动物急性毒性实验报告.doc

苏州科技大学生物实验中心学生实验报告 生物工程综合实验 生物工程综合实验动物急性毒性实验实验报告集 班级 生工1411 学号 姓名 苏州科技大学化学生物与材料工程学院 2017年实验室学生守则一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员的指导。二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。凡不按教师的指导擅自操作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室外。五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和吃东西。六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管理人员报告。七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。预 习 报 告名称动物急性毒性实验日期2017.11.27-2017-12.1实验目的和要求：使学生了解毒理学研究中动物实验的常规操作方法和技术；了解和掌握为了测定一种未知的环境化学物对有机体是否是安全的，必须进行哪些试验，获得哪些必要的数据；这些试验的基本步骤是什么，试验数据应该如何处理。了解和掌握实验动物的选择、抓取、常规染毒和生物材料的采集方法等内容、学习和掌握急性毒性试验和生物指标试验的目的，原理，以及测定相关的参数，如半数致死剂量，生长抑制效应等所需要的方法和步骤。实验材料：活环毛蚓主要仪器：人工气候箱，分光光度计，冷冻离心机，试管13支，移液器，振荡水浴锅，烧杯，研钵等主要步骤：1. 清肠：挑选一定数量具有生殖环带的健康蚯蚓，用蒸馏水清洗，放于烧杯中，用保鲜膜封口，解剖针扎孔。将烧杯置于温度为202 ，湿度约75%的人工气候箱中清肠24h。2. 溶液配制：在直径18cm的培养皿(或以1000mL烧杯代替)底铺衬滤纸，以刚好遮住皿底为宜。按预备实验确定的剂量，配制系列浓度，取适量倒入培养皿中，以刚好浸没滤纸为宜3. 滤纸实验(1). 将清肠后的蚯蚓用去离子水冲洗干净，滤纸吸干体表水分(2). 每组10条蚯蚓分别称重，测量体长，供试(3). 每一培养皿放入10条蚯蚓(4). 保鲜膜封口，解剖针扎孔。4. 培养与观察将培养皿置于人工气候箱中培养，设置标准实验条件：温度为202，湿度为757%; 光照为1333 lx（间歇光照，即12h光照， 12h黑暗）。计算Cd2+ 暴露后蚯蚓18h的LC50、24h的LC50。5. 低浓度Cd2+急性毒性试验(l). 在确定蚯蚓的24h LC50 后，进行蚯蚓急性毒性实验。设置空白对照组，空白对照组用去离子水代替受试物；染毒实验前重复上述（1）步骤的清肠。(2). 在蚯蚓的致死范围内设置4个浓度梯度（0、1/5LC50、1/3 LC50、1/2 LC50）进行蚯蚓急性毒性试验。每组8条。(3). 实验24h 后取各浓度处理组蚯蚓3 条做平行试验，洗净剪取其环带前部分，用磷酸缓冲液洗掉表面血液，用滤纸吸干水分，放入研钵加2 mL 磷酸缓冲液进行研磨，再进行离心（9，000 rmin-1）10 min，上清液即为粗酶液。(4).采用改进邻苯三酚自氧化法测定SOD活性。邻苯三酚自氧化速率的测定：取4.5mL0.1molL -1Tris-HCl（pH =8.2）缓冲液，4.2 mL蒸馏水，混匀后在25水浴保温20 min，取出后立即加入25预热过的3 mmolL-1 邻苯三酚0.3 mL（以10 mmolL -1 HCl 配制，空白管用10 mmolL -1HCl代替邻苯三酚的HCl 溶液），在25恒温水浴锅中水浴，迅速摇匀倒入比色皿（光径1 cm），每隔30 s在325 nm处测定吸光度A值1次，共测3min。计算线性范围内每分钟A 的增值，此即为邻苯三酚的自氧化速率。样品中SOD 酶活力测定：加入邻苯三酚前，先加入一定体积的SOD 粗酶液（约0.2 mL，需稀释），蒸馏水减少相应体积（即粗酶液和蒸馏水总体积为4.2 mL），其它均与上述中所述一致，计算加粗酶液后邻苯三酚自氧化速率。需稀释至3min内数值均有变化；数值大于1。每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为一个酶单位。酶活性单位的计算公式如下：教师签名： 实验报告动物急性毒性实验一、 实验目的：使学生了解毒理学研究中动物实验的常规操作方法和技术；了解和掌握为了测定一种未知的环境化学物对有机体是否是安全的，必须进行哪些试验，获得哪些必要的数据；这些试验的基本步骤是什么，试验数据应该如何处理。