实用流式细胞技术及其样品处理PPT课件

.,实用流式细胞技术及其样品处理,FACSAria(FACSDiva),.,流式细胞术基本原理在不同领域的应用样品及其前处理,.,一、流式细胞术基本原理,.,最大特点：单细胞水平的分析,.,Detector,单细胞液流柱的形成,.,利用流式细胞术可以获得哪些信息,细胞的相对计数、绝对计数细胞成分的相对定量、绝对定量单参数或多参数细胞表面、细胞内成分可溶性成分流式分子表型,.,流式细胞术可以产生哪些信号,细胞的物理参数：散射光,细胞的理化参数：荧光,.,散射光信号,前向角散射（FSC）：与球形细胞直径的平方密切相关。侧向角散射（SSC）：对细胞膜、细胞质的折射率敏感。对细胞质内较大的颗粒也有反映。用来获取有关细胞内部精细结构和颗粒性质的有关信息。,.,.,Laser,FSC,SSC,Monocyte,Lymphocyte,Granulocyte,FSC,SSC,.,荧光信号,.,单标样品,.,Laser,42%positiveAntigenA,58%negativeAntigenA,FL2,FSC,.,双标样品,.,Laser,Logfluorescence(green),Logfluorescence(red),A+(%),B+(%),A+B+(%),neg.(%),FSC,FL1,FL2,.,Histogram,DotPlot,ContourPlot,Pseudo3-dimensionPlot,3-dimensionPlot,Unimodalorbimodal,.,道数（channel）荧光强度坐标不等距,.,“Particle”canbeusedasamoregeneraltermforanyoftheobjectsflowingthroughaflowcytometer.“Event”isanythingthathasbeeninterpretedbytheinstrument,tobeasingleparticle,correctlyorincorrectly.Eachmeasurementfromeachdetectorisreferredtoasa“parameter”.Dataarestoredinso-calledflowcytometrystandard(FCS)format.Datastoredononecytometermaynotbeanalyzableonsoftwarefromanothercytometer.,.,细胞分选,.,分选纯度分选产率,.,.,厂家、型号、激光器、滤光片、软件,.,.,.,.,460500540,460500540,460500540,SP500,LP500,BP500/50,LongpassShortpassBandpass,滤光片,.,二、在不同领域的应用,.,细胞周期分析细胞功能分析细胞凋亡分析免疫学领域其他领域,.,（一）细胞周期分析,.,.,CellularDNAcontent,必须用RNase去除RNA,.,DNA合成-BrdUIncorporation,.,增殖细胞核抗原（Proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）:参与DNA复制和核酸的切补修复（excisionrepair）的一种蛋白增殖相关抗原（proliferationrelatedantigen）：Ki-67，Ki-S1细胞周期蛋白：CyclinD1,E,A,B1,.,（二）细胞功能分析,细胞活性分析细胞膜电位线粒体膜电位、膜蛋白抗原7A6细胞内Ca2+胞浆内pH活性氧（ROS）,.,1、细胞活性分析,根据对细胞膜的渗透性不同来区分活/死/凋亡细胞：PI，EB，7-AADandHoechst33342,.,2、细胞膜电位,由于细胞膜上各种泵的作用，如钠钾泵、钙泵等，使细胞膜内外维持着不同离子的浓度梯度，造成细胞膜电位,.,3、线粒体膜电位（MMP）,线粒体在呼吸氧化过程中，将所产生的能量以电化学位能储存于线粒体内膜。JC-1可进入细胞内，特异地与线粒体内膜结合，其聚集程度随MMP升高而增加。,.,4、线粒体膜蛋白抗原7A6（38kDa）,凋亡早期的反应，早于形态学、光学特征变化及台盼蓝染色,.,5、细胞内Ca2+,浓度上升，与两种情况有关。一是与细胞活化，二是细胞膜完整性遭到破坏，可作为细胞凋亡或坏死的标志。,.,6、胞浆内pH,活细胞内pH变化范围较小。