酶和维生素 1

4 19 2020 每一种生物生命过程必须 生命现象是多步反应 生理条件下无催化剂许多反应进行的太慢或不能进行 细胞需要生物催化剂 Biocatalysts 4 19 2020 第三章酶与维生素 P70 4 19 2020 一 酶的概念二 酶的发展简史三 酶的分类四 酶的命名 第一节酶的概述 P70 4 19 2020 一 酶的概念 生物活细胞产生的 具有催化能力的以蛋白质为主要成分的生物催化剂 Biocatalysts 二 酶的研究简史 酶的发现与提出1878年巴斯德发酵是酵母细胞生命活动的结果 出现酶的名称1897年 Buchner兄弟不含细胞的酵母汁成功实现了发酵 提出了发酵与活细胞无关 而与细胞液中的酶有关 1913年 Michaelis和Menten提出了酶促动力学基本原理 米氏学说 1926年 Sumner刀豆种子脲酶结晶 首次证明酶是具有催化活性的蛋白质 1982年 Cech对四膜虫的研究中发现RNA具有催化作用 ribozyme 核酶 4 19 2020 三 酶的分类 国际系统分类法 1961年国际酶学委员会 EnzymeCommittee EC 根据酶催化的反应类型和机理 分成六大类 1 氧化 还原酶类 Oxido reductases 主要是氢的转移或电子传递的反应 脱氢酶类 dehydrogenase 氧化酶类 Oxidase 4 19 2020 A X B A B X 一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上 2 转移 移换 酶类 Transferases 催化化合物中某些基团的转移 根据X分成8个亚类 转移碳基 酮基或醛基 酰基 糖基 烃基 含氮基 含磷基和含硫基的酶 4 19 2020 3 水解酶类 hydrolases 催化底物的加水分解反应 4 裂合 裂解 酶类 Lyase 催化底物分子中非水解性移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应 4 19 2020 主要包括 醛缩酶 水化酶 脱水酶 及脱氨酶等 4 19 2020 催化各种同分异构体的相互转化 5 异构酶类 Isomerases 常见 消旋和变旋 醛酮异构 顺反异构和变位酶类 6 磷酸葡萄糖异构酶 即底物分子内基团或原子的重排过程 4 19 2020 A B ATP H O H A B ADP Pi 6 合成酶类LigasesorSynthetases 连接酶 与ATP分解反应相互偶联 催化C C C O C N以及C S键的形成反应 丙酮酸 CO2 草酰乙酸 丙酮酸羧化酶 4 19 2020 乳酸脱氢酶EC1 1 1 27 第1大类 氧化还原酶 第1亚类 氧化基团CHOH 第1亚亚类 H受体为NAD 该酶在亚亚类中的流水编号 酶学委员会缩写 酶的身份证号码 编号 EC酶大类号 亚类号 底物 亚亚类号 序号 4 19 2020 按酶化学组成分类简单蛋白酶和结合蛋白酶 按酶结构特点分类单体酶 寡聚酶 多酶体系和多功能酶 4 19 2020 1 习惯命名法1 根据催化底物命名 蛋白酶 淀粉酶 2 根据催化反应的性质命名 水解酶 转氨酶 裂解酶等 3 结合上述两个原则命名 琥珀酸脱氢酶 4 在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点 胃蛋白酶 胰蛋白酶 碱性磷酸脂酶和酸性磷酸脂酶 四 酶的命名 缺点 一酶多名 一名多酶 写出反应难 4 19 2020 2 国际系统命名法 国际酶学委员会1961年提出 酶催化的反应 丙氨酸 酮戊二酸 谷氨酸 丙酮酸 系统名称 底物名称 构型 反应性质 酶 底物不止一个 全部列出 用冒号 分隔 习惯名称 谷丙转氨酶系统名称 丙氨酸 酮戊二酸氨基转移酶 ThomsE Barm编 催化水解反应的酶 一般可省去底物水 