二、实验原理滤纸接触法毒性实验简单易行，实验时间短，实验成本较低，可对受试物毒性进行初筛。 将蚯蚓与湿润的滤纸上的受试物接触，可测定土壤中受试物对蚯蚓的潜在影响。动物机体中有一套有效的抗氧化防御系统（Antioxidant defense），包括过氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶 （Glutathione peroxidase, GPx）、过氧化氢酶（Catalase, CAT）等，它们可分解进入生物体有伤害作用的异源氧化物。由于能反映多种污染物的毒性，而且其变化可定量检测，因此抗氧化酶常被用作指示环境污染的早期预警，是分子生态毒理学生物标志物的研究热点之一。三、实验材料与方法1、实验材料与试剂：活环毛蚓氯化镉，Tris-HCl溶液，邻苯三酚，磷酸缓冲液2、实验仪器：人工气候箱，分光光度计，冷冻离心机，试管13支，移液器，振荡水浴锅，烧杯，研钵。3、实验方法：1. 清肠将直径11cm的滤纸铺于1000mL烧杯杯底（或培养皿），加少量水，以刚浸没滤纸为宜。挑选一定数量具有生殖环带的健康蚯蚓，用蒸馏水清洗，放于烧杯中，用保鲜膜封口，解剖针扎孔。将烧杯置于温度为202 ，湿度约75%的人工气候箱中清肠24h。 2. 溶液配制在直径18cm的培养皿(或以1000mL烧杯代替)底铺衬滤纸，以刚好遮住皿底为宜。按预备实验确定的剂量，配制系列浓度，取适量倒入培养皿中，以刚好浸没滤纸为宜。3. 滤纸实验(1). 将清肠后的蚯蚓用去离子水冲洗干净，滤纸吸干体表水分。(2). 每组10条蚯蚓分别称重，测量体长，供试。(3). 每一培养皿放入10条蚯蚓。(4). 保鲜膜封口，解剖针扎孔。4. 培养与观察 (l). 将培养皿置于人工气候箱中培养，设置标准实验条件：温度为202，湿度为757%; 光照为1333 lx（间歇光照，即12h光照， 12h黑暗）。 (2). 在202环境培养。 (3). 18h 、24h各计数1次，记录死亡数，同时还有蚯蚓的病理症状和行为。蚓体对针刺无反应判为死亡。24h后每组活蚯蚓分别称重，测量体长。24h后结束实验。 (4).计算Cd2+ 暴露后蚯蚓18h的LC50、24h的LC50。5. 低浓度Cd2+急性毒性试验 (l). 在确定蚯蚓的24h LC50 后，进行蚯蚓急性毒性实验。设置空白对照组，空白对照组用去离子水代替受试物；染毒实验前重复上述（1）步骤的清肠。(2). 在蚯蚓的致死范围内设置4个浓度梯度（0、1/5LC50、1/3 LC50、1/2 LC50）进行蚯蚓急性毒性试验。每组8条。 (3). 实验24h 后取各浓度处理组蚯蚓3 条做平行试验，洗净剪取其环带前部分，用磷酸缓冲液洗掉表面血液，用滤纸吸干水分，放入研钵加2 mL 磷酸缓冲液进行研磨，再进行离心（9，000 rmin-1）10 min，上清液即为粗酶液。 (4).采用改进邻苯三酚自氧化法测定SOD活性。 邻苯三酚自氧化速率的测定：取4.5mL0.1molL -1Tris-HCl（pH =8.2）缓冲液，4.2 mL蒸馏水，混匀后在25水浴保温20 min，取出后立即加入25预热过的3 mmolL-1 邻苯三酚0.3 mL（以10 mmolL -1 HCl 配制，空白管用10 mmolL -1HCl代替邻苯三酚的HCl 溶液），在25恒温水浴锅中水浴，迅速摇匀倒入比色皿（光径1 cm），每隔30 s在325 nm处测定吸光度A值1次，共测3min。计算线性范围内每分钟A 的增值，此即为邻苯三酚的自氧化速率。 样品中SOD 酶活力测定：加入邻苯三酚前，先加入一定体积的SOD 粗酶液（约0.2 mL，需稀释），蒸馏水减少相应体积（即粗酶液和蒸馏水总体积为4.2 mL），其它均与上述中所述一致，计算加粗酶液后邻苯三酚自氧化速率。需稀释至3min内数值均有变化；数值大于1。 四、实验结果与分析：1、受试物的基本物化性质；实验动物的饲养条件（包括温度、湿度、光照条件等）。氯化镉：外观与性状：无色单斜晶体 熔点()：568 相对密度（水=1）：4.05沸点()：960溶解性：易溶于水，溶于甲醇、乙醇。水溶液中的镉离子可被硫离子沉淀。蚯蚓的饲养条件：温度18-22，光照，保证湿度2、染毒处理前后蚯蚓外观生长发育变化表（体重、体长、行为等）。