-基因工程的基本操作程序

.,姐的心里不缺人不死唐三藏-高调艿是姐的风格、黑的不是社会，是心。劳资就是不淑女#奈何桥上唱征服飞车妹子雄起无敌硬妹拒绝狗友媳妇为王姐我输的起。你若离去丶巴掌扇去*我天生傲骨怎能服输哥不会英文，只会拼音一枪崩了你。帆布鞋也比你高跟鞋优雅、未来学霸命你！我素学渣我怕谁甩我者亡i婷大爷伤我者亡坟地里唱嗨歌别碰我心#欧霸！时贱去尼玛淑女少年就要狂我要当学霸、我行我素。宁无爱哥丶看破繁华说我拽你能奈我何爱滚哪滚哪！你快滚！伤我你不配&你拿什么资本跟我傲！|你特么算什么东西不过如此你已被我out冥花有主绝诱惑矫揉造作无需挽留莫犯贱。_爱你等于作孽穷的只有爱、sorry请滚。气势比天高大陆男神劳资是个好菇凉国产好姑娘*Rollforme给我滚国际帅锅丶直觉不是理由抱歉。nl、不配若离，必弃。男人拽照样甩变态人士强迫症患者补刀团团长你柔弱给谁看莫装纯午夜埋葬者霸道姐骚娘们劳资爱上尼玛了姐不缺爱,1.2基因工程的基本操作程序,.,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用,载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。,才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。,.,一、目的基因的获取,.,1.从基因文库中获取目的基因,1.基因文库的概念:,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。,2.基因文库的种类:,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库,.,基因组DNA文库与cDNA文库,某生物体内全部DNA,许多DNA片段,受体菌群体,与运载体连接导入,基因组文库,cDNA,受体菌群体,与运载体连接导入,cDNA文库,某种生物某个时期的mRNA,.,基因的结构,非编码区,非编码区,编码区,RNA聚合酶结合位点,外显子,内含子,终止子,启动子,原核,真核,.,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质,连续不间断,编码区,非编码区,调控遗传信息表达,上游的RNA聚合酶结合位点:,基因结构,.,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用,上游有RNA聚合酶结合位点(启动子)。,与RNA聚合酶结合位点,基因结构,.,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,转录,翻译,转录,翻译,.,基因文库的构建方法,基因组文库的构建,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,重组载体,基因组文库,导入受体菌中储存,.,cDNA文库的构建-逆转录法：,提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA,单链DNA,双链cDNA片段,重组载体,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,导入受体菌中储存,.,思考？,真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？,.,真核细胞的cDNA的获取,编码区,非编码区,非编码区,DNA聚合酶,剪接有关的酶,RNA聚合酶,mRNA前体,mRNA,单链DNA,cDNA,逆转录酶,转录,剪接,逆转录,复制,启动子,终止子,基因,不含非编码序列。即不含非编码区和内含子,.,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,.,2.利用PCR技术扩增目的基因,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,.,PCR技术的操作过程,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加_倍,一,.,PCR技术的操作过程,.,PCR技术的操作过程,PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增,.,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对原则,碱基互补配对原则,四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP,四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化解旋,半保留复制、边解旋边复制,半保留复制、全解旋再复制,体外复制,主要在细胞核内,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等,.,3.人工合成法,在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,思考：化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？,.,人工合成法（真核生物）,反转录法,目的基因的信使RNA,目的基因,化学合成法,肽链氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,推测,推测,单链DNA,合成,.,课堂小结,目的基因的获取,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库,.,二、基因表达载体的构建基因工程的核心,.,表达载体,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,.,基因表达载体的构建过程,质粒,DNA分子,限制酶处理,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,一个切口两个黏性末端,.,注意：,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,.,三、将目的基因导入受体细胞,.,1、目的基因导入植物细胞的方法,（1）农杆菌转化法,农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,.,三、目的基因导入受体细胞,构建基因表达载体,转入,农杆菌,植物细胞,导入,稳定维持和表达,过程：,.,1、目的基因导入植物细胞的方法,（2）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞,操作方法：利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um。,适用：单子叶植物,.,1、目的基因导入植物细胞的方法,（3）花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞,操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞,特点:十分简便经济。,例：转基因抗虫棉,.,2、将目的基因导入动物细胞,方法：显微注射法,程序,目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物,.,3、将目的基因导入微生物细胞,微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少常用菌：大肠杆菌常用法：Ca2+处理获得感受态细胞过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,感受态细胞吸收DNA,表达载体与感受态细胞混合,.,小结：将目的基因导入受体细胞,.,四、目的基因的检测与鉴定,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？,1,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。,2,目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？,不一定，需要检测,.,1、鉴定分子水平的鉴定,转基因生物的DNA,探针,15N,15N,14N,14N,（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,基因探针：,放射性同位素等标记的DNA分子,方法,DNA分子杂交技术,变性,变性,.,1、鉴定分子水平的鉴定,变性,方法,分子杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,探针,15N,15N,转基因生物的mRNA,14N,14N,.,1、鉴定分子水平的鉴定,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原-抗体杂交,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,.,2、鉴定个体水平的鉴定,抗虫、抗病接种实验，活性比较实验,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,.,思考？,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？,.,课堂练习,1、有关基因工程的叙述中，错误的是()A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B、限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,.,课堂练习,2、下列属于获取目的基因的方法的是()利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取利用PCR技术利用DNA转录人工合成A.B.C.D.,D,.,课堂练习,3、有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,【拓展深化】工具酶只有两种：限制酶在操作程序1、2中用到且要求用同一种，目的是产生相同的黏性末端；DNA连接酶只在操作程序2中用到。,.,课堂练习,4、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A、人工合成目的基因B、目的基因与运载体结合C、将目的基因