超分辨荧光显微镜_显纳镜.docx

超分辨荧光显微镜-显纳镜袁景和 方晓红*( 中国科学院化学研究所分子纳米结构与纳米技术院重点实验室 北京 100190)摘 要 2014 年诺贝尔化学奖授予美国科学家 Eric Betzig、德国科学家 Stefan W Hell 和美国科学家William E Moerner，表彰他们在“发展超分辨荧光显微镜”方面的贡献。超分辨荧光显微镜的出现，为深入研 究生命过程的分子机制提供了新的工具和新的机遇。本文综述了三位获奖人发明的两种超分辨荧光显微镜 的基本原理、方法发展和生物医学应用，并对国内相关研究进展作了简介。关键词 超分辨荧光显微镜 单 分 子 成 像 受 激 辐 射 耗 尽 ( STED ) 显 微 镜 光活化定位显微镜 ( PALM) ，随机光学重构显微镜( STOM)Super-esolved Fluorescence MicroscopyNanoscopyYuan Jinghe，Fang Xiaohong*( CAS Key Laboratory of Molecular Nanostructure and Nanotechnology，Institute of Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190)Abstract The Nobel Prize in Chemistry 2014 has been awarded jointly to the USA scientist，Erik Betzig，German scientist， Stefan W Hell and USA Scientist， W E Moerner for the development of super-resolved fluorescence microscopy Super-resolution microscope offers a powerful tool and new oppertunity for the investigation of molecular mechinsam of life processes This paper reviews the principles，instrument developments and biological applications of two types of super-resolution microscope invented by the three Nobel price winners，and brief comments the related work in ChinaSuper-resolution fluorescene microscope，Single-molecule imaging，Stimulated emission depletionKeywords( STED ) microscope，Photoactivated localization microscope ( PALM ) ，Stochastic optical reconstruction microscopy( STOM)学研究的瓶颈，阐明生化反应和生命活动的分子机制，最终揭示生老病死的生命奥秘，带来了新的 手段和新的机遇。所谓超分辨荧光显微镜是指超过衍射极限分 辨的荧光显微镜。光学显微镜由于其非侵入、动 态表征等优势，广泛应用于生命科学研究2。然 而，物理学家 Ernst Abbe 在 1873 年就指出，传统 光学显微镜的分辨率有一极限值。因为一个无限 小的点所发出的光，经显微光学系统成像后得到 的是一个扩展的焦斑，即艾里斑。Abbe 推算出艾 里斑半径 r 可用以下公式描述3:化学是在分子水平研究物质组成、结构、性质及变化的科学。正如美国科学院院士、哈佛大学 谢晓亮教授在Science评述中所指出的“活细胞 已成为 21 世纪( 科学研究中) 的试管”1，在生 命化学研究领域，越来越多的化学家将生理状态 下的复杂生物体系如活细胞或活体作为研究对 象。研究人员首先面临的挑战问题是，如何在活 细胞 / 活体中实现分子水平上生物分子的结构、分 子间( 内) 相互作用、生化反应等的实时动态检测。