免疫学诊断PPT课件.ppt

免疫学检测技术的基本原理 免疫学诊断 抗原或抗体的检测 淋巴细胞的测定 免疫学检测方法的应用 目的要求 1 掌握 凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术的概念 凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术的常用方法及实际应用 2 熟悉 细胞免疫检测法的基本原理及实际应用 3 了解 其他免疫学检测方法及其应用 一 抗原抗体反应的特点 1 抗原抗体反应的特异性 2 抗原抗体反应的可逆性 4 抗原抗体反应的阶段性 特异性结合阶段 肉眼可见阶段 3 抗原抗体反应的可见性 一 抗原抗体结合反应的特点及影响因素 Ag Ab反应的可见性 二 抗原抗体反应的影响因素电解质抗原抗体 等电点pH3 5和pH5 6 在中性或弱碱性条件下带有负电荷 需适当浓度的电解质 如0 85 NaCl 才会结合 温度通常为37 酸碱度最适pH值在6 8之间 pH值接近等电点时 抗原抗体多带正负电荷相等 由于自身吸引而出现凝集 导致非特异性反应 二 抗原或抗体的体外检测方法 1 凝集反应 直接凝集反应 间接凝集反应 细菌 红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集团块称凝集反应 直接凝集反应的作法及应用 玻片法 定性试验 主要用于细菌与人类ABO血型的鉴定 试管法 半定量试验 常用于检测抗体的滴度或效价 临床诊断伤寒或副伤寒所用的肥达氏反应和诊断布氏菌病所用的瑞特试验 1 2稀释待测血清1 41 81 16 玻片法 试管法 直接凝集反应 间接凝集反应的应用 常用的载体颗粒 人O型血红细胞和聚苯乙烯乳胶颗粒 应用 链球菌O抗体的检测实验 类风湿因子的检测 Coombs试验 2 沉淀反应 可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物称沉淀反应 单向免疫扩散 免疫比浊法 双向免疫扩散 免疫电泳 抗原或抗体的检测 单向免疫扩散的应用 应用 测定血清中IgG IgM IgA与补体C3的含量 缺点 1 2天才出结果 双向免疫扩散的应用 应用 根据沉淀线的数目和形状可对抗原或抗体进行定性检测 组分分析等 对流免疫电泳可检测 血液中的HBsAg和AFP 免疫比浊法主要用于 血清蛋白及抗体成分的分析研究 3 免疫标记技术 抗原或抗体的检测 用荧光素 酶 同位素等标记抗体或抗原用以测定相应抗原或抗体的技术称为免疫标记技术 特点 敏感 特异 快速 能定性 定量 定位 免疫印迹法 免疫胶体金技术 放射免疫测定法 免疫荧光技术 化学发光免疫技术 免疫标记技术常用方法 酶免疫测定法ELISA 1 酶免疫测定法 ELISA 1971年瑞典学者Engvail和Perlman nn 荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法 称为酶联免疫吸附试验 抗原或抗体的检测 间接法 常用于检测血清中的抗体 将已知抗原包被于固相载体 加入待检标本 若标本中有相应的抗体 则可与抗原结合 再加入酶标二抗 洗涤后加底物 底物受酶的催化发生化学反应产生有色物质 此法是测定抗体最常用的方法 间接法 已知抗原 待测抗体 酶标抗体 抗原或抗体的检测 双抗体夹心法 常用于检测标本中的抗原 将已知抗体包被在固相载体上 加入待测标本 使其中的抗原与抗体结合 洗去未结合的抗原 加入已知的酶标抗体与标本中抗原结合 再洗去未结合的酶标抗体 加入底物 底物受酶的催化发生化学反应产生有色物质 双抗体夹心法 抗体 待测抗原 酶标抗体 底物 BAS ELISA 可用来检测细菌 病毒 肿瘤细胞表面抗原等 生物素与抗生物素有极高的亲和力 利用抗生物素为桥梁 联结生物素化的抗体及生物素化过氧化物酶 可获得极高的敏感性 多级放大系统 Ab 待测Ag Ab 生物素化 抗生物素 四价 生物素化 E 底物 BAS ELISA法 敏感性更高 用于抗原 抗体以及DNA RNA的检测 卵白及某些微生物中的蛋白质 抗原或抗体的检测 微粒捕获酶免疫分析技术常用于检测肿瘤标志物 CEA AFP 性激素 甲状腺素 T3 T4 HCG等微量可溶性抗原 将已知抗体致敏的微粒与生物素亲和素酶放大系统结合 最后酶作用于荧光底物 通过检测荧光强度来判断未知抗原的含量 磁性微粒子固相 直径2 8微米 粒子小 悬液类似液相 包被面积大 磁吸引分离方便 抗原或抗体的检测 免疫组化技术 指带显色剂 酶 