某些生物学过程，如细胞分裂及对细胞信号的应答，会出现pHi的变化。增殖细胞比静止期细胞偏碱性。,.,7、活性氧（ROS）参与细胞生长、发育、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。,DCFH-DA本身没有荧光，在细胞内转化成DCFH。在ROS作用下，氧化为绿色荧光物质DCF。其荧光强度与细胞内ROS水平成正比。,.,（三）细胞凋亡分析,.,.,1、散射光信号的变化,.,2.DNA含量,.,3、磷脂酰丝氨酸外翻（Phospholipidredistribution）,.,4、Caspases-3的激活,.,凋亡晚期，核酸内切酶活化，双链DNA会出现许多不对称断裂点，产生一系列的3末端。TdT酶能够催化外源性荧光素-dUTP连接到DNA的3末端。尽管坏死细胞的细胞核DNA也在降解，末端也增多。但这种随机的降解所产生的末端较难与荧光素-dUTP结合。因而，坏死的细胞进行TUNEL反应观察不到荧光。,5.TUNEL,.,.,6.p53,53kDa的核内磷蛋白，在细胞周期中，控制着细胞在DNA损伤无法修复时启动细胞的“自杀”过程。P53突变或缺失是多种肿瘤发生的重要原因。,.,（四）在免疫学领域的应用,.,.,NK细胞中有CD8+细胞;少量的单核细胞也能表达CD4;结合淋巴细胞绝对数来看待某一亚群百分比的改变。,1、淋巴细胞亚群分析,评价机体的免疫状态：自身免疫、免疫缺陷等,.,.,Nave/MemoryTlymphocyte,刚从胸腺移出到外周循环的Naive细胞，首次遇到抗原时，增殖反应强，产生细胞因子能力弱。当Memory细胞遇到同类抗原时，产生大量的细胞因子，而不是增殖反应。NaiveT细胞高表达CD45RAhi、CD62Lhi。MemoryT细胞表达CD45RO，一般不表达CD45RA从Naive向Memory细胞转化过程中，CD11a表达增加、CD62L（L-selectin）表达丢失。,.,Th1/Th2lymphocyte,T细胞根据其分泌的细胞因子分为两型。Th1类细胞分泌IL-2,IFN-和TNF-，参与细胞免疫，对抗胞内病原体，如病毒；Th2类细胞分泌IL-4、IL-5、IL-10与IL-13,参与体液免疫，对抗胞外感染，如寄生虫。,.,Mouse,.,chicken（42d）,.,chicken（42d）,.,2、细胞表面活化抗原的表达,.,.,3、细胞因子分析,.,CBA（CytometricBeadsAssay）分析液体样本中可溶性成分,用一系列荧光强度不同的微球同时分析样本中多种可溶性成分。每种微球大小一致，分别包被有适合于特定分析的特异性抗体。所有分析只需一组标准曲线，检测的线性范围宽（0-5000pg/ml）,captureAb,FluroescentdetectionAb,.,.,HumanTh1/Th2CytokineCBA,.,细胞膜表面的细胞因子分析,.,.,将细胞表达的细胞因子阻断在细胞内,.,.,CESEstainingcellprotein,4、细胞分裂,.,PKHlipophilic(亲脂性)dyethatinsertsintothelipidbilayeroftheoutermembrane.,.,通过分析，可以计算分化前体频率（precursorfrequency）,.,评价细胞杀伤过程的生物学变化：如效应细胞的凋亡，CTL介导的裂解功能的抑制。,5、CTL功能分析,FluorogenicCaspaseSubstrates检测CTL介导的靶细胞凋亡,.,Intheuncleavedsubstrates,fluorescenceisquenchedowingtotheformationofintramolecularexcitonicdimers.,Oncleavageofthepeptidesbyspecificcaspases,thefluorophorefluorophoreinteractionisabolished,leadingtoanincreaseinfluoresence.,.,只要合成各种特异性抗原，即可定量体内抗原特异性CTL。,6、抗原特异性T淋巴细胞的分析,.,其他领域的应用,.,具有细胞壁的细胞及其细胞壁的主要成分：植物细胞（纤维素）、细菌（肽聚糖）、真菌（几丁质）细菌的大小、质量、核苷酸和蛋白含量等大约是哺乳动物细胞的1/1000。