分子生物学 研究方法(上)ppt课件

第五章分子生物学研究方法 上 本章主要内容常见的DNA操作技术基因克隆技术简介蛋白质组学及研究技术 引言 重组DNA技术发展史上的重大事件40年代 解决了遗传的物质基础问题 确定了遗传信息的携带者 即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质 50年代 解决了基因的自我复制和世代交替问题 建立了DNA分子的双螺旋结构模型 提出了半保留复制机制 50年代末至60年代 相继提出了 中心法则 和操纵子学说 成功地破译了遗传密码 充分认识了遗传信息的流动和表达途径 从此 大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体 1970年Mandel和Higa发现 大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后 能有效地吸收 噬菌体DNA 1972年 Cohen等人又报道 经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒DNA 基因工程的主要内容或步骤 分 切 连 转 筛 1 从基因组中分离 或PCR扩增 或人工合成带有目的基因的DNA片段 2 用适当的限制酶分别切割适当的载体分子和含有目的基因的DNA分子 3 将目的基因连接到载体分子上 形成重组DNA分子 4 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞中并增殖 5 筛选重组转化子 扩增目的基因 再将目的基因克隆到表达载体上 导入受体细胞 使表达目的产物 基因工程技术区别于其它技术的根本特征 具有跨越天然物种屏障 把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力 1962年Arber发现限制性核酸内切酶 1967年Gellert发现了DNA连接酶 重组DNA实验中常见的主要工具酶 科学家已几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段 再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开 以供下一步研究 1DNA操作技术 DNA分子的切割与连接核酸分子杂交凝胶电泳细胞转化核酸序列分析基因的人工合成基因的定点突变PCR扩增基因敲除 1 1核酸的凝胶电泳 原理 种类 琼脂糖 agarose 凝胶电泳 聚丙烯酰胺 polyacrylamide 凝胶电泳用途 鉴定重组DNA分子蛋白质与核酸相互作用DNA分型DNA核苷酸序列分析限制酶酶切片段分析限制酶酶切作图 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0 2 50kb之间 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1 1000个碱基对 凝胶的分辨能力同凝胶类型和浓度有关 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小 浓度越高 孔隙越小 其分辨能力就越强 反之 浓度降低 孔隙就增大 其分辨能力也就随之减弱 1 2转基因方法1 2 1细菌转基因的方法 1 结合 conjugation 2 转化 transformation 常规转化 电转化等 3 转染 transfection 4 转导 transduction 1 2 2动物转基因的方法 1 显微注射法 包括细胞核内和细胞质内注射 2 电导转基因法 3 逆转录病毒介导法 4 胚胎干细胞介导法 5 精子载体法1 2 3植物转基因的方法 1 Ti质粒介导 2 电转化法 3 基因枪法 1 3 1放射性同位素技术同位素 原子序数相同而质量不同的元素 放射性同位素同位素可分为稳定同位素和不稳定同位素 后者又称为放射性同位素 不稳定同位素原子核结构不稳定 易自发产生衰变 产生 射线 射线和 射线等 同时从不稳定同位素变成稳定同位素 在分子生物学研究中 得到应用的是放射性同位素 1 3核酸的分子杂交 放射性的衰变类型 射线 带正电荷的高速粒子流 射线 带负电荷的粒子流 射线 光子流分子生物学研究中常用的放射性同位素及其性质元素名称半衰期12 1年5700年14 3天87 1天5 8年 