表1 Cd2+染毒处理前蚯蚓外观生长发育变化表项目Cd2+处理浓度（mg L-1）0(CK)12345数量（条）111111111312总体重（g）6.106.215.935.826.165.77平均体重（g）0.550.560.540.530.470.48平均体长(cm)6.747.126.956.687.36.22行为正常蠕动正常蠕动正常蠕动正常蠕动正常蠕动正常蠕动表2 Cd2+染毒处理24h后蚯蚓外观生长发育变化表项目Cd2+处理浓度（mg L-1）0(CK)12345数量（条）1111111040总体重（g）5.726.214.474.111.160平均体重（g）0.510.560.410.410.290平均体长(cm)6.436.656.295.364.50行为正常蠕动蠕动减弱蠕动减弱蠕动减弱蠕动减弱无分析：由表1，2可见除了全部死亡的蚯蚓之外，在体重和体长方面，其余各组的蚯蚓总体重和平均体重均减小，平均体长均减小，浓度最高的一组减小的幅度最大。在蚯蚓的行为活动方面，染毒前蚯蚓活力旺盛，正常蠕动，Cd2+处理24小时之后，除对照组里的蚯蚓正常蠕动之外，其余各组的蚯蚓的行为活动均受到不同程度的影响，蠕动速度随着Cd2+的浓度升高而逐渐减弱3、致死时各组蚯蚓个体的形态和解剖观察：观察结果主要部位（环状带）。解剖后蚯蚓的形态观察：1组为对照组，可清晰地观察到蚯蚓的体腔清晰透明，血管呈鲜红色，肠道为正常的棕灰色，生殖腺呈白色球状，对称分布与两侧，结构完整。2组染毒浓度较低，与1组差距不大，但血管颜色略微变深，肠道略微发黑。从3组开始，随着染毒浓度的升高，体色逐渐变浅，体腔逐渐浑浊，血管颜色变深发黑，肠道颜色发黑，和体腔粘合在一块，生殖腺破碎化脓，颜色略微发黄，不再是纯白色的球状。染毒18小时蚯蚓形态观察：1组为对照组，2-6组浓度梯度逐渐增加，由上图观察得，除对照组体表正常，蠕动正常之外，2-4组未死的蚯蚓出现部分症状，蠕动能力明显减弱，身体变软萎缩，体色变浅，环带肿大充血呈黄色，有黄色体液渗出。5组和6组两个浓度梯度蚯蚓有断裂现象，有的断成多节，呈串珠状；滤纸上有血迹。染毒24小时蚯蚓形态观察：1组为对照组，由于18小时第6组全部死亡，所以2-5组浓度梯度逐渐增加，对照组体表正常，但由于缺乏养分，蠕动速度减慢，成团聚集在一起，2-3组正常存活，但上述症状更加明显，且成团聚集，4-5组出现死亡，死亡的蚯蚓症状如上所述，而存活的蚯蚓体色明显变浅，几乎不蠕动，同样成团聚集。4、记录不同受试物浓度对应的死亡情况，以剂量对数为横坐标，死亡百分率为纵坐标作 图并求得半数致死浓度LC50。表3 Cd2+染毒处理18h后蚯蚓的死亡情况统计表项目Cd2+处理浓度（mg L-1）0(CK)12345数量（条）111111111312死亡数（条）0000712死亡率（%）000053.8%100%平均死亡数（条）0.275平均死亡率（%）25.6%计算出18h的LC50=1557.908表4 Cd2+染毒处理24h后蚯蚓的死亡情况统计表项目Cd2+处理浓度（mg L-1）0(CK)12345数量（条）111111111312死亡数（条）0001912死亡率（%）0009.1%33.3%100%平均死亡数（条）0.318平均死亡率（%）29.7%计算出24h的LC50=1314.8115、计算并分析Cd2+处理对环毛蚓SOD酶活的影响。1) 邻苯三酚的自氧化速率计算可得A=0.0532) Cd2+处理对环毛蚓SOD酶活的影响各处理样品的邻苯三酚的自氧化速率Cd2+处理对环毛蚓SOD酶活的影响SOD酶活Cd2+处理浓度（mg L-1）0(CK)1/5LC501/3LC501/2LC5010.0500.1130.1500.19720.0750.0960.1380.18430.0620.1050.1420.201平均酶活性0.0620.1050.1430.194分析：随着Cd2+处理浓度增加，环毛蚓SOD的平均酶活性增加。因为SOD（超氧化物歧化酶）是生物体内重要的抗氧化酶，具有特殊的生理活性，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，所以随着Cd2+ 浓度升高，环毛蚓体内代谢有毒物质的速度也越来越快，因此SOD酶活性越来越高。6、蛋白质的测定Cd2+处理浓度（mg L-1）0(CK)1/5LC501/3LC501/2LC50体重（g）0.440.420.360.47蛋白浓度(g/L)1.1581.6572.1552.654五、结论本次实验的目的在于解毒理学研究中动物实验的常规操作方法和技术，了解测定一种未知的环境化学物对生物体是否是安全的，必须进行哪些试验，获得哪些必要的数据；这些试验的基本步骤是什么，试验数据应该如何处理等等。同时我们也了解了实验动物蚯蚓的生活习性和受试物氯化镉的理化性质，和掌握了急性毒性试验以及测定相关的参数，如半数致死剂量，生长抑制效应等所需要的方法和步骤。通过对蚯蚓染毒前后的性状比较可从表观上观察到重金属对有机体的巨大毒害作用，而通过计算蚯蚓体内消除有毒物质的SOD酶活性，可充分认识到生物体对外来有毒物质的侵害做出的一系列应对措施。近年来，随着人口增加及经济发展，我国面临的土壤环境安全问题越加突出。重金属和石油类的污染，致使生态