省去反应类型 4 19 2020 第二节酶催化作用的特性 新陈代谢不可缺少 受多种因素调节控制 一 与一般催化剂的共性1 用量少而催化效率高 2 稳定底物形成过渡态 降低反应的活化能 加速反应 3 改变化学反应的速度 不改变化学反应平衡 4 反应前后酶本身不变化 酶促反应 Enzymaticreaction 酶催化的生物化学反应 底物 substrate 由酶催化 发生化学变化的物质 4 19 2020 1 高效性2 专一性3 反应条件温和4 酶易失活5 酶活力可调节控制6 某些酶催化活力与辅酶 辅基及金属离子有关 7 酶促反应无副反应 二 生物催化剂的特性 4 19 2020 1 高效性 酶显著降低反应活化能 4 19 2020 4 19 2020 提高反应速度10 101 倍 非酶催化剂 或108 1020倍 非催化反应 例如 65 C条件下 1克结晶 淀粉酶可催化2吨淀粉水解 一餐饭在37 C下的消化 无催化剂需50年 消化酶消化3 4小时 4 19 2020 概念 2 专一性 Specificity 例如 蛋白酶催化蛋白质的水解 核酸酶催化核酸的水解 又称特异性 是指酶在催化生化反应时对底物严格的选择性 即酶只能催化某一种或某一类化学反应 指一种酶只能作用于某一种或某一类 结构性质相似 特定底物 4 19 2020 酶的专一性类型 酶的专一性 结构专一性 立体异构专一性 相对专一性 绝对专一性 4 19 2020 结构专一性 A 绝对专一性 Absolutespecificity 对底物要求非常严格 只作用于一个特定的底物 脲酶 4 19 2020 B 相对专一性 RelativeSpecificity 酶的作用对象是一类化合物或一类化学键 族 group 专一性 对键两端的基团要求的程度不同 只对其中一个基团要求严格 胰蛋白酶 4 19 2020 葡萄糖苷酶 催化由 葡萄糖所构成的糖苷水解 对糖苷另一端没有严格要求 键 Bond 专一性 对于键两端的基团没有严格的要求 酯酶 4 19 2020 底物具有旋光异构体时 酶只能作用于其中一种 A 旋光异构专一性 立体化学 异构 专一性StereochemicalSpecificity stereospecificity B 几何异构专一性 淀粉酶只能选择性水解D 葡萄糖形成的1 4 糖苷键 L 氨基酸氧化酶只能催化L 氨基酸氧化 乳酸脱氢酶只对L 乳酸专一 酶只能选择性催化几何异构体的一种构型 延胡索酸水合酶 4 19 2020 一般在常温 常压和接近中性的酸碱度 pH5 8 水溶液中进行 反应温度范围为20 40 C 3 反应条件温和 4 酶易失活 酶高度不稳定 凡能使蛋白质变性的因素 如强酸 强碱高温等 都能使酶破坏而完全失去活性 4 19 2020 酶活力可调节控制 酶和代谢物的区域化分布 酶活性的调节 6 某些酶催化活力与辅酶 辅基及金属离子有关 7 酶促反应无副反应 酶原激活 共价修饰 变构调节和酶含量的调节 合成的诱导 阻遏和降解 代谢物对酶活性的抑制和激活 激素调节 4 19 2020 一 酶的化学本质1 大多数酶是蛋白质 1926年J B Sumner刀豆脲酶结晶证明其为蛋白质 提出酶的本质是蛋白质 m水解的产物是氨基酸 使蛋白质变性的因素也能使酶变性 酶具有两性解离和等电点性质 不能透过半透膜 和蛋白质具有相同的颜色反应 第三节酶的组成 酶是蛋白质的证据 2 ribozyme 核酶 1982年T Cech第1个有催化活性的天然RNA 以后Altman和Pace等又陆续发现了真正的RNA催化剂 核酶的发现不仅表明酶不一定都是蛋白质 还促进了有关生命起源 生物进化等问题的进一步探讨 4 19 2020 单纯酶 simpleenzyme 氨基酸 蛋白质结构决定活性 二 酶的化学组成 各种水解酶 蛋白酶 脂肪酶 淀粉酶等 全酶 holoenzyme 酶蛋白 apoenzyme 脱辅酶 