147N 10n 146C 11H146C 147N 0 1e23892U 20682Pb 842He 60 1e t1 2 4 5 109a 放射性强度的探测 1 盖革计数器 Geigercountertuber 闪烁计数器 2 放射自显影 X 光乳胶片覆盖于样品 在黑暗中 70 曝光 放射性分子的制备 核物理 化学 生化反应 生化分离技术 核酸分子的放射性同位素标记应用举例利用切口平移技术制备DNA放射性探针 1 3 2分子杂交类型 根据鉴定对象不同 可将分子杂交法分为3种类型 Southern杂交由E M Southern于1975年创立 Southern杂交 将DNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上 然后与核酸探针进行杂交 Northern杂交 将RNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上 然后与核酸探针进行杂交 Western杂交 将蛋白质从电泳凝胶中转移到杂交滤膜上 然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质进行反应 1 3 3核酸分子杂交 复性 退火 在一定条件下变性的两条单链重新结合为双链的过程杂交 来源不同的两条单链结合为双链分子的过程 核酸探针 指序列或功能特性已知的标记分子 为双链或单链 长度通常为几十至几百bp 包括DNA探针 RNA探针和cDNA探针 若退火的核酸来自不同的生物有机体 则所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子 1 Southern杂交 Southern印迹 用适当的限制酶消化待测DNA 电泳后 将凝胶浸于碱性溶液中以变性DNA 再经毛细作用将变性的DNA从凝胶中转移至杂交膜上并固定 然后与放射性同位素标记的核酸探针杂交 再经放射自显影显示杂交结果 该技术可有效地分析基因结构或检测待测DNA样本中是否含有特定的序列 1 电泳 将已酶切的待检DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳 2 转膜 将分离的核酸样品转移到滤膜上 印迹转移 3 杂交 将滤膜与标记的DNA或RNA探针进行杂交 印迹法 凝胶印迹法 斑点和狭线印迹法 菌落和噬菌斑印迹法 杂交膜 尼龙滤膜 硝酸纤维素滤膜等 杂交模式图 某作者用人的一放射性DNA探针与鼠基因组DNA进行杂交 在所得到的杂交图谱中 第1泳道的点样处有一略呈拖尾状的放射性杂交斑点 第2泳道呈较长的弥散形杂交带 第3泳道有3条较清晰的杂交条带 上下两条带的显色程度相当 中间的条带显色最深 约分别为其上下两侧条带的两倍 试分析上述实验结果 例题 Southern杂交应用举例 环状芽孢杆菌基因启动子的分离与鉴定 环状芽孢杆菌C 2基因启动子探针与重组DNA分子的斑点杂交 2 斑点杂交 Dotblot 直接将DNA样品点在滤膜上使之成为斑点 变性并固定 与探针杂交 放射自显影 检测重组体克隆的菌落杂交技术 3 菌落原位杂交 Hybridizationinsitu 又分为菌落杂交和空斑杂交 在杂交膜上接种转化子细胞 裂解以释放待检DNA 变性并固定DNA 与探针杂交 放射自显影 用于鉴定阳性重组体 4 组织原位杂交 Tissueinsituhybridization 指组织或细胞的原位杂交 经适当处理后 使细胞通透性增加 让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交 以确定探针互补序列在胞内的空间位置 LocalizationofRNA 1 4聚合酶链式反应 PolymeraseChainReaction PCR PCR技术简史1 4 1PCR原理PCR是一种体外无性扩增DNA的实验技术 待扩增DNA片段经高温变性成为单链后 在低温 如52 下与寡聚核苷酸引物退火 然后在中温下以每一条单链为模板 由多聚酶催化延伸引物链 分别合成一条新链 经过解链 退火和链延伸等多个循环反应 原DNA片段就可得到大量扩增 注 Taq来自Thermusaquaticus PCR仪 1 4 2PCR反应体系TmplateDNADNAPrimersdNTPsTaqDNAPolymerase10 Buffer1 4 3基本反应步骤 1个循环包括高温变性 低温退火和中温延伸反应 