2014 年 诺 贝 尔化学奖获得者 EricBetzig、Hell 和 William E Moerner 所发展的Stefan W“超分辨率荧光显微镜”，为人们突破这一生命化袁景和 男，博士，副研究员，从事超分辨光学显微成像、图像处理与模式识别研究。* 联系人，方晓红 女，博士，研究员，从事单分子检测、单分子 / 超分辨成像和纳米生物研究。E-mail: xfang iccas ac cn科技部国家重大研究计划项目( 2013CB933701) 和国家自然科学基金项目( 91213305) 资助2014-10-20 接受化学通报2014 年 第 77 卷 第 11 期http: / / www hxtb org1030= 0. 61rSTED 荧光显微镜原理早在 1994 年 Hell5就提出了通过受激辐射11. 1NA其中， 为 发 射 光 波 长，NA 为物镜数值孔径。由于一般 NA 1. 4 ，r 约为半个波长，对于常用 可见光波长的显微镜，分辨率不超过 200 nm，也 就是说无法分辨距离小于 200 nm 的两个点。这 个 Abbe 衍射极限一直被人们认为是不可逾越 的理 论 极 限，阻 碍 了 对生物体系的分子水平 研究。近年来随着超分辨荧光显微术的兴起，研究 人员研制了多种突破衍射极限的超分辨光学显微镜4，使得光学显微 镜 进 入 “ 显 纳 镜 ”( Nanoscopy) 时代。这些超分辨显微镜主要分为耗尽的方式实现超分辨成像的设想。其基本原理如图 1 所示，激发光将荧光分子从基态 S0 激发到激发态 S ，经过振动弛豫，荧光分子跃迁到 S 的11最低振动能级 L ，当荧光分子从该振动能级跃迁2回到基态 S 时，能量以荧光的形式辐射出去，这0就是自发荧光辐射过程，传统的共聚焦显微镜等 即是通过检测这一自发辐射荧光信号来成像的。 另一方面，处于激发态的荧光分子在外界辐射影 响下，产生与外界辐射同频率、同位相和同偏振的 辐射，即受激荧光辐射过程，如果这一过程竞争超 过自发荧光辐射，就导致激发态分子进入非自发 荧光辐 射 状 态，不 发 荧 光，称为受激辐射耗尽 ( STED) 。诺贝尔化学奖获得者 Hell 创造性地同 时使用两束激光激发样品，其中一束为中间空心 的面包圈形状 STED 光，两束光叠加后使得只有 激发光焦斑中心区域的荧光分子可以自发辐射荧 光，而被 STED 光束照射的区域，发生 STED 效应 不再发荧光，这就使得有效的荧光激发半径大大 降低，从而突破了衍射极限的限制。两 类: 一 类 以Hell发明的受激辐射 耗 尽( Stimulated emission depletion，STED) 显微镜为代表，通过调制光照明方式来实现超分辨，也可称 为结构光照明超分辨显微镜; 另一类是基于单 分子定位的超 分 辨 显 微 镜，典 型 代 表 是 Betzig 和 Moerner 等发展的光活化定位显微镜 ( Photoactivated localization microscopy，PALM ) ， 通过对具有光开关功能的荧光基团进行单分子 成像和定位而实现。 下面将简介这两类显微镜 的原理、方法、应用进展，以及三位诺奖获得者 的贡献。图 1 典型的荧光分子能级结构光器成功地构建了超分辨 STED 显微镜6，成像48nm 直径荧光球，获得 104nm 横向分辨率，第一 次用实验实现了 STED 超分辨显微成像。后来经 一系列设备改进，分辨率提高到 29nm。随后 Hell 等还发展了快速扫描 STED 荧光显微镜( 80 帧 / s) 7、双色 STED 成像8、多 寿 命 多 色 STED 成方法与应用实现 STED 超分辨成像的关键在于获得面包 圈形 STED 光，并且要求 STED 光波长位于荧光 发射波长的红限，时间上比激发光有亚纳秒量级 的延迟，强度上远高于激发光。2000 年，Hell 领 导其研究组，利用两台同步的钛宝石飞秒脉冲激1. 2http: / / www hxtb org化学通报 2014 年 第 77 卷 第 11 期1031像9等一系列技术。早期的 STED 显微镜主要采用飞秒或者亚皮 秒脉冲激光器激发，设备昂贵，调制难度大。后来 Hell 等 发展了用连续激光激发的 STED ( CW- STED) 显微镜10，并实现了商品化，虽然成本降 低，但为充分耗尽荧光分子，需使用比脉冲激光更 高的激光功率，容易导致荧光样品的光漂白和热 损伤。新的商品化超连续谱激光器，具有同时输 出激发光和 STED 光、方便 STED 波长选择、避免 同步失 调 等 优 势，将 大 大 促 进 STED 显 微 镜 的 普及。