细菌耐药性的非特异性机制

第九章 其他类别的抗生素及细菌耐药性第一节 安莎类抗生素及细菌耐药性,一、安莎类抗生素的结构特征,安莎环类是由一类在化学结构上类似、以一个脂肪链连接着一个芳香核的两个不相邻碳原子的“安莎桥”结构为特征的抗生素所组成:它又可以根据化学结构中组成芳香核的不同而分为两族。如芳香核为苯环,则称为苯安莎霉素族(benzoquinoid),包括格尔德霉素(geldanamycin)、柄型菌素(ansamitocins)等;如芳香核为萘环，则为萘安莎霉素族(naphthoquinoid)，包括利福霉素、链伐立星、卤霉素(halomicin)等;康乐霉素是由我国发现的具有免疫抑制活性的安莎类抗生素。,利福布汀 利福喷汀,格尔德霉素 柄型霉素,二、利福霉素类抗生素的应用,二、利福霉素类抗生素的应用,利福平适用于耐药结核杆菌、耐药金黄色葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、肠球菌等引起的感染;如:肺结核、泌尿生殖系统结核、肺炎、淋巴结核、肺脓疡、麻风病等;其与异烟肼、乙胺丁醇合用有协同作用，可延缓耐药性的产生。/ydfdfz/,二、利福霉素类抗生素的应用,利福布汀在体外对幽门螺杆菌（Helicobater pylori）的抑制浓度非常低;幽门螺杆菌是一种重要的人体致病菌，估计它能够感染50%左右的人群。受其感染后会引发很多胃肠道疾病如：胃炎、胃溃疡和胃癌等，且这种细菌一旦在胃黏膜生存，则受感染的病人将会终生携带，除非服药治疗;当临床上使用其它一些抗菌药物治疗这种感染失败时，往往采用利福布汀、阿莫西林和质子泵抑制剂三联治疗方案能够有效地控制这种感染，且不管这些细菌对其它抗菌药物是否产生耐药性。,二、利福霉素类抗生素的应用,利福定口服后经胃肠道迅速吸收,各组织分布以肝脏和胆汁为最高,人体血浓度在服药24h达到高峰;因其副作用较小,对结核分枝杆菌有很强抑菌或杀菌作用,故主要用于耐药结核分枝杆菌感染;在治疗结核病时,应与其它抗结核药物合并使用,以防止耐药菌之产生并增强疗效。,二、利福霉素类抗生素的应用,利福喷汀与利福平、利福定之间有交叉耐药作用,但它对其它类型的抗结核药的耐药菌株仍有效;临床上它可用于结核病、麻风病、急性肺部感染、化脓性皮肤病、沙眼病等治疗。,三、 细菌对利福霉素类抗生素的产生耐药性的作用机制,利福霉素类抗生素的作用机制是通过抑制RNA聚合酶的活性，来干扰细菌DNA的正常转录，从而达到抗菌的目的;对M.smegmatis蛋白的体内外研究表明，利福平通过对RNA聚合酶全酶的交互作用来干扰转录的开始。,三、 细菌对利福霉素类抗生素的产生耐药性的作用机制,编码分支结核杆菌和麻风分枝杆菌（M.leprae） RNA聚合酶亚基、，和的基因分别为rpoA、rpoB、rpoC和rpoD。最近的研究表明，编码的基因rpoD发生突变，影响对启动子的识别。,三、 细菌对利福霉素类抗生素的产生耐药性的作用机制,细菌对利福平和利福布汀产生耐药性的主要原因是由于依赖于DNA的RNA多聚酶（RpoB）-亚基的氨基酸发生变异;大肠埃希菌rpoB 基因密码子中的第146、507-533、563-572和687位，或结核分支杆菌密码子的507-533（基因簇区域）位发生变异能够诱导生产细菌耐药性;从对利福平耐药的细菌的研究发现，其96%的细菌的rpoB 基因发生了变异。其中有40%左右的细菌是由于RpoB 密码子531位的丝氨酸变为亮氨酸所致；有3%左右的细菌是由于526位的组氨酸变为精氨酸所致。,四、利福霉素对逆转肿瘤细胞抗性的作用,利福平能够抑制多药抗性蛋白（MRP）的外排机制，积累calcein，一种MRP的荧光颜料底物，在MRP过量表达的CGC4/ADR细胞内的量;另外，利福平能够增强长春新碱，同样为MRP底物的抗癌药物在这种肿瘤细胞内的积累量。但在MRP非过量表达的细胞中，利福平没有这样的作用，说明这种抗结核杆菌的药物具有特异性的逆转外排机制的功能;除利福平外，利福霉素SV和B具有同样的作用，说明安莎类的结构特征具有抗外排机制的特异性。,第二节 其他类别的抑制细菌细胞壁合成的抗生素,其他类别的抑制细菌细胞壁合成的抗生素,-内酰胺类抗生素和糖肽类抗生素是临床上非常重要的抗细菌抗生素,其作用机制是抑制细菌细胞壁的合成;除此之外,像磷霉素、杆菌肽和环丝氨酸等也是作用于细菌细胞壁合成的抗生素,但尽管如此,其作用位点和机制是不尽相同的,图所示为这些抗生素的作用位点。