标记的特异性抗体或抗原在组织细胞原位发生抗原抗体反应和组织化学的呈色反应 对相应抗原或抗体进行定位 定性 定量检测的技术 免疫组化技术 2 免疫荧光技术是用荧光素标记一抗或二抗 检测特异性抗原或抗体的方法 常用的荧光素有异硫氰酸荧光素 藻红蛋白等 直接荧光法 检测不同的抗原 需要不同的特异性荧光抗体间接荧光法 用一抗与样本中的抗原结合 再用荧光素标记的二抗染色 此方法既可检测抗原又可检测抗体 若查抗原 一抗为已知的 若查抗体 抗原是已知的 一种荧光抗体可用于多种不同抗原的检测 3 放射免疫测定法 RIA 是用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定 将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来 具有重复性好 准确性高等优点 用于激素 药物等微量物质的检测 敏感性可达到pg ml水平 常用的放射性核素有131I和125I等 3 化学发光免疫技术 CLIA 将化学发光 如鲁米诺 分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术 特点 灵敏度高 特异性强分离简便 自动化分析 4 免疫胶体金技术 ICS 用胶体金颗粒标记抗体或抗原 以检测未知抗原或抗体的方法称免疫胶体金技术 5 免疫印迹技术又称Westernblotting 是将十二烷基磺酸钠 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 分离得到的蛋白转移到固相载体膜上 再用标记的特异性的抗血清或单克隆抗体对蛋白质进行定性及定量分析的技术 敏感性为1 5ng 4 蛋白质芯片技术常用于微生物感染的检测 其原理是将各种蛋白质固定于载体上制成芯片 再用荧光标记抗体与芯片作用 洗去未结合的抗体后 用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术测定芯片上各点荧光强度 以此检测荧光对应的抗体及其相互结合的程度 三 免疫细胞的测定 人的免疫细胞测定 外周血 动物的免疫细胞测定 外周血 胸腺 脾脏与其他组织 常用的方法 葡萄糖 泛影葡胺密度梯度离心法 外周血单个核细胞的分离 淋巴细胞及其亚群的分离 1 免疫吸附分离法 获得不同的T细胞亚群2 免疫磁珠分离法 获得不同表面标志的活T细胞亚群 3 免疫磁珠法4 抗原肽 MHC分子四聚体技术 免疫吸附分离法 将已知抗淋巴细胞表面标志的抗体包被聚苯乙烯培养板 加入淋巴细胞悬液 表达相应细胞表面标志的淋巴细胞可被吸附在培养板上 即可与其他细胞分开 免疫吸附分离法 加入淋巴细胞悬液 免疫磁珠法 应用较广泛是一种特异性分离所需淋巴细胞的方法 首先将特异性抗体 如抗CD3 抗CD4或抗CD8等 吸附在磁性微珠上 与待测细胞悬液中的相应细胞特异性结合后 再将磁珠结合细胞与未结合磁珠细胞分开 即可获得纯度高的所需细胞 磁珠分离法 荧光激活细胞分离仪分离法 流式细胞术分离法 是一种集光学 流体力学 电力学和计算机技术于一体 可对细胞进行多参数定量测定和综合分析方法 定量分析活细胞表面表达的特异分子 免疫细胞分析和细胞计数 白血病和淋巴瘤的免疫学分型 细胞周期和细胞凋亡检测 流式细胞术 荧光抗体标记混合细胞 喷嘴 单细胞悬液5000 10000个 秒 细胞分选器 荧光 检测器 抗原肽 MHC分子四聚体技术将特异性抗原肽段 可溶性MHC 类分子重链及 2微球蛋白在体外正确折叠 在亲和素存在下构建四聚体 并结合流式细胞仪定量检测外周血及组织中抗原特异性CTL的比率 淋巴细胞及其亚群的分离 免疫细胞功能测定 磁珠分离法 免疫吸附分离法 流式细胞术 肽 MHC四聚体技术 T细胞功能测定 B细胞功能测定 细胞因子检测 T细胞增殖试验 迟发型超敏反应的检测 抗体含量测定 溶血空斑试验 巨噬细胞吞噬试验 细胞毒试验 吞噬功能测定 51Cr释放法 乳酸脱氢酶释放法 细胞染色法 凋亡细胞检测法 硝基蓝四氮唑试验 生物活性检测法 免疫学检测法 三 淋巴细胞功能的测定 1 T淋巴细胞功能的测定 形态学方法 T淋巴母细胞转化试验 3H TdR掺入法 灵敏性高 但有放射污染 MTT法 灵敏性不及3H TdR掺入法 但无放射污染 4 迟发型超敏反应 DTH 的检测 形态学方法 T淋巴母细胞转化试验T淋巴细胞在体外培养时 在有丝分裂原刺激下 可转化为T淋巴母细胞 体积增大 细胞形态不规则 胞质增多 细胞核松散及出现较多核仁 通过观察培养细胞的数量 了解其细胞的增殖变化 3H TdR掺入法 T细胞增殖过程中DNA和RNA合成会增加 