apoprotein 结合酶 conjugatedenzyme 氨基酸 主要决定酶催化专一性 辅因子 cofacor 金属离子或有机小分子化合物 常作为电子 原子或某些化学基团的栽体 只有结合了辅助因子后 才表现出酶的活性 决定酶催化的催化性 4 19 2020 金属离子为辅助因子 金属酶 金属离子为酶的一部分 辅基 金属激活剂 金属离子的作用 酶反应中的催化作用 参与三元络合物 E M S 的形成 稳定酶蛋白构象 氧化还原作用 金属激活酶 羧肽酶 Zn 2 和黄嘌呤氧化酶 Mo 6 各种激酶和核酸酶 Mg2 小分子有机化合物为辅助因子 辅基或辅酶的作用 传递电子 氢或基团 辅基 prostheticgroup 与酶蛋白共价紧密结合 不容易被透析或超滤法除去 如黄素和生物素等辅基 辅酶 coenzyme 与酶蛋白非共价键疏松结合 容易被透析或超滤法除去 如TPP NAD等 4 19 2020 4 19 2020 1 单体酶 最高结构为三级结构 2 寡聚酶 最高结构为四级结构 3 多酶复合物 multienzymesystem 功能相关 不同种类的酶非共价彼此聚合形成的复合物 多酶体系 第五节酶的结构及其催化作用机制 一 酶的结构一般球状蛋白 具有一 二 三 四级结构 一个连续反应链的一系列顺序反应中 催化某一底物经过一系列化学变化转变成最终产物 4 多功能酶 multifunctionalenzyme 或串联酶 tandemenzyme 4 19 2020 多酶复合物 EAB EBC ECD EDE EEF EFG EGH EHP 游离可溶型 可溶型多酶复合体 膜结合多酶复合体 多酶复合物的进化 4 19 2020 主要结构化的多酶复合体 丙酮酸脱氢酶系 脂肪酸合成酶复合体等 丙酮酸脱氢酶系 E coli 包括丙酮酸脱氢酶 E 硫辛酰转乙酰酶 E 二氢硫辛酰脱氢酶 E 4 19 2020 活性中心 底物 肽链 二 酶的活性中心 activecenter 4 19 2020 2 主要特征 1 相对酶整个体积 活性部位占据空间很小 2 位于酶分子特定空间结构区域 分子表面的一部分区域 常位于酶蛋白两个结构域或亚基之间裂隙 或蛋白质分子表面凹槽 1 概念 酶分子中直接与底物结合 并和酶催化作用直接有关的部位 4 19 2020 3 组成 一条或几条多肽链上空间位置比较靠近的氨基酸残基或其基团 4 二个功能部位 结合部位 结合底物 多通过相对弱的力 结合特异性取决于活性部位精确原子排列 催化部位 催化底物转化为产物 包括 COOH NH2 OH SH和咪唑基等 辅助因子参与酶活性中心 4 19 2020 一些酶活性中心的氨基酸残基 酶残基总数活性中心残基牛胰核糖核酸酶124His12 His119 Lys41溶菌酶129Asp52 Glu35牛胰凝乳蛋白酶245His57 Asp102 Ser195牛胰蛋白酶238His46 Asp90 Ser183木瓜蛋白酶212Cys25 His159弹性蛋白酶240His45 Asp93 Ser188枯草杆菌蛋白酶275His46 Ser221碳酸酐酶258His93 Zn His95 His117 4 19 2020 His57 Asp102 Ser195 Cleftforbindingextendedsubstrates 催化三联体 胰凝乳蛋白酶 4 19 2020 催化三联体 4 19 2020 serineprotease 胰凝乳蛋白酶 245 His57 Asp102 Ser195 胰蛋白酶 238 His46 Asp90 Ser183 弹性蛋白酶 240 His45 Asp93 Ser188 ValVal 4 19 2020 S S 活性中心 结合部位 催化部位 4 19 2020 3 酶活性的必需基团 essentialgroup 概念 间接或直接与酶催化活性相关的多肽链上某些氨基酸残基的功能基团 