【毕业学位论文】交链孢菌激活蛋白激发水稻的应答基因与抗病性分析博士论文

中国农业科学院博士学位论文 目录 论文编号 中国农业科学院 博士学位论文 交链孢菌激活蛋白激发水稻的应答基因与抗病性分析 士 研究生： 赵 利 辉 指 导 教 师： 邱 德 文 研究员 专 业： 生化与分子生物学 研 究 方 向： 药物工程 中国农业科学院 提交时间 2006 年 6 月 研究生院 植物保护研究所 中国农业科学院博士学位论文 目录 2006 中国农业科学院博士学位论文 目录 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在 导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中国农业科学院或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 （保密的学位论文在解密后应遵守此协议） 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 中国农业科学院博士学位论文 目录 学位论文是国家“863”计划（项目编号：2003国家“973”计划自然科学基金（项目编号： 2003部分内容。中国农业科学院博士学位论文 目录 激发子作为一类对病原菌无直接毒杀作用却可诱导植物产生多重防御反应的化合物， 在植物病虫害生物防治中具有重要应用前景。本研究选用我室从交链孢菌（ 中分离纯化出具有促进植物生长、提高植物抗病防虫性能的蛋白激发子，就其诱导抗性的作用机理及差异表达基因进行了系列研究： 1）检测了交链孢菌激活蛋白在诱发水稻幼苗对稻瘟菌抗性中的作用，测定抗性形成过程中两种重要的活性氧 测定交链孢菌激活蛋白对水稻抗病信号途径关键基因转录水平的影响。结果表明，水稻幼苗经 2 g 5d 后叶片的稻瘟菌病情指数和平均每叶病斑数开始显著降低， 14d 时对稻瘟菌的诱抗效果最为明显。 在激活蛋白处理后的前 5d 7d 后明显下降。2现出先升后降的时序变化趋势。抗病防御相关酶 别于处理后第 7、 5、 9d 活性达到高峰。 2 g d 后使水稻幼苗抗病相关基因 录活性增强， 3 d 后使 转录受到抑制，但不影响 转录。暗示 种信号分子协同参与了交链孢菌激活蛋白诱导水稻幼苗对稻瘟菌的抗性过程。 2）从水稻 库中随机挑取 10 000 个基因，采用 片鉴定交链孢菌激活蛋白引起水稻幼苗基因表达的变化，半定量 交对 10 个表达增强的抗病防御和信号转导相关基因表达进行了验证。 2 g d 后， 136 个基因的表达显著增强， 93 个基因的表达明显受到抑制。此 229 个差异表达基因中， 15 个基因可能参与了信号转导， 13 个基因参与了抗病防御过程， 117 个基因是功能不明的新基因，另外的基因则分别参与了转录调控、细胞生长与分裂、细胞内转运、细胞结构、蛋白质合成、加工与储藏、基础代谢、次级代谢和能量利用等过程。其中交链孢菌激活蛋白诱导了细胞色素节蛋白 坏血酸过氧化物酶、 录因子、 录因子、丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶、酪氨酸磷酸酶、胞质磷酸二脂酶、硫代硫酸硫转移酶等参与抗病防御和信号转导的基因的表达。半定量 10 个表达增强的抗病防御和信号转导相关基因（依次命名为 达进行的验证表明，除一个基因表达与对照差异不显著和一个基因的表达受抑制外，其余均与 片结果相符。 析验证两个差异表达基因 表达模式，结果表现出与 片和 果良好的一致性。 3） 采用 水稻叶片 扩增到 12631530 因。其中， 码 420 子量为 47.2 蛋白，与许多已知 有较高同源性。 码 509子量为 蛋白，与许多已知 有较高同源性。将 建到原核表达载体 , 转化大肠杆菌 主菌 , 经 0.5 导 4 h 后， 中国农业科学院博士学位论文 目录 3 83置出现特异性蛋白质条带，表明实现了目标融合蛋白质的高效表达。 4）为了了解差异表达基因 和 抗病性中的作用，我们研究了抗病性不同的水稻品种中两个基因对交链孢菌激活蛋白响应的差异，并分别获得转 基因烟草，检测转基因烟草植株中防御相关基因 表达和烟草叶片对抗性。 交检测发现， 1312（稻瘟病抗性品系）和原丰早（稻瘟病敏感品系）中 表达丰度均较高， 表达丰度相对较低，交链孢菌激活蛋白处理明显诱导了抗性品系中两个基因的表达，而敏感品系基因的表达影响不大，推测不同品种间蛋白激酶对激发子响应的差异可能是决定不同品种稻瘟菌抗性差异的原因之一。将 别构建到植物表达载体 ，采用农杆菌介导的转化法转化烟草叶盘， 测显示成功获得转 因烟草， 杂交证实目的基因在转化植株中获得稳定表达， 转 因的烟草中几丁质酶基因的转录水平均明显高于非转基因植株，过量表达 烟草叶片的斑数分别比非转基因对照降低了 表明 和 基因可能均参与了植物的抗病防御过程。 