应用方面，Hell 实验室 2006 年在Nature上报道，STED 显微镜分辨出直径仅 40 nm 的神经突 触 囊 泡11，并发现突触囊泡膜 蛋 白I( Synaptotagmin I)在突触囊泡胞吐后仍保持独立团簇状态( 图 2 ) 。随后 STED 显微镜凭借其超高分辨能力很快在研究细胞膜微区结构、细胞器、神 经突触、病毒等方面取得不少新的重要发现。如 Hell 及其合作者观测到 140nm 大小的 HIV-1 病 毒颗粒上包膜蛋白的分布，发现这些糖蛋白发生 聚集是病毒高效停靠宿主细胞及随后感染的必要 条件12; 他们从对体外细胞成像进一步实现了对 活老鼠大脑神经元的超高分辨率实时成像，展示 了 STED 在活体成像中应用前景13。图 2 突触囊泡的共聚焦成像( 左) 和 STED 成像( 右) 对比图11Hell 发明 STED 显微镜，其意义不仅是分析技术上的进步，更重要的是观念上的突破。Hell提出 STED 显微镜的分辨率满足公式现更高精度的光学引导 AFM 测量，以及光学和力学性质的多参数测量14。北京大学实现了 CW- STED 显微镜15，浙江大学使用方位角偏振光束，= 0. 61 16获得了更锐的 STED 光。rNA 槡1 + ISTED / IsPALM基于单分子荧光成像2其中，r 为分辨半径， 为发射光波长，NA 为物镜数值孔径，Is 为荧光分子的饱和吸收强度，ISTED 为 STED 光强度。由此可见，只要 STED 光强足够 大，显微镜的分辨率没有理论上的极限。由于有衍射极限理论的思维禁锢，在 STED 提出后的很长一段时间，并未得到大多数学者的 支持。直到 2006 年 Hell 研究组实现了神经突触 囊泡的超分辨成像11，展示了令人信服的生物体 系表征结果，才得到广泛认可，并启发和带动了一 大批超分辨技术的迅速发展。值得一提的是，STED 显微镜由于其技术难 度，长期以来国际上只有少数实验室可实现。在 国内，中科院化学所基于三态弛豫( T _ex) 概念 研制成功了超连续脉冲激光激发的 SC-STED，获 得了好于 50nm 的超分辨荧光成像( 图 3 ) ，并在 此基础上研制了与 AFM 联用的仪器，在国际上首 次实现了荧光和力学信号的同时同步成像，可实的超分辨显微镜成像原理与 STED 显微镜需要复杂的光学系统不同， PALM 等超分辨显微镜最初是在对传统的全内反 射显微镜做简单改造后实现的，通过对具有光开 关性质的荧光分子进行单分子定位而重构出超分 辨显微图像。因为尽管光学分辨极限为 200nm 左右，如果这个衍射限范围内只有一个分子，那么 通过对显微物镜点扩展函数( PSF) 的拟合，其定 位的精度满足17:2. 1224 2= s + a / 12 + 8 s b ( x) 2a2 N2N其中，s 为点扩展函数的标准差，N 为收集的光子数，a 为像素大小，b 为背景噪声。这一定位精度与 波长无关，可达到 1nm，远小于 200nm 的衍射极 限。因此，可以对一个样品采取多次成像的方法，化学通报 2014 年 第 77 卷 第 11 期http: / / www hxtb org1032图 3 40nm 荧光颗粒和细胞微丝的共聚焦( a，c) 和 STED 成像( b，d) ; ( e h) STED / AFM 联用成像，依次为 40nm 荧光颗粒的 STED，AFM 高度，AFM 力谱和粘附力成像14每一次成像只激发少量的稀疏分布的单分子，如图 4 所示，利用一束激光使 4 个分子中的 2 个从 非荧光态( 暗态 a) 激活为荧光态( 亮态 b) ，对处 于亮态的 2 个分子进行拟合定位获得纳米级超分 辨定位( c，定位于十字交叉中心点) ; 待这 2 个分子荧光猝灭后( d) ，再重复上述循环( e f) 可获得新激活分子的纳米级超分辨成像，叠加后的纳 米级超分辨成像结果如图 4( h) ，这便是 PALM 的 成像原理。与之对比的是传统光学显微镜获得的 成像图 4( g) ，它无法分辨 4 个分子。图 4 PALM 成像原理示意图由此可见，实现这类超分辨成像需要两个关键技术: 一是单分子成像，二是使用具有光调控暗 态 亮态开关性质的荧光分子。个分子的成像检测，即获得 1 个分子的光学信号，对化学而言，可谓达到最高灵敏度，难度很 大。