,细菌细胞壁合成及抗生素作用位点示意图,一、磷霉素-来源,磷霉素是由西班牙CEPA公司的Hendin等从费氏链霉菌(Streptomyces fradia)发酵液中分离得到的一种分子量较小的(MW=138.06)广谱抗生素;其它链霉菌如绿色产色链霉菌(Streptomyces uiridochromogenes)和威德摩尔链霉菌(Streptomyces wedmorems)等也能产生该物质;1969年美国默克公司Christensen等首先作了结构测定并合成了该化合物;由于该化合物的合成工艺比较简单,故很快代替了发酵法用于生产;该产品于1975年开始投入生产并应用于临床。,一、磷霉素-作用机制,磷霉素的作用部位目前尚有争议,可能与磷酸烯醇丙酮酸竞争UDP(uridine diphosphate)-NAG(二磷酸尿喧啶核苷-N-乙酰葡糖胺)转移酶,抑制了粘肽合成的第一步,使UDP-NAG不能转化为UDP-NAMA;由于磷霉素与UDP-NAG转移酶的亲和力较小，故必须使用高浓度的磷霉素才能起抑制作用。,磷酸烯醇式丙酮酸与磷霉素的化学结构,一、磷霉素-抗菌活性,磷霉素的抗菌谱很广，对大多数革兰氏阳性菌和阴性菌有作用，为一种杀菌剂;与一些常用的已知抗生素不产生交叉耐药性，且有协同作用;磷霉素的毒性低，易通过血脑屏障进入脑脊液，对耐药性金葡菌、大肠埃希氏菌、变形杆菌、铜绿假单孢菌、沙门氏菌等引起的感染均有效,可用于严重的全身性感染如败血症、脑膜炎、肺炎及尿道、肠道、皮肤软组织等的感染。,二、杆菌肽-来源,杆菌肽最早是由Johnson等于1943年从一个受伤的7岁的小女孩,Margaret Tracy，身上分离的菌株的培养物中发现的，故其名称为Bacitracin(融合有病孩的名字)，目前的生产菌株为枯草芽孢杆菌(Bacilus Subtilis)。,二、杆菌肽-结构特征,杆菌肽发酵产物中的主要成分为杆菌肽A，其也是生物活性最强的组分;目前使用的杆菌肽的生物效价(游离碱)为7074I/mg。杆菌肽的另一个特性是其水溶液通过加适当的二价金属离子，能使杆菌肽与之结合而被析出，而二价离子对杆菌肽发挥抗菌作用是必需的;研究表明最具活性的离子是Cd2+、Mn2+和Zn2+，而杆菌肽分子中的二氢噻唑环和组氨酸残基的咪唑环中3位氮为二价金属离子的结合部位。因为杆菌肽锌盐最为稳定，故目前应用的杆菌肽盐为其锌盐，锌的含量为46%。,杆菌肽A的化学结构,杆菌肽的作用机制是阻止细胞膜上脂质体的再生，因而导致UDP-NAMA-五肽在细胞浆内堆积,从而影响细胞壁粘肽的合成。,三、环丝氨酸和邻甲氨酰-D-丝氨酸,D-环丝氨酸和邻甲氨酰-D-丝氨酸的结构与D-丙氨酸相似，可干扰丙氨酸消旋酶的作用,使L-丙氨酸不能变成D-丙氨酸，并可阻断两分子D-丙氨酸连接时所需D-丙氨酸合成酶的作用。,D-环丝氨酸、邻甲氨酰-D-丝氨酸的化学结构式及其作用部位,四、多黏菌素,多黏菌素为一组环肽类抗生素，由Bacillus polymyxa产生;目前已经分离得到了多黏菌素A、B1、B2、C、D1、D2、E、F、 K、M、 P、S 和 T等物质（其中一些化合物的结构如图所示）。,一些多黏菌素类化合物的化学结构,一些多黏菌素类化合物的化学结构,第三节 其他类别的抑制细菌蛋白质合成的抗生素,一、四环类抗生素结构特性,一、四环类抗生素抗菌特性,四环类抗生素为广谱抗生素,对多种革兰氏阳性球菌、杆菌，革兰阴性球菌、肠杆菌、布鲁菌、霍乱弧菌等都有抗菌作用；对螺旋体,立克次体和一些原虫以及大型病毒也有作用；四环素抗菌作用的主要机制是阻断多肽链的延长。,一、四环类抗生素耐药机制,最频繁地发生的革兰阴性细菌对四环素类抗生素耐药是由Tet阻遏物识别作用所触发的；其引起阻遏物-操作子DNA复合物的缔合作用,使耐药蛋白质TetA能够得以表达,TetA负责四环素的活性外排；Tet阻遏物与四环素-镁复合的二聚体的2.5A分辨度的结晶结构揭示着详细的药物识别作用。,四环素与TetRD之间相互作用,一、四环类抗生素抗耐药菌结构类似物,根据细菌对四环素产生耐药性的作用机制，通过对四环素结构的化学修饰，已经得到了一些具有外排蛋白抑制剂功能的结构类似物；13-（3-氯丙基）硫-5-羟基-6-脱氧四环素等第三代四环类是很好的外排蛋白抑制剂：它与四环素合并使用对许多四环素耐药细菌具有协同作用，如对具有A组或B组Tet蛋白的大肠埃希氏杆菌、具有K组蛋白的金黄色葡萄球菌和具有L组蛋白的粪肠球菌等都具有很好的协同作用。,13-（3-氯丙基）硫-5-羟基-6-脱氧四环素的化学结构,甘氨酰四环素,Tigecycline，又称tigicycline，即GAR-936，中文名：替加环素。是Wyeth Pharms (Wyeth-Ayerst)公司开发的第三代四环素甘氨酰四环素，为9-(N-叔丁基甘氨酰)胺基米诺环素，2005年6月5日已获美国FDA按P类(比上市品种具有明显的改善)加快审查批准(N021821)，商品名Tygacil；适应症为复杂的皮肤或皮肤结构感染(cSSSI)与内腹腔感染(cIAI)。