经n次循环后 一个DNA分子可扩增为2n个分子 模板DNA的变性 模板DNA经加热至94 左右一定时间后 使模板DNA双链解离 使之成为单链 以便与引物结合 Primer1 Primer2 5 3 5 5 3 3 模板DNA与引物的退火 复性 模板DNA经加热变性成单链后 温度降至55 左右 引物与模板DNA单链上的互补序列配对结合 3 3 5 Primer1 Primer2 5 3 5 5 3 5 3 3 TaqDNAPolymerase 引物的延伸 DNA模板 引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下 以dNTP为反应原料 靶序列为模板 按碱基配对原则 合成一条新的与模板DNA互补的链 一般每完成一个循环需2 4分钟 2 3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍 1个PCR循环产生2条双链分子 PCR的基本原理 模板DNA PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第1轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第2轮结束 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 电泳分析 PCR设备 电泳分析 3 PCR的应用反向PCR 扩增已知序列旁侧的未知DNA序列锚定PCR 用于测定基因结构不对称PCR 用于扩增某一单链模板RT PCR 逆转录 PCR 逆转录联合PCR以扩增cDNA复合PCR 用多对引物同时扩增几条DNA片段易错PCR 引入错配碱基 导致随机突变荧光定量PCR 用于估计模板DNA的浓度免疫PCR 扩增抗原 抗体复合物上的DNA分子原位PCR 在组织或细胞标本片上直接进行PCR微生物PCR 用于微生物的鉴定和分类 设计引物应遵循以下原则 引物长度 15 30bp 常为20nt左右 引物扩增跨度 以200 500bp为宜 引物碱基 G C含量以40 60 为宜 避免5个以上相同碱基的成串排列 引物内部应避免出现出现二级结构 避免两条引物间互补 引物3 末端碱基 应与模板单链严格配对 引物中具有或能够加上合适的酶切位点 特异性 与数据库中的其它序列无明显同源性 pPICZ 物理图谱 定向克隆应用举例 PrimerF 5 GCTGAATTCATGGGCAACTCAGCGCTCGACCTT 3 PrimerR 5 TGTTCTAGATTAGACGTTACCGGCGGCGCCAGT 3 上 下游引物的5 端分别设有1个EcoR 和1个Xba 酶切位点 黑体字母表示 及3个保护碱基 定向克隆应用举例 PCR引物设计 粗毛栓菌热激蛋白cDNAPCR扩增 引物设计 5 CTTCCACGACGCTATC GAGAGATTCGCCTGCA3 关于PCR引物设计 例题1 根据以下cDNA编码区片段的两末端已知序列 如何设计下游引物 以扩增该cDNA片段 例题2 如何利用网络技术和DNA分析软件设计简并引物 以PCR扩增某蛋白的cDNA 演示 1 登录NCBI等网站 收集有关cDNA序列信息 2 利用DNA分析软件 如 DNAman等 对所收集的cDNA序列进行比对分析 利用最保守序列设计引物 再论cDNA 38种MnP同工酶cDNA序列的同源性比较右侧1列符号表示相应的cDNA序列在GenBank中的登录号 核酸序列分析 即核酸一级结构的测定 Maxam Gilbert的化学测定法和Sanger的酶法 1 5核苷酸序列分析 酶法测序 Sanger 化学测序法 Maxam Gilbert 待测DNA片段待测DNA片段 次克隆5 末端标记 筛选重组子链分离限制酶切 模板增殖与纯化 纯化标记的ss DNA与引物退火 定序反应定序反应 聚丙烯酰胺凝胶电泳 真空干燥 放射自显影 阅读序列和计算机录入 核苷酸序列的分析与比较 1 5 1Sanger双脱氧核苷酸链终止法 1 原理 双脱氧 2 3 核苷酸可以象2 脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中 但因3 端不具OH基 DNA链合成至此终止 由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同 