1989 年，Moerner 等首次实现低温下单个分 子的光谱检测18，随后人们相继取得低温单分子 荧光光谱、室温单分子荧光光谱、活细胞体系单分 子荧光成像等一系列重要突 破19。1999 年，单分子成像单分子荧光成像是 PALM 等超分辨成像的技 术基础，Moerner 是单分子成像领域的先驱。单2. 2http: / / www hxtb org化学通报 2014 年 第 77 卷 第 11 期1033Science以“单分子: 化学研究的前沿”为题，出版了单分子研究的专刊20，综述了单分子研究进 展和未来发展方向，极大地推动了单分子检测技 术的兴起和发展。需要指出的是，单分子检测本身也是化学、生 物、物理等交叉学科的前沿领域。单分子检测对 于生物分子的研究具有特别重要的意义21。因 为传统的生物体系研究往往都是对大量分子在一 段时间内的平均行为的描述，由于分子结构( 如 构象) 的多样性、生化反应的非同步性和所处环 境的( 如细胞膜、质、核等不同微区) 非均相性，使 得生物分子通常具有显著的非均一性，在集群研 究中单个分子的行为被平均化和掩盖，阻碍了对 其结构和功能的深入认识。利用单分子成像，除 了可实现超分辨单分子定位，还可研究生物单分 子的物理化学性质、动态变化和生物学功能的分 子机制，有望为生命科学和生命化学的研究带来 重大突破。最近，Nature Methods点评了在过去十年中对生物学研究影响最深的十大技术22，其 中单分子技术和超高分辨率显微术共同上榜，今 年的诺贝尔化学奖也是对单分子技术的肯定。Moerner 长期从事单分子成像研究，为该领域 的发展做出了许多重要贡献，其中也包括一些超 分辨成像新方法的发展23，并一直推动单分子技 术在生命科学中的应用。Moerner 的获奖主要在 于他对于 PALM 奠基技术 单分子成像的贡献。 此外，他在 1997 年最早报道了具有光活化荧光开 关效应的荧光蛋白并实现了对该蛋白的单分子检测24。他发现绿色荧光蛋白( GFP) 经 488nm 激 光激发 荧 光 后 会 进 入 暗 态，不 再 发 荧 光，但 经405nm 激光照射后，能返回到原来可发射荧光的 状态。这种 光 活化特性的荧光蛋白正是实现 PALM 超分辨成像所需要的荧光基团。 可惜的 是，Moerner 当时并没有想到将该荧光蛋白用于超 分辨成像。2. 3PALM2006 年，Eric Betzig 和 Lippincott-Schwartz 等提出了光激活定位显微术( PALM) 的概念25，巧妙地利用一种 GFP 突变体作为光活化蛋白( PA- FP) 来标记靶蛋白，并在细胞中表达。用 405 nm 激光器低能量照射细胞表面，一次仅激活出稀疏 分布的几个荧光分子，然后用 561 nm 激光激发得 到荧光图像并精确定位这些荧光单分子。待长时 间使用 561 nm 来漂白这些已经定位正确的荧光 分子之后，再分别用 405 nm 和 561 nm 激光来激 活、激发和漂白其他的荧光分子，多次成像后，将 这些分子的荧光图像合成到一张图上，得到了比 传统光学显微镜至少高 10 倍以上的分辨率。开发高性能的光活化蛋白是 PALM 技术发展 的重要方向。一些常见的光活化蛋白存在光活化 比率小、荧光信号弱等缺点，导致其成像质量受 限。研究人员从荧光蛋白的突变体中筛选 pH 和 光稳定性好、光活化速率快的各钟新型的光活化 蛋白如 PAmCherry1，在固定细胞中获得小于 25 nm 的空间分辨率26，27。2006 年，Betzig 等 在Science 发 表 首 篇 PALM 论文，展示 PALM 显微镜可清楚分辨固定 细胞粘着斑中的粘着斑蛋白( Vinculin ) 、伪足上 的肌动蛋白、质膜上逆转录蛋白 Gag、线粒体( 图5) 等25，随后又发展了活细胞双色共定位28和 单分子追踪 PALM 技术等29，观察了多种亚细胞 结构 变 化，如活细胞中粘附复合物 ( adhesion complexes，ACs) 的形成过程以及在形成过程中单 个桩蛋白( paxillin) 的捕获和失去。PALM 自提出 以来受到了相关领域科研人员的广泛重视，并得 到了长足发展。例如，对神经突触后密集区结构 ( PSD) 高分辨成像，发现 4 种主要脚手架蛋白形 成 80nm 动态变化的聚集体，有的能选择性地富 集 AMPA 受体而不是 NMDA，提出 PSD 内部结构 可能参与调节神经传递的强度和可塑性30。