,甘氨酰四环素,研究表明，tigecycline具有强效的离体抗菌活性，可抑制广泛的致病菌，包括对早期四环素有耐受性的细菌；在体内的保护作用，尤其是抗四环素耐受菌作用，与其离体活性一致： 如，对临床分离的37种万古霉素耐受的肠球菌、26种甲氧西林耐受的金色链霉菌和30种高水平的青霉素耐受的肺炎链霉菌的抑制浓度分别在1、2或0.25g/mL，2g/mL的tigecycline与0.25g/mL的奎宁始霉素无相互作用。,甘氨酰四环素,发现甘氨酰四环类衍生物不仅对四环类敏感菌有效，且对含有核糖体修饰因子tetM和tetO耐药菌和外排蛋白tetA-E、tetL和tetK耐药菌有效，即具有广谱抗耐药菌的优良特性；这些9位甘氨酰氨基取代的衍生物来源于二甲胺四环素、强力霉素（脱氧四环素）和脱甲氧四环素；它们对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有效，且对二甲胺四环素、万古霉素和-内酰胺抗生素耐药的耐药菌也有效。,甘氨酰四环素,其中万古霉素广泛用于治疗所选的格兰氏阳性菌感染，奎宁始霉素与利奈唑烷/胺(linezolid)则是FDA近年批准的用于治疗严重的万古霉素耐受菌感染，但近期也发现了二者耐药菌；青霉素耐受的肺炎菌是特征的多药耐菌，常表现为对大环内酯类、头孢类、甲氧苄氨嘧啶/磺胺恶唑，及其它抗菌药的敏感性减小；对喹诺酮类的抗药性近来也增加。因此，tigecycline可能像linezolid应用于解决日益紧迫的抗药性问题。,二、氯霉素来源,氯霉素是在美国于1947年从委瑞内拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)的培养物中分离得到的第一个广谱抗生素；由于其化学结构比较简单，故于1949年使用化学合成法制备获得成功；以后各国相继发表了各种合成工艺，并很快应用于生产而代替发酵法。,二、氯霉素结构特征,从氯霉素的化学结构可知，其有2个手性碳原子,因而有4种旋光异构体，其中仅是D(一)苏阿糖型的有抗菌活性，为临床使用的氯霉素；临床所用的合霉素(syntomycin)是氯霉素的外消旋体，疗效为氯霉素的一半；目前临床应用的一些氯霉素结构类似物有:甲砜霉素(thiamphenicol)、甲砜霉素甘氨酸酯、无味氯霉素即氯霉素棕榈酸酯(chloramphenicol palmitate)、琥珀氯霉素(chloramphenicol succinate)、氯霉素甘氨酸酯、氯霉素硬脂酸酯和氯霉素精氨酰琥珀酸等。,二、氯霉素结构特征,二、氯霉素抗菌特性,在临床上,氯霉素类药物主要用于由革兰氏阳性菌引起的感染,但对革兰阴性菌和铜绿假单胞菌也有效；氯霉素对大多数厌氧菌、立克次氏体、衣原体和支原体具有活性；特别是由于氯霉素对治疗立克次氏体病和复发型流行性斑疹伤寒等具有特殊疗效而一直具有相当的生命力。,二、氯霉素不良反应,尽管氯霉素在极低的浓度下表现出广谱抗菌的特性,但由于其在临床上表现有灰婴综合症和再生障碍贫血的毒性作用,使其使用的剂量、周期、范围等受到限制,在一般情况下都不考虑使用或尽可能少的使用；由氯霉素产生的再生障碍贫血的毒性作用一种是依赖于所用的剂量,另一种则与所用剂量无关且是不可逆的。后一种往往是致死性的,其发病常常是延缓出现,且其发病原因尚不清楚。这种危险性不超过二万分之一。,二、氯霉素耐药机制,细菌对氯霉素产生耐药性的主要作用机制是细菌产生的O-酰化酶将氯霉素分子中的游离羟基乙酰化所致；氯霉素酰化酶（chloramphenicol acetyltrasterase, CAT）基因广泛地存在于革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌中；所有的CAT多肽的分子量为24-26kDa且通常为同型三聚体3和3 ，但有两个CAT突变体为异型四聚体23和2；氯霉素耐药细菌往往含有一个以上的cat基因。,二、氯霉素耐药机制,钝化酶分子中的195-组氨酸中N2 将氯霉素分子中C-3醇羟基的质子去除，氯霉素的氧反应结果去攻击酰基-CoA中酰基的羰基碳；由此产生的氯霉素四面体中间体与148-丝氨酸共享一个氢原子，其两个氧原子间的距离推测为2.4A；这种短暂的四面体结构最终生成3-O-酰基氯霉素和HS-CoA，同时生成195-组氨酸以催化下一轮酰化反应。,二、氯霉素耐药机制,二、氯霉素耐药机制,三、甾类抗生素结构特征,甾类抗生素是指具有羧链孢烷骨架的羧链孢酸类化合物和其它一些甾体衍生物；从其化学结构上看,大致可分为四种类型,即1）羧链孢酸类（fusidic acid）：2）多孔蕈酸类（polyporenic acid）；3）绿毛菌素类(uiridin)；4）抗生素A-25822(antibiotic A-25822)。