信号强度低，限制了检测的精确度。细菌吸收和排除染料、药物等受细胞壁结构和孔、泵的影响。,G+：一般不需要额外的处理，便可以吸收大量的试剂。也有例外，如：Walberg等发现，吸入不同的核苷酸染料，也有不同的变化。G-：细胞膜排斥多数亲脂性或疏水分子，如cyanine染料。EDTA等破膜后，可使亲脂性化合物穿透细胞膜，但是，破膜后的特性与自然状态不同。,.,X4550，X4550(pVAX1-trc-DsRed)，X4550(p3334-DsRed),X6212(p3334-DsRed)，Xa(pVAX1-trc-DsRed),DsRed在不同重组菌中的表达,.,体外细菌感染效率,.,病毒感染细胞的检测,.,流式分子表型（Molecularphenotyping）,FCM-PCR-FISH：细胞中HIV特异性DNA或RNA,如：测定端粒长度,.,三、样品及其前处理,.,颗粒：细胞单细胞悬液，避免任何细胞沉积荧光标记仪器的限制：激光器、滤光片-荧光素实验的限制：荧光素组合,总的要求,.,1、细胞大小,所有的细胞均需要经过过滤：200（75m）-300（45m）-400（37m）目,.,2、细胞物理参数的变化,不同的处理和固定方法也可能造成FSC信号的改变。另外，非球形细胞（禽类红细胞）由于其在液流中空间取向不同，也可能导致对同种细胞的FSC信号完全不同。在可能的情况下，尽量用荧光参数来设门。,.,3、设门,散射光设门：注意细胞形态的变化,荧光设门：要明显区分阴、阳性细胞,.,4、荧光补偿,.,需要用单标样品来调节荧光补偿,.,5、红细胞的影响,溶血：不影响表面抗原的标记，常用标记后溶血,.,6、洗涤效果,.,7、标记效果,.,胞内抗原（IC：同型对照）,表面抗原（标记荧光和自发荧光）,改变抗体的量是改变浓度而不是体积,lessthanorequalto0.5gpermillioncellsina100vltotalstainingvolume,.,避光标记同一实验尽量用同厂家、同批次高质量抗体。按照说明，标记试剂一般不能冻存慎用未经FCM鉴定的抗体首选直标，间标有时效果不好,.,8、实验对照的设计,空白对照阴性对照：常用同型对照单色分析：同型对照多色分析：同型对照、单阳性对照同型对照：与抗体相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同亚型的免疫球蛋白，用于检测由于抗体非特异性结合而产生的背景染色。阳性对照：检测阴性时Fc受体的阻断：与抗体匹配的动物的血清或IgG。,.,9、细胞数量,统计学意义计数：106数量级/0.1-0.5ml非常规检测的样品，调节参数需要消耗一些细胞需要分析的细胞至少要大于500个。DNA分析的样品要大于10000个。,.,荧光强度与结合位点数量成正比（可用百分数和荧光强度表示）,10、单个细胞成分的定量,.,DCFH染色检测活性氧的产生（多用荧光强度表示）,.,11、仪器每次开机的状态都会有一些差异，每次处理的样品也会有所不同，仅有细微差别的实验要在同一次实验过程中完成。,CMF-DA标记检测细胞内酶的活性,.,12、检测速度,通过改变液流的直径来改变检测速度，液流流速不变。,.,默认为一个细胞荧光强度升高对于细微差别的比较，结果影响较大DNA样品可用双联体辨别模式（DDM）区分,13、样品中的细胞聚集和碎片要尽量少,.,Time,Voltage,Time,Voltage,根据细胞通过激光照射点的时间，将光信号成比例的转变成电信号,.,.,14、细胞的活性,抗凝剂：肝素避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制钙依赖性激活过程。PI排除死细胞,.,15、弱表达抗原常选用PE标记,CD8:PerCPAPCFITCECDPC5PE,.,16、胞内染色,.,胞膜和胞内同时表达的抗原:分别作表面和胞浆内染色。在检测胞浆内抗原时，表面表达必须被控制或视为阴性。固定破膜不能影响抗原属性或抗原抗体结合率。先固定后染色可能会使表面抗原丢失或改变。固定：蛋白的交联和变性。破膜：细胞膜穿孔。1皂甙同时测定表面、胞内Ag和DNA含量：膜胞内DNA。膜抗体荧光素不被破膜剂损坏，对胞内抗体，要保证荧光素分子足够小，能进入胞内。,.,17、DNA分析,RNA酶处理前后的比较,.,18、酵母菌的自发荧光,.,19、细胞分选,鞘液的高压蒸汽消毒地面、桌面的清洁消毒室内紫外消