这些基团若经化学修饰改变 则酶活性丧失 类型 4 19 2020 多肽链 底物分子 酶活性中心 催化基团 结合基团 活性中心必需基团 活性中心以外必需基团 4 19 2020 酶降低化学反应所需的活化能 使活化分子数增多 加快反应速度 酶促反应的能力学基础 三 酶的催化作用机制 1 化学反应速率的依赖因素 分子间碰撞频率 有效碰撞分子的百分数 2 促使化学反应进行的途径 加热或光照 为反应体系提供能量 使用催化剂降低反应活化能 3 酶的催化作用与分子活化能 4 19 2020 中间产物学说 酶的催化作用机制 1 中间产物学说 4 19 2020 酶与底物结合特点 1 底物只与酶的活性中心结合 2 可逆 非共价的结合 3 酶与底物通过一种模式进行结合 中间产物存在的证据 同位素32P标记底物法 磷酸化酶与葡萄糖结合 吸收光谱法 过氧化物酶与过氧化氢结合 4 19 2020 1890 Fischer 酶的活性中心结构与底物的结构互相吻合 紧密结合成中间络合物 锁 钥 2 直接契合 directfit 模式 1890年 EmilFischer 锁钥学说 酶和底物是锁与钥匙似的刚性关系 4 19 2020 S E E S复合物 a b c a b c 3 诱导契合 inducedfit 模式 1958 Koshland诱导契合学说 E S 活性部位构象变化以适应底物的结合 4 19 2020 酶活性中心结构是柔性的 当底物 激活剂或抑制剂 与酶分子结合时 底物分子诱导酶蛋白构象发生有利于与底物结合的变化 使反应所需催化基团和结合基团正确排列和定向 转入有效的作用位置 使酶与底物完全吻合 契合形成中间产物酶 底物复合物 诱导契合假说 induced fithypothesis 4 19 2020 1 趋近定向效应 酶将2个底物拉近 以准确的方向碰撞 实际上是将分子间的反应变成类似于分子内的反应 4 使酶具有高催化效率的因素 酶 酶分子形成活性中心 与底物结合 提供各种功能基团 使分子间催化反应转变为分子内催化反应 酶与底物结合过程中 底物分子从稀溶液中密集到活性中心 并使其催化基团与底物反应基团之间正确定向排列 4 19 2020 稳定底物 电荷等相互作用 底物张力变形激活形成过渡态 2 张力 与 形变 效应 酶与底物结合 酶分子使底物分子某些键键能减弱 键扭曲 底物分子变形 降低反应活化能 4 19 2020 3 酸 碱催化 广义酸碱催化 Bronsted的酸碱定义 通过暂时提供 或接受 一个质子 稳定过渡态 加速反应 反应物提供质子 作为碱 或从反应物夺取质子 作为酸 蛋白质中酸或碱性基团 氨基 羧基 咪唑基 巯基和酚基等 影响酸碱催化反应速度因素 酸或碱强度 pK 质子传递速度 His的咪唑基最活跃 4 19 2020 酶活性中心广义酸碱基团 4 19 2020 溶菌酶酸 碱催化反应示意图 4 19 2020 广义酸催化 广义碱催化 结合基团 4 19 2020 4 共价催化 酶分子活性基团与底物以共价键结合 形成过渡态来加速反应 亲核催化 带有多电子的原子如O S和N 可提供电子去攻击底物上相对带正电子的原子 如羰基碳 亲核攻击 亲电催化 是由亲电试剂 具有接受电子对的原子 引起的催化反应 是亲核催化的反过程 Lewis的酸碱电子理论 酸 可接受电子对物质 亲电物质 碱 可提供电子对物质 亲核物质 共价催化又称亲核或亲电子催化 实际上也是酸碱催化 4 19 2020 Ser OH Cys SH His 咪唑基 亲核物质 亲电物质 4 19 2020 5 表面效应或疏水性 口袋 效应 疏水口袋 肽链 底物 4 19 2020 酶与底物过渡态互补 酶与底物过渡态互补 亲合力最强 释放出结合能使ES过渡态能级降低 有利于底物分子跨越能垒 加速酶促反应速度 酶的多元催化作用 多个基元催化形式的协同作用 4 19 2020 His57 Asp102 Ser195 