,三、甾类抗生素羧链孢酸的结构特征,三、甾类抗生素抗菌特性,对革兰氏阳性菌和分枝杆菌有较强的抗菌作用,对青霉素敏感菌和耐药菌也有较强的抑菌作用；临床上作为有价值的二线药物,用于治疗青霉素耐药的金黄色葡萄球菌的感染等；它和青霉素、四环素等其它抗生素还有协同作用。,三、甾类抗生素作用机制,其作用机制是对氨基酸转移酶有选择性抑制作用,从而阻断细菌蛋白质的合成；实验证明,羧链孢酸是延长作用因子EF-G(原核细胞)或EF-Z(真核细胞)的选择性抑制剂,因而它抑制氨基酸在核糖体上从氨乙酰基-tRNA转化成蛋白质。,羧链孢酸及阻断延长因子G蛋白的功能,四、嘌呤霉素,嘌呤霉素是由白黑链霉菌(Streptomyces alboniger)产生的3-脱氧嘌呤核苷抗生素。在结构上它与氨酰-tRNA的3-末端相似。嘌呤霉素是革兰氏阳性细菌的强烈抑制剂,它是肽合成的一种有效抑制剂,所以对高等动物的毒性也颇大,没有临床应用价值,但它是生物化学和分子生物学研究领域的优秀的不可替代的研究工具,它已被广泛应用于哺乳动物和细菌无细胞核糖体和非核糖体系统中蛋白质生物合成机理的研究。,四、嘌呤霉素,嘌呤霉素的主要生物化学特性是:嘌呤霉素通过催化不完全肽链从肽酰-tRNA一信使核糖体复合物上释放出来,而起着不依赖密码子的氨酰-tRNA的作用,并和核糖体的肽酰-tRNA位上新生多肽反应,起着阻抑蛋白质合成的作用。即它能和结合在P位的肽酰-tRNA反应,生成肽酰嘌呤霉素复合体,并从核蛋白体上游离。,嘌呤霉素氨酰-tRNA的3-末端,五、Mupirocin,Mupirocin为异亮氨酸的结构类似物，其作用机制为通过抑制异亮氨酰RNA合成酶，阻止异亮氨酰掺入到正在合成的肽链中去；尽管该药物对人体没有太大的毒性，但由于进入人体内的药物被快速地代谢为无活性的形式，因此，临床上以外用制剂形式用于治疗皮肤感染，而难以治疗系统性感染疾病。,Mupirocin的化学结构,第四节 有关化学合成类抗细菌药物的作用机制及细菌耐药性,一、磺胺类药物的作用机制及细菌耐药性,发现：20世纪初，人类已发明和拥有了一些疗效显著的化学药物，可以治愈原虫病和螺旋体病，但对细菌性感染则束手无策，为此，人们试图研制一种新药以征服严重威胁人类健康的病原菌；这一难关终于在1932年被32岁的德国药物学家、病理学家、细菌学家格哈德多马克(G. Domagk)所攻破。,G.Domagk, de origen alemn, descubre la sulfamida. Publica el artculo “Contribucin a la quimioterapia de las infecciones bacterianas” donde explicaba como un producto, especie de derivado del azufre, contena extraordinarias propiedades bactericidas: las sulfamidas,百浪多息第一种磺胺药物,多马克及其合作者经过千百次试验，发现了一种在试管内并无抑菌作用的、名为“百浪多息”（prontosil）的桔红色化合物4氨磺酰2，4二胺偶氮苯的盐酸盐，对感染链球菌的小白鼠疗效极佳，且毒性很小；多马克对已感染上了链球菌的自己的小女儿作人体实验，服用了“百浪多息”，挽救了她的生命；第一种磺胺药物“百浪多息”的发现和临床应用的巨大成功，使得现代医学进入化学医疗的新时代，人们更有信心解决传染病的治疗问题；1939年，多马克获得了诺贝尔生理学和医学奖。,（一）磺胺类药物的作用机制,“百浪多息” 应用于临床后不久，法国巴斯德研究所的特雷富埃(Trefouel)夫妇及其同事揭开了“百浪多息”在活体中发生作用之谜；他们认为“百浪多息”在体内可转化为具有制菌活性的磺胺-氨基苯磺酰胺(简称磺胺, SN)。,百浪多息的化学结构,磺胺结构通式,（一）磺胺类药物的作用机制,1940年,Wood和Fildes研究了磺胺的作用机制，并阐明由于它的分子结构、电荷分布与细菌生长所需要的对氨基苯甲酸（PABA, para-amino benzoic acid）高度相似，因而两者发生了竞争性拮抗作用；之后，美国的 Lederle实验室的学者发现PABA是叶酸的一个组分，磺胺能与PABA互相竞争二氢蝶酸合成酶，从而妨碍叶酸合成。,（一）磺胺类药物的作用机制,四氢叶酸(tetrahydrofolic acid ,THFA,CoF)是一个传递一碳单位的辅酶，而一碳单位与氨基酸代谢密切相关，还参与嘌呤和嘧啶的生物合成及S-腺苷甲硫氨酸的生物合成，其在生命代谢中是必不可少的；很多细菌不能利用叶酸作为前体，需要外源的PABA合成四氢叶酸，如细菌缺乏四氢叶酸，影响核酸合成，则使细菌生长繁殖受到抑制，再利用机体各类防御机能就可克服细菌感染。