图 5 对比线粒体的 TIF ( A) ，PALM ( B) ，TEM ( C) 成像以及 PALM / TEM 的叠图，表明 PALM 与 TEM 成像的分辨率相当25化学通报 2014 年 第 77 卷 第 11 期http: / / www hxtb org1034Betzig 获得诺贝尔化学奖的工作经历颇有些传奇。他早年曾在建立近场光学显微镜 SNOM 方面做出过开创性的工作，1992 年他在Science 上发表利用 SNOM 实现单分子成像的成果，引起 广泛关注。SNOM 通过纳米光纤近场激发样品， 可实现纳米尺度成像。Betzig 意识到 SNOM 在生 物体系研究的局限性，曾设想采用通过准确定位 不同波长的荧光分子以绕开衍射极限，并在 1995 年发表了可以说是 PALM 技术雏型的理论文 章31，但当时无法在实验上实现。他曾一度失望 地离开了学术界，到父亲的企业工作。不过他一 直没有放弃突破衍射极限的梦想。当他了解到 Lippincott-Schwartz 实验室的光活化荧光蛋白后， 重返实验室，终于梦想成真。分辨 成 像 新 方 法。 STOM 的 工 作 与 PALM 于2006 年同月发表，只是在投稿日期上晚了 4 个 月。由于具有对细胞内源性生物分子成像的优 势，目前 STOM 在活细胞等生物体系的应用似 更领先一步，年仅 40 岁的 Zhuang 也因此当选为 美国科学院院士。此次遗憾地与诺奖失之交臂， 令人惋惜。不过，Zhuang 及其发展的 STOM 对 生物成像的重大贡献是不会被人忘记的。北京大学、中科院化学所、生物物理所、物理 所等是国内较早从事生物单分子成像和单分子研 究的单位，在生物大分子相互作用、细胞信号转 导、蛋白质折叠和分子马达等领域的研究都取得 过一些重要的突破19，37，38。生物物理所和北京 大学分别在发展新的 PALM 成像光活化蛋白以及 双分子荧光互补技术与 PALM 相结合等方面近期 也有高水平的成果报道39，40。不过总体来说，国 内在单分子研究这一前沿交叉领域的研究力量还 较薄 弱，在单分子检测基础上从事 PALM 和 STOM 的研究队伍更小。可以说这一领域在国 内的发展不免受到传统学科观念、评价体系、经费 支持力度和人才知识结构等方面的影响。此次超 分辨和单分子成像的工作获得诺奖，将对化学与 生物前沿交叉领域的研究工作起到积极的推动 作用。随机光学重构显微镜( STOM)与 PALM 同时诞生的，还有一种同样是基于 单分子点扩展函数拟合定位实现超分辨的方法， 即哈佛大学华裔女科学家 Xiaowei Zhuang 研究组 开发的 超分辨随机光学重构显微镜 ( stochastic2. 4( STOM ) ) 32。optical reconstruction microscopySTOM 与 PALM 的基本原理一 致，区 别 在 于STOM 使用的荧光开关基团是有机染料而不是 荧光蛋白。Zhuang 等发现可使用一对染料分子 Cy3 和 Cy5 作为荧光标记实现超分辨成像，因为 不同波长光可以控制 Cy5 在荧光发射态和暗态 之间切换，而 Cy3 分子可以加速该开关过程33。 Zhuang 及合作者在 STOM 方法改进和应用 上做了大量的工作，如发展可同时记录 2 种甚至 多种蛋白质空间相对位置的方法、三维 STOM 等34; 应用方面的成果包括: 对神经元树突和轴 突中肌动蛋白等骨架蛋白成像35，发现肌动蛋白 形成缠绕在神经轴突外周的环状结构，轴突中的 钠离子通道呈现出与之关联的周期性分布，表明 轴突质膜可能影响了轴突与其他细胞相互交流的 方式; 通过对端粒成像36，发现了一种与端粒功 能有关的 t-loop 构象，并提出了调控 t-loop 构象形成的新机制。STOM 和 PALM 一直是超分辨成像领域并 驾齐驱、不分伯仲的两种技术。Zhuang 在博士后 期间就在单分子成像领域崭露头角，后来又以研 究 NA 构象变化、病毒感染等出色工作成为单分 子成像领域代表性人物之一。她的课题组在使用 荧光共振能量转移常用染料对进行单分子成像 时，观察到其光开关效应，很快便独立地发展了超小结与展望自 2006 年以来，超分辨光学显微镜迅速发 展，并且在生物体系的应用中展现了激动人心的 前景，各种新的超分辨成像方法不断涌现。