在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷 3H TdR 或125I标记的尿嘧啶核苷 125 UdR 则会被掺入细胞核中 培养结束后收集细胞 用液体闪烁仪测定样本中放射性活性 可反映细胞的增殖水平 灵敏性高 有放射污染 放射性测定 3H TdR 丝裂原刺激 淋巴细胞转化试验原理示意 MTT法 灵敏性不及3H TdR掺入法但无放射污染 T细胞增殖时 线粒体中的琥珀酸脱氢酶将MTT还原为紫褐色的甲臜颗粒 该颗粒被随后加入的异丙醇或二甲基亚砜溶解 用酶标仪测定细胞培养上清液中溶解紫褐色甲臜的OD值 即反映细胞的增殖水平 MTT一种噻唑盐 二苯基溴化四唑 淡黄色可溶性物质 迟发型超敏反应 DTH 体内检测细胞免疫功能的皮试方法原理 被抗原已致敏的机体 再用相同的抗原作皮试可导致迟发型超敏反应 72小时后局部充血 渗出 红肿和硬结 细胞免疫正常者出现阳性反应 细胞免疫低下者则呈弱阳性或阴性反应 常用于检测某些微生物感染 2 B淋巴细胞增殖试验 1 利用前面介绍的抗原抗体检测方法测定标本中抗体含量 2 抗体形成细胞测定试验 又称溶血空斑形成细胞试验 可检测产生抗体的B细胞数量 3 细胞毒试验 是检测CTL NK等细胞杀伤靶细胞活性的细胞学技术 主要用于肿瘤免疫 移植排斥反应和病毒感染等方面的研究 4 吞噬细胞功能测定 显微镜测定法吞噬率 吞噬细菌的吞噬细胞数 200个吞噬细胞 100 吞噬指数 200个吞噬细胞中所吞噬的细菌总数 200个吞噬细菌的吞噬细胞 100 5 细胞因子的测定细胞因子的检测有助于了解其在免疫调节中的作用 监测细胞免疫功能 常检测的细胞因子有IL 2 IL 4 IL 10 IFN 等 常用的方法主要有生物活性检测法 ELISA法等 三 免疫学检测的应用 一 协助诊断感染性疾病 三 协助诊断免疫系统疾病 四 进行免疫学监测 二 协助诊断肿瘤 思考题 1 解释名词凝集反应沉淀反应免疫标记技术2 可用哪些方法定量检测血液标本中的抗原 3 可用哪些方法检测组织中的抗原 4 HIV HBV感染者的诊断和病情监测可用哪些方法 凝集反应原理图解 一 凝集反应原理图解 二 凝集反应原理图解 三 单向琼脂扩散试验 双向琼脂扩散试验 免疫电泳 immunoelectrophoresis 对流免疫电泳 火箭电泳 测吸光度 抗体 抗原 免疫复合物的浓度与透射光的衰减呈正相关 免疫比浊法原理 免疫荧光技术 酶联免疫吸附试验 ELISA 间接法 斑点金免疫层析试验 胶体金 氯金酸 HAuCl4 在还原剂的作用下 可聚合成特定大小的金颗粒 因其在静电作用下而呈稳定的胶体状态 故称胶体金 斑点金免疫层析试验 用胶体金作为标记物来检测抗原或抗体的方法 胶体金颗粒聚集后呈红色 可用于标记多种大分子 如白蛋白 免疫球蛋白 糖蛋白 激素 脂蛋白 植物血凝素 卵白素等 兔抗鼠IgG 鼠抗HCG单抗 金标鼠抗HCG单抗 尿液浸湿标志线 手持端 斑点金免疫层析试验 一 斑点金免疫层析试验 二 尿样 阳性 弱阳性 阴性 无效 免疫印迹法图解 裂解病毒 聚丙酰胺凝胶电泳 95684512KD 电转印至NC膜上 置待测血清中 漂洗 加酶标抗抗体 漂洗 加底物显色 1204124KD 十二烷基磺酸钠SDS T细胞亚群的检测 抗凝血 分层液 抗凝血 血浆 白膜层 红细胞 离心 淋巴细胞的分离 T细胞亚群的检测 花环法 一 T细胞亚群的检测 花环法 二 PHA 淋巴母细胞转化试验示意图 细胞 淋巴母细胞 淋转 标本片 淋巴母细胞 淋转 标本片 淋转 标本片 操作流程 1 制备抗体包被板 试剂盒中所带 2 加待测标本及对照品 加酶标记物 3 温育 37 30min 4 漂洗 磷酸缓冲盐水 20s 5次 5 加底物 四甲基联苯胺 显色剂 H2O2 37 5min 6 结果测定 E E E E E E E E 底物系统 抗AFP抗体 AFP 酶标抗体 双抗体夹心复合物 4 蛋白质芯片技术 抗原肽 MHC四聚体分离技术 亲和素 抗原肽 MHCI 生物素 荧光素 B细胞功能测定 抗体含量测定 溶血空斑试验 可通过单项琼脂扩散法 ELISA 速率比浊法等测定标本中各类Ig的含量 绵羊红细胞 SRBC 免疫动物 4天后取出动物脾脏 脾细胞悬液中含有抗SRBC的浆细胞 脾细胞与SRBC在适量琼脂糖液中混匀 在抗体形成细胞周围出现溶解的透明区 即溶血空斑 1个空斑区代表1个浆细胞 加入新鲜补体 倒入平皿中培养 生物素 biotin B 生物素在机体内以辅酶形式参与各种羧化酶反应 故又称为辅酶R或维生素H 分子中有两个环状结构 其中I环为咪