,PABA 磺胺,叶酸,四氢叶酸的合成过程及磺胺类药物的作用位点,磺胺类药物的作用机制,1）磺胺是PABA（正常底物）的结构类似物，可作为竞争性抑制剂与二氢蝶酸合成酶结合，阻断了叶酸的合成；2）二氢蝶酸合成酶将磺胺作为底物形成一种稳定的磺胺二氢蝶啶类似物，这会使得细胞内二氢蝶啶酰焦磷酸的含量减少，由此降低了二氢叶酸合成酶的反应速率，导致细胞中四氢叶酸浓度降低。这样就使那些能利用二氢蝶啶和PABA的细菌无法合成足够的叶酸，于是生长受到抑制；抗菌增效剂甲氧苄胺嘧啶能抑制二氢叶酸还原酶的活性，使二氢叶酸无法还原为四氢叶酸，因而也阻碍了叶酸的代谢和利用。,磺胺类药物的作用机制,人类因为没有二氢蝶酸合成酶、二氢叶酸合成酶及二氢叶酸还原酶，故不能利用外界提供的PABA自行合成四氢叶酸，亦即必须在营养物中直接提供此类物质，因而对二氢蝶酸合成酶的抑制剂磺胺药不敏感，对二氢叶酸还原酶抑制剂TMP也不敏感；这就是为什么磺胺类药物具有选择性毒力。,（二）细菌对磺胺类药物产生耐药性的作用机制1、二氢蝶酸合成酶发生变异的耐药机制,1）染色体介导的磺胺抗性（1）点突变 从抗性大肠埃希菌菌株中分离到突变的染色体dhps基因，与野生型比较仅有一对碱基的差异，即Phe28Ile即引起了对磺胺的抗性；而在金黄色葡萄球菌中对磺胺抗性的突变涉及到14个位点的突变。,1）染色体介导的磺胺抗性（1）点突变,Maskell等对肺炎双球菌磺胺抗性株的研究表明编码DHPS的染色体基因sulA上有36个碱基的重复，即在Arg58Tyr63间有一、二个氨基酸的重复；还有研究表明此类菌对TMP-SMZ抗性是由于Arg58、Pro59的重复以及Gly60、Ser61间插入了一个Arg。,1）染色体介导的磺胺抗性 （2）基因重组,在脑膜炎奈瑟氏菌中，已发现磺胺抗性与染色体突变有关；多数临床分离的磺胺抗性株与敏感株比较，约有10%的差异，但它们DHPS的C-端、N-端以及中心的424对碱基是相同的，可以认为抗性株的这种差异是由于水平基因转移(horizontal gene transfer)或同源重组(homologous recombination) 及非同源重组（illegitimate recombination）造成的，而并非点突变的结果。,1）染色体介导的磺胺抗性 （2）基因重组,同源重组使得受体菌dhps基因邻近的限制性位点与供体菌相应位点发生了大段DNA交换；非同源重组导致了供体dhps基因整合到供体菌中，造成dhps基因重复；对抗性基因序列的分析表明抗性菌dhps基因有一高度保守序列，即插入了6个核苷酸，从而使酶多了两个氨基酸，若用点突变的方法去除这两个氨基酸，则菌株对磺胺敏感。,1）染色体介导的磺胺抗性 （2）基因重组,Swedberg等研究人员将酿脓链球菌磺胺抗性株的染色体DHPS克隆测序，与敏感株相比有30个氨基酸（占11.3%）发生了变化，他们也得出同样的结论，这种获得性耐药并非点突变累积的结果，可能是由于某种重组机制造成的。,2） 质粒介导的磺胺抗性,已有研究表明革兰氏阴性肠细菌中出现的临床磺胺抗性多为质粒介导，这是由于DHPS靶酶抗性突变体的存在所致, R细菌可从R细菌中获得这种抗性基因；已分离出编码DHPS的两种质粒基因，sul和 sul，这两种基因有57%氨基酸相同；发现sul基因与其他抗性基因相连定位于Tn21家族的转座子上，sul基因通常位于属于IncQ家族(RSF1010)的小质粒中或 pBP1质粒中；,2） 质粒介导的磺胺抗性,在偶发分支杆菌（Mycobacterium fortuitum）中还发现了sul 基因，实际上它是因sul基因的缺失而形成的突变体；由质粒编码的DHPS较染色体编码的酶分子量低，对热不稳定，虽然两者结合底物PABA的能力相同，但质粒编码的酶结合磺胺的能力较染色体酶低10,000倍，由此导致了抗性的形成。,2、二氢叶酸还原酶发生变异的耐药机制1）染色体介导的TMP抗性,（1）抗性基因插入： 有报道从11株肺炎双球菌TMP抗性株（MIC64512g/ml）中分离得到的DHFR基因，再经PCR扩增测序，发现有两种主要的突变类型，这两种类型中有6处发生了同样的变化，分别是Glu20Asp, Pro70Ser, Gln81His, Asp92Ala, Ile100Leu, Leu135Phe；点突变试验表明Ile100Leu的突变导致TMP的ID50（50%inhibitory doses, 50%抑制剂量）增加50倍。抗性株核苷酸顺序上这些高度保守的位点被认为是基因编码的抗性DHFR在种内、种间转化重组的结果。,1）抗性基因插入：,另有研究表明在高水平TMP抗性肠杆菌中，普遍存在着由转座子Tn7介导的型DHFR，Tn7可定位于染色体中，使染色体DHFR过量合成，如大肠埃希菌 T118菌株酶活提高了80倍，对TMP的抗性达1000mg/L 。