故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列 dsDNA变性 与1条标记引物退火 在4个反应管中分别加入dNTP和1种双脱氧核苷酸 DNA聚合反应 反应产物变性电泳 凝胶干燥 放射自显影 序列读取 2 步骤 双脱氧核苷酸链终止法测序示意图 双脱氧核苷酸链终止法测序 Sanger法 原理 DNAsequencinggelshowingtheseparationoffragmentsinthefoursequencingreactions oneperlane 序列读取方法1 每一条带都代表一条以双脱氧核苷酸结尾的单链核苷酸片段 2 从凝胶的正极往负极端直接读取的序列 为从 的新合成的单链序列 而从负极往 正极直接读取的序列 则为上述序列的反向序列 方向为 模板序列则为上述序列的互补序列 思考题 假定某一基因克隆的部分序列为5 TCACGTAAGT 3 试根据Sanger序列分析方法原理画出测定上述序列的放射自显影示意图 并对示意图作必要的标注和解释 1 5 2DNA序列测定的自动化使用自动测序仪 使得模板制备自动化 定序反应自动化 凝胶电泳自动化 核苷酸序列阅读与计算机输入自动化 DNA序列分析自动化包括两个方面的内容 一是指 分析反应 的自动化 另一方面则是指 读片过程 的自动化 优点 i 四个反应系统可合并点样 大大节省制胶和点样时间 ii 可同时读出多个样品核苷酸序列 不需干燥凝胶和放射自显影 iii 可连续电泳 可读出较多的核苷酸序列 缺点 无法保留原始记录 四个反应产物点在一条道上 相互间会发生干扰 导致读序时分辨率下降 DNA序列测定的自动化 荧光素标记核苷酸 应用举例 InDNAsequencingusingdideoxynucleotideslabeledwithfluorescentdyes allfourddNTPsareaddedtothesametube andduringprimerextension allcombinationsofchainsareproduced AutomatedDNAsequencingusingfluorescentdyes oneforeachbase 1 6基因文库的建立克隆 clone 作名词用 是指具有相同DNA分子的一个群体或基因型相同的一个生物群体 作动词用 指 进行克隆 或 去克隆 将一特定DNA顺序插入一个载体分子 亚克隆 次克隆 二级克隆 sub clone 是指从已经克隆在载体中的一个大片段中取出较小的DNA片段再进行克隆的方法 基因文库 genelibrary 包括基因组文库和cDNA文库 YAC和BAC文库 基因工程基本操作步骤 分 切 连 转 筛 基因组文库的构建步骤 1 6 1基因组文库基因组文库 含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总体 基因组文库的规模 N ln 1 p ln 1 f 上式中 N 克隆数 p 某DNA片段在基因文库中出现的概率 f 插入片段的平均大小与基因组大小的比值 1 6 2cDNA文库从一定生长阶段的某种细胞或组织分离得到的总mRNA反转录成总cDNA 插入到克隆载体 然后再将cDNA重组子转移到宿主细胞中进行增殖 通过上述方法所获得的无性繁殖系即为cDNA文库 cDNA文库构建步骤 与cDNA克隆或文库构建有关的几个问题cDNA的概念 第一链cDNA cDNA基因 cDNA编码序列 mRNA质量的检测 根据甲醛变性胶电泳的rRNA的带型进行判定 mRNA的纯化 0ligo dT 纤维素柱层析 抗生物素蛋白磁珠吸附法 生物素标记0ligo dT cDNA重组子的形成 在cDNA双链末端或添加同聚物单链尾巴 或添加含适当限制酶识别序列的 接头 linker 以便与适当载体重组 Trametesgallica总RNA的甲醛变性电泳 mRNA质量的检测 mRNA的纯化 PromegaPoly AT tractmRNAIsolationSystem分离Poly A RNA 将用生物素标记的Oligo dT 与总RNA共温育 加入包被有抗生物素蛋白的微磁球 用磁场吸附Oligo dT mRNA cDNA文库构建图解 1 7分子标记技术遗传标记 是基因型的特殊的易于识别的表现形式 它是生物分类学 遗传学 育种学 物种起源与进化等研究的主要技术指标之一 包括形态标记 细胞学标记 生化标记和分子标记等 分子标记 