【毕业学位论文】应用RNAi 技术抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的研究博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 应用 术抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的研究 of NA 交日期 2006 年 6 月 博士研究生: 贺云霞 指导教师:童光志 研究员 申请学位类别 : 农学博士 专 业:预防兽医学 研究方向:动物病毒分子 生物学 培养单位:研究生院 哈尔滨兽医研究所 of NA 2006 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 （保密的学位论文在解密后应遵守此协议） 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 论文评阅人、答辩委员名单 论文题目 应用 术抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的研究 论文作者 贺云霞 指导教师 童光志 培养单位 哈尔滨兽医研究所 姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 周继勇 教授 博导 浙江大学动物科学学院 钱爱东 教授 博导 吉林农业大学动物医学院 评 阅 人 吴东来 研究员 博导 哈尔滨兽医研究所 答辩 主席 崔玉东 教授 博导 八一农垦大学动物医学院 崔玉东 教授 博导 八一农垦大学动物医学院 王君伟 教授 博导 东北农业大学动物医学院 李一经 教授 博导 东北农业大学动物医学院 刘长明 研究员 博导 哈尔滨兽医研究所 周建华 研究员 博导 哈尔滨兽医研究所 仇华吉 研究员 博导 哈尔滨兽医研究所 答 辩 委 员 陈洪岩 研究员 博导 哈尔滨兽医研究所 答辩时间与地址 2006 年 6 月 16 日 哈尔滨兽医研究所学术报告厅 记录人员 周艳君 I 摘 要 猪繁殖与呼吸综合征（ 以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难为特征的、严重危害养猪业的主要传染性疾病之一，给世界范围的养猪业造成巨大经济损失。 毒（ 宿主淋巴细胞有严格嗜性，其 因组易变异，常规的疫苗设计策略难以产生理想的免疫效果，因此，探索防治该病的新方法有重要意义。 为新的有效抗病毒工具，其机制与建立在病毒蛋白基础上的传统的疫苗免疫机制不同，是转录后 平上的基因沉默机制，通过双链 子阻断或者降低同源基因的表达而达到抗病毒复制的效果。在哺乳动物细胞中， 21 23小干扰 以诱导同源基因特异表达抑制，为探索抗病毒研究提供了新思路。 本研究首先针对 含量最高、相对保守的核衣壳蛋白（ N）编码序列 因，使用 ，选取 4 个特异 列（ ，同时设计一个无相关序列（ 照，利用一步 6 启动子的发夹 达盒（ ，带 达盒的 蛋白的重组质粒 转染 293T 细胞，荧光显微镜下检测表达绿色荧光蛋白（ 胞比例，快速筛选有效 段。筛选 93T 细胞系，验证了筛选片段的基因沉默效果，在 染的 段可以明显减轻 起的特异性细胞病变。 为了使 得长久表达并适合于大量制备，将 制备 达盒插入到粒载体，构建 达载体（ ，转染 胞，在 平及蛋白质水平检测 制的抑制。结果证明 以明显减轻 起的特异性细胞病变；在间接免疫荧光分析（ 测中，理细胞的 蛋白阳性细胞及 N 蛋白表达量比对照的明显减少；荧光定量 病毒滴定检测发现 理细胞中 N 蛋白的 对照减少了 96%，病毒滴度比对照减少了 681 倍。此外， 检测 制 次要结构蛋白的 达水平的变化进行检测，结果表明，次要结构蛋白 达水平分别比对照减少了 60%、 30%、 55%，证明 复制受到了抑制，而且 抑制作用是特异的。 为了了解次要结构蛋白 针对各基因分别选取 4个 建相应的 达载体（ 21、 22、 23、 24、 31、 32、 33、 34、 41、 42、 43、 44） 。 染 胞中 应 量的特异 毒效价滴定表明这些 达载体（ 23、 24、 31、 34、 41）处理细胞培养上清中的病毒滴度比对照低 84 倍，但 测中没有发现明显差异，推测次要结构蛋白在病毒感染中有重要作用。 研究为 术应用于抗 染研究奠定了基础并为研究病毒蛋白功能提供了新途径。 关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 , 扰 , 干扰性小 短发夹 is by a of of It is of of to NA is to As a a is on of It is a of by In (21of It a in In a A as by a as by 6 by of 93T of on an In 93T of on in In to at It in In In it 6% of 81of in a In of It of P4)0%, 30% 5%, It of In to P4 in 21, 22, 23, 24, 31, 32, 33, 34, 41, 42, 43 4). of of 23, 24, 31, 34 1) 84 of no It a a to of of V 目 录 第一章 绪论 .究进展 . 1 . 染的细胞生物学 . 复制、转录和翻译 . 复制酶蛋白 . 主要结构蛋白 . 次要结构蛋白 . 免疫抑制和持续性感染 . 细胞凋亡与 病的关系 . 11 准种、异常 病的关系 .0 防制策略 .究进展 . 14 述 . 分子机制 . 哺乳动物细胞中特殊的 象 . 应用 . 局限性及应用前景 .研究的目的和意义 . 24 第二章 基于 增的 达盒快速筛选 蛋白特异的有效 列 .料与方法 . 26 质粒、细胞和病毒 . 试剂、抗体 . 主要仪器 . 筛选和 达盒的设计 . 达盒的扩增和纯化 . 表达 合蛋白载体的构建 . 病毒 . 用 染 293T 细胞 . 合蛋白稳定表达 293T 细胞系的筛选 .0 染 感染 .1 间接免疫荧光法检测 抑制 .果 . 31 一步 扩增 达盒 . 计算病毒滴度 . 组质粒的鉴定 . 制 合蛋白的表达 . 定表达细胞系上的效果 . 制了 异性细胞病变的产生 . 少 染细胞中的 N 蛋白阳性细胞 .论 . 35 第三章 基于载体表达的 胞上对 制抑 的研究 .料与方法 . 38 质粒、细胞和病毒 . 试剂、抗体 . 主要仪器 . 引物探针设计 . 达载体的构建 . 达载体的纯化 . 达载体的转染 . 测 达载体对 制的抑制 . 测 N 蛋白表达变化及抑制作用的剂量依赖性 .0 荧光定量 测抑制效果 .1 毒价滴定检测抑制效果 .果 . 44 达盒的扩增和 达载体的构建 . 达载体抑制 起的特异性细胞病变 . 达载体减少 性细胞 . 达载体在蛋白水平减少 N 蛋白表达 . 达载体在 平减少 N 蛋白表达 . 达载体对病毒毒价的影响 .论 . 51 第四章 特异 筛选及其抑制效果的研究 .料与方法 . 57 质粒、细胞和病毒 . 试剂 . 仪器 . 扩增及克隆载体的构建 . 针及引物的设计 . 选及 达盒设计 . 达载体的构建 . 达载体的转染及病毒的感染 . 荧光定量 测抑制效果 .0 病毒毒价滴定检测抑制效果 .果 . 60 扩增及表达载体的构建 . 扩增及重组质粒的鉴定 . 达载体抑制 异性细胞病变 . 荧光定量 测 表达变化 . 病毒毒价滴定结果 .论 . 65 第五章 结论 .考文献 . 谢 .者简历 .表清单 图 1因组结构及亚基因组 . 1非结构蛋白剪切方案 . 1其它动脉炎病毒的 基因组中的相应位置 . 1-4 特征及 作用机制 . 1放大机制 . 1-6 作用途径 . 1 起非特异性基因沉默的途径 .