(SSPG)：SSPG需控制在正常空腹血糖10范围内。钳夹稳定状态下胰岛素(SSINS)：较高的血浆外源性胰岛素水平才能抑制内源性肝糖及胰岛素的生成，满足实验要求。血糖变异系数(CVBG)：钳夹实验期间CVBG可反映钳夹技术的稳定性与准确性。稳态葡萄糖输注速率(SSGIR)：SSGIR等于外周组织的葡萄糖利用率，可用来评价外周组织(主要是肌肉组织)胰岛素作用，反映机体组织的胰岛素敏感性。内源性胰岛素分泌：c肽水平可评估内源性胰岛素分泌，粗略判断内源性胰岛素分泌的抑制程度。,.,8,二、RIA方法测定血清样品中胰岛素抗原浓度,.,9,（一）原理将一定量的胰岛素标记示踪物和待测样品混合，加入猪胰岛素抗体,通过标记示踪物和待测样品与抗体的特异性竞争结合。加入沉淀剂后,与抗体结合的标记示踪物在沉淀中，结合的标记示踪物与待测胰岛素样品的量成反比。计数仪计数越高，对应的胰岛素样品的浓度越低。（二）实验方法1、采样各组动物于给予胰岛素制剂前及给药后每隔30min取血,直至钳夹结束。全部血样均于凝固后离心获得血清，血清样品于-20保存。采用RIA方法检测其中的猪胰岛素抗原浓度，用于胰岛素血清药代动力学的计算。,.,10,2、测定NSB管(非特异性结合管)加300ml分析液，Bo管(参比管)加200ml分析液，其他管加100ml分析液。在其它分析管中加100oL标准品、质控样品或待测血清样品，各管加入100l125I-Insulin，然后各管(除Totalcounttubes与NSB管)加入100ml猪胰岛素抗体，混合均匀，封闭，4oC过夜。20小时以后各管加1ml的冷冻沉淀剂，涡旋，孵育20min，4oC。离心30min，立即倾出上清，于计数仪上计数各管。各批分别设置猪胰岛素标准校正曲线，用以计算该批所测未知样品浓度。,.,11,（三）结果计算用MicroCal公司Origin5.0对浓度对数和各管放射计数与总计数的比值对数绘制标准曲线，四参数Logistic拟合：,（四）PKPD参数的计算和统计分析用MierosoftExee1XP软件采用统计矩方法计算各药效动力学与药代动力学参数。PK或PD曲线下面积用梯形法进行计算。达峰时间与峰浓度均为实测值。比格大自身交叉对照组数据比较用StudentS配对t一检验法进行统计判断,其它处理组组间t一检验进行统计学判断。用Origin软件对实验结果进行线性回归求回归方程及相关统计参数，并作图。,.,12,三、相关分析技术,.,13,（一）放射免疫分析(RIA)方法放射免疫技术为一种将放射性同位素测量的高度灵敏性、精确性和抗原抗体反应的特异性相结合的体外测定超微量物质的新技术。应用放射性同位素标记的抗原或抗体，通过免疫反应测定的技术，都可称为放射免疫技术，经典的放射免疫技术是标记抗原与未标抗原竞争有限量的抗体，然后通过测定标记抗原抗体复合物中放射性强度的改变，测定出未标记抗原量。它可以分为两类：竞争性RIA和非竞争性RIA，也称为免疫放射分析。,.,14,（二）统计矩方法1、应用药物动力学研究的统计矩分析，是一种非隔室的分析方法，它不需要对药物设定专门的隔室，也不必考虑药物的体内隔室模型特征。2、目前这种分析方法主要适用于体内过程符合线性动力学的药物。