分子标记指能反映生物个体或种群之间基因组DNA差异的DNA序列 分子标记广泛存在于基因组的各个区域 数量大 多态性高 分子标记大多以电泳谱带的形式表现出来 是继形态标记 细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的较为理想的直接从DNA水平上进行遗传分析的遗传标记 应用种质资源研究 品质纯度鉴定 构建遗传连锁图 基因定位标记辅助选择 比较基因组研究 基因克隆 图位克隆 生物起源 进化 医学及法医学等 现有的DNA分子标记技术大体上可分为2类 一类是以分子杂交为基础的分子标记 其代表性技术是RFLP 另一类是以PCR为基础的分子标记 如RAPD SCAR SSR SSLP ISSR AFLP STS EST SSCP和SNP等 每种分子标记技术都有其优缺点 可根据实验材料和研究目的的不同灵活选用 DNA分子标记类型 主要的DNA分子标记英文缩写英文名称中文名称RFLPRestrictionfragmentlengthpolymorphism限制性片段长度多态性STSSequencetaggedsite序列标签位点RAPDRandomamplifiedpolymorphicDNA随机扩增多态性DNASCARSequence characterizedamplifiedregion序列特异性扩增区AFLPAmplifiedfragmentlengthpolymorphism扩增片断长度多态性SSRSimplesequencerepeat简单序列重复SSLPSimplesequencelengthpolymorphism简单序列长度多态性ISSRInter simplesequencerepeats间简单序列重复SSCPSingle strandconformationpolymorphism单链构象多态性SNPSimplenucleotidepolymorphism单核苷酸多态性 1 RFLP 限制性片段长度多态性 不同个体基因组内的核苷酸序列因某种原因产生碱基突变后 改变了某种限制性内切酶的剪切位点 导致酶切片段的大小发生变化 这种变化可以通过与特定探针进行杂交而得到检测 从而可比较不同品种或个体的DNA水平的差异 这些限制性片段在不同个体间呈现的多态性现象称为限制片段长度多态性 RFLP被称为第一代分子标记 同一物种不同生态型之间DNA的趋异性的RFLP 与放射性标记探针杂交 显示特异的DNA片段 RFLP基本步骤 DNA 指纹 DNAfinger print 利用重复序列中的 核心序列 作探针 与经内切酶酶切的DNA片段进行Southern印迹杂交 每个人各有自己的杂交带型 如同每个人各有自己的指纹图形一样 2 STS sequence taggedsite 序列标签位点为已知核苷酸序列的DNA片段 是基因组中任何单拷贝的短DNA序列 长度在100 500bp之间 任何DNA序列 只要知道它在基因组中的位置 都能被用作STS标签 STS是基因组中较短的用于定位的序列 3 RAPD RandomamplifiedpolymorphicDNA 随机扩增多态性DNA是一种建立在PCR基础之上的可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子标记方法 以若干条人工合成的随机引物 通常为10nt 对所研究的基因组DNA进行PCR扩增 扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 溴化乙锭染色后 在紫外透视仪上检测多态性 一般一条引物可扩增6 12条DNA片段 RAPD不涉及印迹杂交 放射性自显影等技术 因此简便易行 4 SCAR Sequence characterizedamplifiedregion 序列特异性扩增区基于RAPD的分子标记技术 其基本流程为 先进行RAPD分析 然后将目标RAPD片段回收 克隆和测序 再根据所测序列设计特定引物 此引物通常包含原RAPD引物 长度为20 24bp 再用此新引物对所研究的基因组进行PCR扩增 从而可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来 5 AFLP Amplifiedfragmentlengthpolymorphism 扩增片断长度多态性是一种基于PCR反应以选择性扩增基因组DNA限制性片段的DNA指纹技术 基因组DNA先用限制性内切酶切割 