,（2）TMP作用靶酶的染色体基因突变：,在核糖体结合区，发现有7个碱基发生了变化，其中的两个碱基造成了与核糖体16S RNA 3-末端的5个碱基的互补；在启动子的-10区和启动密码子之间+9位插入了一个腺嘌呤。这种遗传上的改变使得转录和翻译更加有效，增加了mRNA的表达。所有这些突变都使得菌株可以生存于含有抗叶酸药物的环境中；可以得出结论，16srRNA 3-端翻译控制区的同源性以及蛋白质起始密码子与mRNA核糖体结合位点的距离都会影响翻译过程，高表达的基因在翻译过程中通常使用含量丰富的tRNA。,（2）TMP作用靶酶的染色体基因突变：,还发现在结构基因中Glu69Lys, Asp77Asn。因此，可以认为靶酶结构的变化及过量的产生可提高TMP抗性；将流感杆菌抗性株及敏感株的DHFR纯化，并进行生化方面的研究，结果表明两株菌催化二氢叶酸和NADPH的Km值相近，敏感菌的IC50（抑制50%DHFR的活性所需的TMP浓度）为1nM，而抗性株的IC50为 300nM；所以抗性株的DHFR突变降低了靶酶对TMP的亲和性。,（2）TMP作用靶酶的染色体基因突变：,酶性质的改变可以是磺胺类耐药的主要原因，通过遗传分析进一步表明，一个基因的不同突变可使同一种酶产生几种改变形式，即按各种不同的方式改变酶的性质。,2）质粒介导的TMP抗性 -（1）质粒介导的DHFR的多种类型,DHFR型有两种不同的亚型：DHFRa由13.6kb转座子Tn7介导，它同时还具有链霉素抗性，为二聚体蛋白;DHFRb由3kb转座子Tn4132介导，仅具有TMP抗性，为单体蛋白;这两种酶均对热不稳定，DHFR的IC50较接近，DHFR型引起的TMP抗性普遍存在于门诊及住院病人中。,（1）质粒介导的DHFR的多种类型,DHFR有三种不同的亚型，都为四聚体（亚单位8.3-8.5kDa）;型酶对热稳定，且对TMP有高水平抗性，IC50较大肠埃希菌染色体DHFR高106倍（IC501mM）;型酶的多肽链仅有78个氨基酸;DHFRa较DHFR更为普遍，两种类型可同时存在。,（1）质粒介导的DHFR的多种类型,在鼠伤寒沙门氏菌中分离到型DHFR，此菌在动物中流行，偶而感染人体;DHFR型为单体蛋白，分子量为16.9kDa,对TMP相对敏感;DHFR型是质粒介导的分子量最大的酶（46.7kDa），此酶对TMP抗性不强，但经TMP诱导后，酶活是染色体酶的600倍。在斯里兰卡分离到的TMP抗性株中DHFR型占优势，IC50较染色体酶高1000倍;在引起小猪腹泻的大肠埃希菌菌株中首先发现了dhfr基因，它位于三个不同的结合质粒中(pCJO01, pCJO02 , pCJO03 )，在TMP选择压力下，形成了抗性传播的有效载体，dhfr基因介导的对药物的抗性水平为250mg/L。,（2）水平基因转移产生的抗性,病原菌中TMP抗性基因的出现很可能是因为与某种微生物发生了水平基因交换;细菌染色体DHFRs具有多样性，其中也包括低水平的抗TMP基因;运用包括特异性位点重组等复杂的转运机制使细菌获得了抗性基因;其实，这种复杂的机制同样已在其他一些过程中出现，如噬菌体的溶源现象，表面抗原变异，环状染色体的单体化等。,（3）DNA 序列组件(cassette)介导的抗性,dhfr基因定位于一个可转移单位上，称作DNA组件,因为它的可移动性，能在不同的整合子（integron）间进行交换，因此整合子可作为抗性基因的载体，导致革兰氏阴性菌中DHFR基因广泛传播;在微生物细胞中，整合子是控制着附属基因 （accessory genes）的重组系统，它由两个保守区和一个可变区组成，可变区包括一个或多个插入DNA组件，相邻基因编码了重组酶;这种组件与GTTPuPu(Pu为嘌呤)相接作为同源交换区。很多遗传过程中都观察到因转座子的移动携带了整合子，如Tn5090和Tn7。,（3）DNA 序列组件(cassette)介导的抗性,用整合子的整合酶基因作为探针，通过PCR技术，研究整合子中DNA组件的组成;现已发现有9个不同类型的TMP抗性DNA组件，这在整合子中观察到的全部抗性组件中占了绝大多数;这种组件介导的TMP抗性似乎比非DNA组件介导的抗性更为普遍。DHFR家族1中所有成员都位于DNA组件中，家族2亦是如此;dhfr 基因也在组件中被发现，而dhfr基因例外，它位于质粒pDGO100的整合子中。,(4) 非DNA组件介导的TMP抗性,广宿主范围的小质粒是普遍存在的，往往携带有磺胺和氨基糖类抗生素的抗性基因。在TMP抗性基因中仅发现dhfr基因紧密结合于质粒pAZ1中的基因簇中。IS26属于插入序列家族中的一员，推测可因共整合而移动。 已知Tn5091是唯一与IS26相连的元件（element）, 其上包含有TMP抗性基因（dhfr）。在几个不同的分离株中都发现了这种抗性基因，可以认为这是经元件传播的。,3、其它抗性机制,1）代谢途径改变。