Cleftforbindingextendedsubstrates 245 His57 Asp102 Ser195 胰凝乳蛋白酶 4 19 2020 胰凝乳蛋白酶 4 19 2020 敏感键羰基C定向接近Ser195羟基O 4 19 2020 His57夺走Ser195羟基H Ser195羟基O亲核攻击敏感键羰基C形成带氧阴离子的四面体中间物 转换态 氧阴离子洞 氧阴离子与Ser195 Gly193酰胺H形成氢键使转换态稳定 4 19 2020 His57作为酸催化剂为敏感键 提供质子 肽键断裂 胺释放 生成酰基 酶中间物 4 19 2020 Water thesecondsubstratethenenterstheactivesite 水为His57提供质子 羟基 亲核攻击羰基 形成带氧阴离子的四面体中间物 氧阴离子洞 氧阴离子与Ser195 Gly193酰胺H形成氢键使之稳定 4 19 2020 4 19 2020 His57作为酸催化剂为Ser195羟基O提供质子 四面体中间物键断裂 生成羧酸化合物 4 19 2020 游离酶重新形成 4 19 2020 四 双底物反应 A B P Q 2个底物2个产物称 BiBi 反应 二种类型 序列反应 有序 随机 乒乓反应 4 19 2020 序列反应 4 19 2020 乒乓反应 4 19 2020 乒乓反应 4 19 2020 4 19 2020 酶促反应动力学 研究酶促反应速度及其影响因素 第六节酶促反应动力学 4 19 2020 产物 0时间 酶促反应速度逐渐降低 酶促反应的时间进展曲线 反应速度 单位时间内底物减少或产物增加的速度 常用初速度来衡量 初速度 4 19 2020 影响酶促反应速度的因素 底物浓度 S 酶浓度 E 反应温度pH值激活剂抑制剂 4 19 2020 一 底物浓度对酶促反应速度的影响 当 S 很低时 S 与v 成比例 一级反应当 S 较高时 S 与v 不成比例 混合级反应当 S 很高时 S v不变 零级反应 Vm v S 1 矩形双曲线 4 19 2020 底物饱和现象 底物浓度较高时 反应速度不再随底物浓度增加而增加 达到最大反应速度 中间产物学说解释 在酶浓度和其它条件不变情况下 增加底物浓度可增加反应速度 当底物浓度较高时出现底物饱和现象 底物浓度很低时 中间产物浓度不断增高 底物浓度较高时 不会生成更多中间产物 有多余酶与底物结合 随底物浓度增加 中间产物浓度不断增高 溶液中所有酶的活性中心被底物占据 酶全部与底物结合成中间产物 虽增加底物浓度也不会生成更多中间产物 4 19 2020 S v Km v Vm Km S v Vm K2 E 2 米 曼氏方程 Michaelis Mentenequation 4 19 2020 1 米 曼氏方程解释 当 S Km时 v Vmax Km S 即v正比于 S 当 S Km时 v Vmax 即 S 而v不变 2 米 曼氏方程成立条件 初速度为标准单底物稳态 steadystate 4 19 2020 游离酶浓度 E ES ES生成速度 k1 E ES S ES分解速度 k2 ES k3 ES 当稳态时 ES生成速度 ES分解速度k1 E ES S k2 ES k3 ES 3 推导方程 4 19 2020 Km v 因v k3 ES 当所有E被S饱和时 即达到最大速度 此时 ES E Vmax k3 E 代入上式 k1 K2 k3 4 19 2020 1 Km的意义1 Km值等于最大反应速度一半时的底物浓度2 Km值是酶的特征性常数之一 Km值范围在10 6 10 2mol L3 k2 k3时Km可用来表示酶对底物的亲和力大小 Km与酶对底物亲和力大小成反比 3 Km的意义 4 19 2020 当反应速度达到最大反应速度的90 则 90 V 100 V S km S 即 S 9km 在进行酶活力测定时 通常用4km的底物浓度即可 4 