但是 作为新兴的技术，超分辨光学显微镜的发展历史 不长，STED 和 PALM / STOM 分 别 于 2000 年、2006 年研制成功。它们应用于生命过程分子机 制的研究，还处于起步阶段，其技术本身仍有待进 一步完善。例如，STED 超分辨显微镜由于高强 度 STED 光的使用，对荧光标记分子光稳定性的 要求高，难以实现单分子水平检测，还可能对生物 样品造成损伤。此外，STED 显微镜的研制和维 护通常需要具有一定光学专业技术知识的人员， 影响了它的普及推广; PALM 和 STOM 虽然较容 易实现，但需要进行多次成像和拟合定位，时间分 辨往往受到限制，对图像数据处理要求高。因此 仍需要进一步发展适合于活细胞 / 活体动态变化 研究的高时间分辨显纳镜。另一方面，超分辨光 学显微镜与其他表征技术的联用也是今后的发展3http: / / www hxtb org化学通报 2014 年 第 77 卷 第 11 期1035方向，特别是实现在对分子位置进行成像的同时，表征其化学组分和构象。超分辨显微技术的不断 进步和广泛应用，将极大地促进分子水平上生化 反应过程及生物大分子构效关系的研究，为生命 化学的发展翻开新的一页。参 考 文 献19T Xia，N Li，X Fang Ann ev Phys Chem ，2013，64:459 480J Uppenbrink，D Clery Science，1999，283( 5408) : 1667 陈宜张，林其谁主编 生命科学中的单分子行为及细胞内 实时检测 北京: 科学出版社 2005Ten years of Methods，Nature Methods，2014，11: 1000 1001 P Pavani，M A Thompson，J S Biteen et al Proc Nat Acad Sci USA，2009，106: 2995 2999 M Dickson，A B Cubitt， Y Tsien et al Nature，1997;388( 6640) : 355 358E Betzig，G H Patterson， Sougrat et al Science，2006，313( 5793) : 1642 1645S T Hess，T P K Girirajan，M D Mason Biophys J ，2006，91( 11) : 4258 4272A G York，A Ghitani，A Vaziri et al Nat Methods，2011，8( 4) : 327 333F V Subach，G H Patterson，S Manley et al Nat Methods，2009，6: 153 159H Shroff，C G Galbraith，J A Galbraith et al Proc Natl Acad Sci USA，2007，104( 51) : 20308 20313H Shroff，C G Galbraith，J A Galbraith et al Nat Methods，2008，5( 5) : 417 423H D MacGillavry，Y Song，S aghavachari et al Neuron，2013，78: 615 622E Betzig Opt Lett ，1995，20: 237 239M J ust，M Bates，X Zhuang Nat Methods，2006，3( 10) : 793 795M Bates，T Blosser，X Zhuang Phys ev Lett ，2005，94: 108101B Huang，W Wang，M Bates et al Science，2008，319( 5864) : 810 813K Xu，G Zhong，X Zhuang Science，2013，339: 452 456 Y Doksani，J Y Wu，T de Lange et al Cell，2013，155: 345 356W Zhang，Y X Jiang，Q Wang et al Proc Natl Acad Sci USA，2009，106: 15679 15683W Ji，P Xu，Z Li et al Proc Natl Acad Sci USA，2008，105( 36) : 13668 13673M S Zhang，H Chang，Y D Zhang et al Nat Methods，201