关键词： 交链孢菌激活蛋白；抗病防御； 应答基因；蛋白激酶 中国农业科学院博士学位论文 目录 no to in of A of an of a to of 2in th of OS in in of 1,3in in a at a on 5th th to of st no on of to of a of in In to a of we 0, 000 In g 136 3 Of 29 15 in 13 to 17 in in et of as 450, et CR 0 in to at as is in an in of of 中国农业科学院博士学位论文 目录 NA to 20a wt 7.2 a pI as to 09a wt a pI a .5 To of in to in 312 by of MV in On we of in 312 in a 312 of to in of in to in in On we to in of in in MV 2.5 of in to be in of 中国农业科学院博士学位论文 目录 录 中文摘要 .文摘要 .一章 文献综述 发子概述 1 激发子的定义 1 激发子分类 . 激发子诱导的系统性获得抗性 .发子在系统性获得抗性中诱导发生的早期事件 6 合蛋白的激活 .7 离子流和 号传导 . 胞外碱化和胞质酸化 .9 活性氧猝发 .9 蛋白质磷酸化和去磷酸化 .10 1,4,5O 的快速产生 .10 防御基因的表达 .11 病程相关蛋白和次生代谢物积累 .12 发子诱导的系统性获得抗性中的信号转导途径 14 号转导 . 号转导 .16 乙烯信号转导 .17 抗病信号转导途径间的交叉作用 . 多条信号途径经转录因子的整合 .19 信号组分通过蛋白质磷酸化和去磷酸化连结 .21 病防御和信号转导相关基因在抗病基因工程中应用 .22 干扰治病机理的策略 .22 利用抗病基因和过敏反应的策略 . 利用信号转导途径的基因工程 .究背景和意义 .验设计 .二章 交链孢菌激活蛋白诱发水稻幼苗对稻瘟菌的抗性 .料与方法 27 材料 .27 化学试剂与药品 .27 交链孢菌激活蛋白的制备与纯化 . 稻瘟菌孢子悬浮液的制备 . 水稻处理 . .国农业科学院博士学位论文 目录 丁质酶活性测定 28 基因表达水平的检测 .果与分析 30 交链孢菌激活蛋白对 30 交链孢菌激活蛋白对 . 交链孢菌激活蛋白对 活性的影响 . 交链孢菌激活蛋白对 . 交链孢菌激活蛋白对几丁质酶活性的影响 .32 交链孢菌激活蛋白对水稻幼苗抗稻瘟病的影响 . 交链孢菌激活蛋白对抗病信号转导途径关键组分转录水平的影响 .论 34 交链孢菌激活蛋白对水稻幼苗活性氧含量的影响 . 交链孢菌激活蛋白对水稻幼苗抗病防御相关酶活性的影响 .35 交链孢菌激活蛋白对水稻抗病信号转导途径相关组分转录水平的影响 .结 .三章 交链孢菌激活蛋白激发的水稻差异表达基因 .料与方法 38 材料 .38 主要试剂和药品 .38 交链孢菌激活蛋白的制备与纯化 .39 蛋白激发子处理水稻叶片 .39 总 提取 . 水稻 库的构建和 片分析 39 序列分析 半定量 析 . 迹杂交 .40 果与分析 41 片鉴定交链孢菌激活蛋白激发的水稻差异表达基因 . 差异表达基因的鉴定与功能分类 .42 10 个信号转导和防御相关基因的序列分析 .49 10 个信号转导和防御相关基因的半定量 析 .50 差异表达基因 和 基因的 交分析 .论 52 片鉴定交链孢菌激活蛋白激发的水稻差异表达基因 . 抗病防御相关基因的差异表达 . 半定量 .54 小结 .四章 差异表达基因 的克隆与原核表达 57 中国农业科学院博士学位论文 目录 料与方法 57 材料与培养 . 化学试剂与药品 . 总 取和 成 . 全长基因的获得 . 目的基因的原核表达 .59 表达蛋白的 测 .果与分析 61 基因全长 克隆和序列分析 .61 . 白的表达 .68 白的表达 .69 论 70 序列分析 . 和 的表达 .71 小结 . 差异表达基因 抗病性中的作用 .料与方法 73 材料 .73 化学试剂与药品 . 培养基成分 . 植物总 取和 交 . 目的基因的获得 . 植物表达载体 和 的构建 . 农杆菌介导 和 因对烟草的转化 转基因植株的检测 .果与分析 77 因在抗病性不同的水稻品种中的表达 . 和 植物表达载体的构建 . 转基因植株的筛选 . 杂交分析转基因的表达 . 转基因植株中 因的表达 .82 转基因植株抗 定 82 论 83 差异表达基因 基因在不同抗性水稻品种中的表达 .83 转 和 基因的烟草植株抗病性分析 .结 .国农业科学院博士学位论文 目录 结论 .考文献 .谢 .者简历 .