由于基因突变，使得这类菌不能使脱氧鸟苷酸甲基化成胸腺嘧啶核苷酸，而需要外源的胸苷。这种突变的结果使得细胞不再需要DHFR合成四氢叶酸，所以不受TMP的抑制;2）早年对金黄色葡萄球菌的研究发现抗性株能过量产生PABA。,3、其它抗性机制,3）大肠埃希菌中还存在有对磺胺药物的主动转运机制。从大肠埃希菌磺胺抗性株中分离出一种sur基因，其编码的产物类似于反转蛋白，它依赖质子偶联交换产生的质子驱动力将药物外排;4）TMP的不渗透性。在肺炎克氏杆菌、粘质沙雷氏菌及肠杆菌中已发现由于外膜蛋白的改变产生了包括TMP 在内的多药抗性。,3、其它抗性机制,5） 固有耐药性。有多种细菌存在着内源性TMP抗性，与大肠埃希菌相比，乳酸杆菌的DHFRs对TMP的敏感程度要低，啤酒片球菌(Pediococcus cerevisiae) 对TMP的IC50要高出1000倍，脆弱拟杆菌及梭状芽孢杆菌(Clostridium spp)等厌氧菌对TMP更加不敏感，从其中分离纯化的DHFR与大肠埃希菌相比，IC50要高出几百至上千倍;铜绿假单胞菌可渗透突变株尽管靶酶(DHFR)的表达活性与野生株相同 ，但对TMP非常敏感。铜绿假单胞菌及其他一些假单胞菌对TMP的抗性是由于细胞壁通透性较低的缘故。,3、其它抗性机制,6）有的病原菌如沙门氏菌能对多种抗生素产生抗药性，它的形成与菌体R因子或跳跃因子以及致命毒素的产生有密切关系。特别是当抗药性致病菌侵染宿主后大量繁衍，形成“菌膜”（菌体群），而上述这些因子或毒素通过菌体繁衍，彼此交流信息，相互传播，为其自身的生存与发展形成强力抗药性或强毒力的生物武器.,二、喹诺酮类药物的作用机制及细菌耐药性（一）喹诺酮类药物的作用机制,喹诺酮类抗菌药物的作用机制涉及到其与最早发现的作用靶位DNA促旋酶以及拓扑异构酶IV（与拓扑异构酶II相关）发生交互作用;不同细菌中的这两种酶对很多喹诺酮类药物的敏感性是不同的:一般地，革兰氏阴性菌中的DNA促旋酶往往对药物的敏感性大于拓扑异构酶IV对药物的敏感性，而革兰氏阳性菌中的情况正好相反。,二、喹诺酮类药物的作用机制及细菌耐药性（一）喹诺酮类药物的作用机制,这类抗菌药物对细菌作用的标志是药物通过与DNA、DNA促旋酶或拓扑异构酶IV发生交互作用形成三元复合物，药物的这种作用诱导DNA和拓扑异构酶IV发生构型改变，从而导致这种酶对DNA不能发挥正常的功能;X-线结晶学研究发现：DNA促旋酶A亚基的结构中似乎有一个能够与喹诺酮类药物结合的结构域，而拓扑异构酶IV结构中尚未发现类似的结构域。,二、喹诺酮类药物的作用机制及细菌耐药性（一）喹诺酮类药物的作用机制,喹诺酮类抗菌药物抑制DNA的合成一方面通过对靶酶的作用，使DNA断裂，另一方面用可逆的喹诺酮类-DNA-拓扑异构酶三元复合物与复制叉碰撞而转化为不可逆的状态;但是往往在可逆的三元复合物中随之产生DNA双链的断裂，这就启动了细胞的死亡。,促旋酶- DNA-喹诺酮类复合物的交互作用模式,1、 喹诺酮类抗菌药物的双重作用靶位1）DNA促旋酶,细菌的DNA促旋酶是一个由两种亚基组成的分子量为400kD的四聚体。105 kD的A亚基由gyrA基因（即nalA）编码，与DNA链的断裂和重新连接的过程有关。变性时，A亚基通过和DNA底物以转酯化作用形成共价连接。分子量为95kD的B亚基由gyrB基因（即cou）编码，具有ATP的功能，促使DNA形成超螺旋。这种DNA促旋酶是细菌体内独特的拓扑异构酶II，是已知的唯一能够使双链DNA产生负超螺旋化的拓扑异构酶。,DNA促旋酶的作用模式,2)拓扑异构酶,拓扑异构酶的功能是改变DNA的连接数目和DNA的拓扑结构，使其发挥正常的功能。拓扑异构酶的作用方式一般经过三个步骤完成:第一步是酶与DNA结合，使DNA的一条链或两条链产生缺口或断裂；第二步是酶从已经形成的临时缺口通过DNA链，这个过程正常情况下在分子内进行，但在特殊情况下也可以在分子间进行而导致杂合DNA分子的形成；在最后阶段，断开的DNA链重新闭合，形成相对于天然DNA底物或是“松弛”或是“超螺旋”的双链，并释放出DNA和酶。,2) 拓扑异构酶,拓扑异构酶I使单链DNA断裂和闭合，这些酶能够促使DNA形成不同的拓扑结构的互变，从而使连接数目发生变化。拓扑异构酶II利用双链DNA的临时性双链缺口以改变DNA的拓扑结构，使DNA连接数目改变两个整数。图所示为哺乳类拓扑异构酶I（A）和拓扑异构酶II(B)对DNA的作用模式，以及拓扑异构酶II抑制剂造成细胞死亡的过程(C)。,拓扑异构酶I对DNA的作用模式,拓扑异构酶II对DNA的作用模式,拓扑异构酶II抑制剂造成细胞死亡的作用模式,2) 拓扑异构酶,拓扑异构酶IV是细菌细胞生长所必须的酶，其为2个C亚基和2个E亚基组成的四聚体，在DNA复制后期姊妹染色体的分离过程中起重要的作用。