从km的大小 推测正确测定酶活力时所需的底物浓度 4 19 2020 5 km推断某一代谢物在体内可能的代谢途径 丙酮酸 乳酸 乙酰CoA 乙醛 乳酸脱氢酶 1 7 10 5 丙酮酸脱氢酶 1 3 10 3 丙酮酸脱羧酶 1 0 10 3 当丙酮酸浓度较低时 代谢走哪条途径决定于km最小的酶 4 19 2020 根据实验数据作图直接求得 先测定不同底物浓度的反应初速度 v 从v与 S 的关系曲线求得Vm 然后再从1 2Vm求得相应的 S 即为km 近似值 4 Km值与Vmax值测定 v 012345678 10 6 Km值 Vm S 4 19 2020 双倒数作图法 林 贝氏 Lineweaver Burk 作图法 1934 1 V 1 Km 斜率 Km Vmax 1 Vmax 1 S 0 4 19 2020 二 酶浓度对反应速度的影响 当 S E 式中Km可以忽略不计 k2 E 在有足够底物和其他条件不变的情况下 v k E 反应速度与酶浓度成正比 4 19 2020 三 温度对酶促反应速度的影响 温度对唾液淀粉酶活性的影响 酶的最适温度 酶活性最高时的温度 也即酶的催化效率最高 酶促反应速度最大时的温度 植物 40 50 动物 35 40 嗜热细菌 TaqDNA聚合酶70 93 不失活用于PCR 两种影响 1 最适温度前 温度升高 活化分子数增多 反应速度加快 2 最适温度后 温度升高 热变性速度加快 最适温度 4 19 2020 四 pH对酶促反应速度的影响 最适pH optimumpH 1 最适pH 表现出酶最大活性的pH值 2 偏离最适pH 酶活性降低 过酸 过碱酶变性失活 3 pH稳定性在一定的pH范围内酶是稳定的 4 19 2020 pH对酶作用的影响机制 1 影响酶活性基团的解离 影响底物的解离 2 环境过酸 过碱使酶变性失活 最适温度 最适pH不是酶的特征常数 会受到酶的浓度 底物以及缓冲液的种类等因素的影响 4 19 2020 五 激活剂对酶促反应速度的影响 1 激活剂 凡能使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质 如 金属离子 Mg2 K Mn2 阴离子 Cl 有机物 胆汁酸盐2 分类 必需激活剂 使酶活性由无变有例如 Mg2 对己糖激酶非必需激活剂 使酶活性显著增加例如 Cl 对淀粉酶 4 19 2020 使酶必需基团或活性部位基团化学性质改变而降低酶活力甚至使酶失活 六 抑制剂对酶促反应速度的影响 抑制作用 间接或直接地影响酶的活性中心 使酶活性降低或丧失 抑制剂 I 降低酶活性而不引起酶蛋白变性的物质 4 19 2020 I EI 4 19 2020 不可逆抑制剂的作用 可逆抑制剂的作用 抑制程度是由酶与抑制剂之间的亲和力大小 抑制剂的浓度以及底物的浓度决定 4 19 2020 抑制剂与酶必需基团以牢固共价键结合 使酶丧失活性 不能用透析超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性 1 不可逆抑制 irreversibleinhibition 抑制剂与酶的结合是不可逆的 无I 不可逆抑制剂 4 19 2020 例1 巯基酶的抑制 SHSE Hg2 EHg 2H SHS SHClSE As CH CHClEAs CH CHCl 2HClSHClS 路易士气 4 19 2020 SEHg S COONaCHSHCHSHCOONa SHE HgSH COONaCHSCHSCOONa 二巯基丁二酸钠 解毒方法 4 19 2020 有机磷化合物羟基酶磷酰化酶 失活 ROOROOROXROO E P E OHP HX 例2 羟基酶的抑制 羟基酶 丝氨酸侧链羟基为必需基团 敌百虫 敌敌畏 对硫磷 4 19 2020 常见不可逆抑制剂 有机磷化合物 有机汞 砷化合物 重金属盐 烷化试剂 氰化物 等 4 19