国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 1第一章 文献综述 激发子诱导的系统性获得抗性及其信号转导 自 1901 年 锈菌的弱毒小种接种小麦来抵抗锈菌侵染， 1915 年 研究番茄花叶病时首次提出了获得免疫的概念， 1933 年 次报道了病毒病的诱导抗性以来，激发子诱导的植物系统性获得抗性不断深入和拓展，目前已积累了大量的文献资料。在激发子诱导植物系统性获得抗性的生理生化机制、分子机制和遗传机制、诱导抗性与环境因子的关系、抗病基因的表达调控、抗病信号转导途径及信号途径间的交叉等方面已经达成较好的共识，利用抗病信号途径的关键调控组分，以及利用和改造诱导型启动子在植物基因工程中的应用则成为近年研究的热点。本章综述了不同类激发子及其受体、激发子诱导的的早期事件、 的信号和信号转导途径，以及抗病防御和信号转导相关基因在转基因改良水稻抗瘟性中的应用现状。 发子概述 发子的定义 激发子是指能激发生理和形态反应及植保素积累的各种来源的化合物， 包括生物源激发子和非生物源激发子（郭泽建和蒋冬花， 2003； et 2005） 。生物源激发子意指来源于病原微生物或病原微生物与寄主植物互作后产生的化合物。 病原微生物产生的激发子又包括真菌的葡聚糖、糖蛋白、脂类物质和其他细胞壁组分、细菌细胞壁结构组分中的脂多糖和鞭毛蛋白、病毒的外壳蛋白、线虫口针和头部的糖蛋白等。寄主植物产生的激发子则主要指细胞壁组分中的寡糖类物质如寡聚半乳糖醛酸和木聚糖片断。 寄主植物与病原微生物互作产生的激发子主要是由植物病原物互作过程中酶对寄主植物和病原微生物细胞组分修饰后产生的， 如植物中的几丁质酶和 生物源激发子是指一些非生物来源的化合物，如水杨酸和核黄素等，某些金属离子如 具有激发子的功能（郭泽建和蒋冬花， 2003） 。但就植物中从激发子感知到产生防御反应的信号转导而言，激发子仅指真菌的分离物或植物细胞壁组分、细菌、病毒或食草动物的成分或具有激发子活性的人工合成类似物（ et 2005） 。而从植物病理的角度讲，许多激发子可能是基因对基因抗性的植物遗传系统中的无毒因子（ 发子的分类 激发子 启动引起植物防御反应如病程相关蛋白和防御次生代谢物质合成的信号转导之前， 激发子或无毒因子应当被定位于原生质膜或胞质膜上的受体蛋白或 G 蛋白所识别。通过受体形态的改变或者激活受体激酶，激发子随后激活相应的效应物或间接地激活相应的效应物，如离子通道、 酶和激酶，这些效应物再将激发子信号转导至下游的防御反应（ et 2005） 。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 2根据激发子的化学性质，可分为寡糖、糖肽 /糖蛋白、多肽 /蛋白质和脂类几大类（ 1992） 。应用富含膜的分离物，进行特定激发子的结合测试，已经鉴定出了大量的特异性受体，表明这些糖激发子、蛋白激发子或脂激发子与受体之间可高亲和结合，这种结合具有特异性、可逆性、饱和性，从而说明激发子与受体的结合是受体 et 2005） 。 糖激发子 在激发子信号转导中，寡糖类激发子是研究得最为充分的信号分子，曾被认为是植物细胞有别于动物细胞的特有信号分子。目前已鉴定并纯化出的寡糖类激发子包括葡聚糖、几丁质及衍生物和脂多糖 （王源超和李德葆， 1999； 郭泽建和蒋冬花， 2003） 。 如 et (1984)从大雄疫霉 胞壁中分离出 明显诱导大豆子叶积累植保素。 et (2001) 和 et (2001) 分别从甘蓝黄单胞菌洋葱伯克霍尔德菌 胞壁中分离出脂多糖激发子，它们能激发烟草发生防卫反应。 寡糖激发子的结合位点已经在许多植物中进行了研究。 目前已经确定在大豆原生质膜上存在大雄疫霉葡聚糖的高亲和结合位点， 2从大豆细胞中分离和纯化出75结合蛋白，多以二聚体或多聚体形式存在（王源超和李德葆， 1999） 。 et 1997）从绿豆悬浮细胞中分离出具有 ,3从绿豆悬浮细胞中分离出 85膜蛋白（见表 1） 。 白质 /肽激发子 蛋白质 /多肽是动物细胞中最重要的信号分子，而蛋白质 /多肽作为植物信号分子的作用则是近年来发现的事情。目前，在植物 多肽激发子。其中包括疫霉属（ 腐霉属（ 菌产生的 火疫病菌（ 假单胞菌（ pv 细菌中产生的 原细菌中分离出的鞭毛蛋白（ 、植物病毒的蛋白类激发子以及无毒基因产物无毒蛋白等。 蛋白质 /肽激发子的结合位点也在几种植物中进行了鉴定。在欧芹悬浮细胞中，一个 13个氨基酸的肽激发子可与细胞膜上的受体发生相互作用（ et 1998） 。从 P. 分离的 白能激发烟草发生过敏反应，使 因的转录增加，从烟草原生质膜上已经鉴定出特异性、可逆的、饱和结合的结合位点。细菌鞭毛蛋白以含 22 个氨基酸的肽（ 为激活活性结构域。 被许多种植物识别，从拟南芥中已经鉴定出与 亲和结合的受体类激酶。 从