限制性片段由2种酶切割产生 一种是罕见切割酶 一种是常用切割酶 然后将双链接头连接到DNA片段的末端 接头序列和相邻的限制性位点序列 作为引物结合位点 AFLP结合了RFLP和PCR技术特点 具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性 6 SSR或STR SimpleSequenceRepeats SSR 简单序列重复 又称微卫星DNA MicrosatelliteDNA 或短串联重复序列 shorttandemrepeats STR 是一类由几个核苷酸 一般为2 6个 为重复单位簇集而成的长达几十个核苷酸的串联重复序列 广泛分布于真核生物基因组中 具有高度多态性 微卫星在结构上的最大特点是其两端序列较保守 人们根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物 用来PCR扩增重复序列本身 从而揭示微卫星的多态性 SSR被称为继RFLP之后的第二代分子遗传标记 7 SSLP Simplesequencelengthpolymorphism 简单序列长度多态性根据串联重复排列的微卫星基序两侧的单一序列设计引物 对微卫星序列进行PCR扩增 由微卫星基序重复数目的变异而产生多态性 8 ISSR inter simplesequencerepeats 间简单序列重复根据基因组中广泛存在的微卫星序列设计通用引物对基因组DNA进行PCR扩增 引物可以是微卫星基序本身 ISSR保留了SSLP的优点 同时还有效地克服了SSLP标记中引物设计困难的缺点 9 SSCP Single strandconformationpolymorphism 单链构象多态性单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于其分子量和空间构象 双链DNA经变性后 再进行非变性胶电泳 在非变性胶中 单链DNA可形成二级结构 而该结构又与其碱基序列有关 通过电泳 不同的单链DNA被分离 单链DNA在凝胶中的位置差异反映了其序列组成的差异 从而呈现单链构象多态性 SSCP可用于检测点突变 PCR SSCP是将PCR与SSCP相结合的用于检测PCR产物DNA片段中的点突变的技术 其步骤为 用一对引物对基因组DNA进行扩增 PCR产物变性后 再经非变性胶电泳 尽而检测单链点突变 该技术在人类遗传病和癌症的点突变位点的检测中曾发挥重要作用 10 SNP Simplenucleotidepolymorphism 单核苷酸多态性在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性 只涉及到单个碱基的变异 转换或颠换 也可由碱基的插入或缺失所致 被称为第三代分子遗传标记 SNP检测方法 测序 RFLP SSCP 等位基因特异的寡聚核苷酸杂交 ASO 基因芯片技术等 PCR SSCP的应用举例PCR扩增不同样本的DNA片段 PCR产物的变性 非变性凝胶电泳 根据单链构象多态性检测点突变 SNP技术的应用 用于构建高密度遗传连锁图谱 进行致病基因以及人类起源 迁移 进化的研究 用于家畜遗传育种研究以及遗传图谱和物理图谱的绘制 99 9 的一致性 0 1 的差异 从志愿者身上取得了DNA样本 这些志愿者分别是欧洲 非洲和中国人的后裔 2 1RACE技术 rapidamplificationofcDNAends cDNA末端的快速扩增 RACE是根据已知序列以PCR快速扩增cDNA的5 和3 末端序列的技术 可分为3 RACE和5 RACE两种 3 RACE和5 RACE都需先将mRNA反转录为第一链cDNA 在3 RACE中 cDNA的合成起始于mRNA的ploy A 尾 由含有oligo dT 的接头引物引发合成第一链cDNA 然后用3 锚定引物和一个5 基因特异性引物 genespecificprimer GSP 进行扩增 可得到cDNA的3 末端序列 在5 RACE中 先用一个GSP引发第一链cDNA的合成 然后在第一链cDNA的3 端加上人工锚定序列 最后用5 锚定引物和GSP下游引物进行扩增 得到cDNA的5 末端序列 最后 从2个有相互重叠序列的3 和5 RACE产物中获得全长cDNA 或者通过分析RACE产物序列 合成相应引物 再扩增出全长cDNA 意义 根据已得到的不完整的cDNA序列设计引物对mRNA的3 端和5 端进行扩增