其中C亚基由parC 基因编码（金黄色葡萄球菌由grlA基因编码），负责DNA 的断裂和重接；E亚基由parE基因编码（金黄色葡萄球菌由grlB基因编码），催化ATP的水解。,2、喹诺酮类药物与拓扑异构酶-DNA复合物的交互作用,已有的研究表明，喹诺酮类药物的特异性结合同时需要DNA和拓扑异构酶，因此，这类药物的作用靶位是酶- DNA复合物。很多研究表明，喹诺酮类药物与DNA-拓扑异构酶II复合物的交互作用能够影响DNA结合、DNA结构以及拓扑异构酶的构型。另外，与酶- DNA复合物结合的喹诺酮类药物，在拓扑异构酶的作用下，随着由喹诺酮类的诱导而造成的DNA发生断裂而被释放出来。,2、喹诺酮类药物与拓扑异构酶-DNA复合物的交互作用,诺氟沙星能够稳定DNA与拓扑异构酶的交互作用，且在没有ATP存在的条件下以及不发生DNA断裂的情况下也有作用，这就提示喹诺酮类药物的作用在DNA链的断裂之前。另外，诺氟沙星通过与DNA-拓扑异构酶IV复合物的结合，使DNA的结构发生改变。这种由喹诺酮类药物诱导的DNA结构变化的程度，在DNA链不发生断裂的情况下的强度大于不存在拓扑异构酶IV时的强度。,2、喹诺酮类药物与拓扑异构酶-DNA复合物的交互作用,环丙沙星也能与DNA- DNA促旋酶（不能引起DNA断裂的突变株）复合物结合，并能促进酶的构型发生变异。酶的这些构型变化能够改变ATP水解的速率，这种喹诺酮类-特征速率可以用来监测药物结合和DNA断裂的动力学。环丙沙星能够快速地改变ATP水解的速率，但DNA断裂的速率相当缓慢，提示这两个过程是分离的。因此，喹诺酮类药物似乎是起到稳定DNA与拓扑异构酶结合的作用，以及促进酶的构型发生变化。,3、喹诺酮类-拓扑异构酶-DNA复合物与DNA复制叉和RNA多聚酶的交互作用,喹诺酮类药物不仅能够抑制DNA的合成，在较高的浓度下，也能抑制RNA的合成。这种作用是通过喹诺酮类药物稳定DNA-拓扑异构酶II复合物来介导的，对DNA合成的抑制作用在体内可以由喹诺酮类药物与DNA促旋酶和拓扑异构酶IV的交互作用来实现。,3、喹诺酮类-拓扑异构酶-DNA复合物与DNA复制叉和RNA多聚酶的交互作用,在体外研究这一作用机制时发现：加入EDTA能够逆转由喹诺酮类药物稳定的DNA-拓扑异构酶II复合物。但是，具有活性的DNA复制复合物与DNA-拓扑异构酶II复合物的碰撞所产生的复合物，不受加入EDTA的影响，但也不会使DNA断裂。这种碰撞也阻碍了DNA复制叉的功能。丧失断裂DNA能力的拓扑异构酶IV突变株虽然能够与拓扑异构酶IV结合，但即使在喹诺酮类药物存在的情况下也不能阻碍DNA复制叉的功能。因此，DNA-喹诺酮类药物-活性拓扑异构酶IV复合物似乎对DNA复制叉形成了物理障碍。尽管复制与拓扑异构酶复合物的交互作用将DNA-喹诺酮类药物-拓扑异构酶复合物趋于更加稳定，但仅是这一作用似乎还不足于使双链DNA断裂，而喹诺酮类药物对细菌的抑制作用必须要使双链DNA断裂。,3、喹诺酮类-拓扑异构酶-DNA复合物与DNA复制叉和RNA多聚酶的交互作用,在体外，通过与DNA促旋酶的交互作用能够很快地抑制DNA的合成，与拓扑异构酶IV的交互作用所引起的DNA合成抑制比较缓慢。这种差异可以认为是由于DNA促旋酶和拓扑异构酶IV在细菌染色体上的位置差异所致。DNA促旋酶位于DNA复制叉的前面，所以，当喹诺酮类-促旋酶-DNA形成后立刻就产生碰撞；相反，拓扑异构酶IV被认为位于DNA复制叉的后面，所以不能与复制叉产生碰撞，除非要到下一轮DNA复制。喹诺酮类- DNA、促旋酶- DNA复合物也能阻碍RNA聚合酶的移动，因此使转译提前终止。与阻碍DNA复制一样，不能断裂DNA的促旋酶突变株也不能阻碍转译过程。,3、喹诺酮类-拓扑异构酶-DNA复合物与DNA复制叉和RNA多聚酶的交互作用,尽管近年来对喹诺酮类药物的作用机制进行了许多研究工作，并取得了很大的进展，但尚有许多地方需要进一步研究加以阐明，如：喹诺酮类药物与DNA -拓扑异构酶结合的位点、酶的构型的改变与结合位点的形成以及由于喹诺酮类药物的结合而产生的拓扑异构酶构型的改变等。另外，体内喹诺酮类药物与DNA -拓扑异构酶复合物产生交互作用所引起DNA双链断裂的分子因素（molecular factors）、以及这些分子因素对喹诺酮类药物抗菌活力的作用等都是今后值得进一步研究的重要课题。,(二) 细菌对喹诺酮类抗菌药物产生耐药性的作用机制,细菌对喹诺酮类药物产生耐药性是由于靶酶（DNA促旋酶和/或拓扑异构酶IV）发生变异，使药物与靶酶的亲和力降低，以及细菌通过降低药物在胞内的累积量。编码这些酶的基因（gyrA/gyrB/parC/parE）的核苷酸顺序以及这些酶的氨基酸顺序都具有很大的相似性。在gyrA和parC基因内有一个被称之为热点（hotspots）的喹诺酮类