内毒素耐受对急性肝功能衰竭大鼠肝脏CXCR7表达的影响

_内毒素耐受对急性肝功能衰竭大鼠肝脏CXCR7表达的影响【摘要】目的通过研究内毒素耐受（endotoxintolerance，ETT）对急性肝功能衰竭（acuteliverfailure，ALF）大鼠肝组织中趋化因子受体7（chemokinereceptor7，CXCR7）表达变化的影响，探讨ETT发生的可能机制。方法雄性SD大鼠随机（随机数字法）分为健康对照组（N组）、急性肝功能衰竭组（ALF组）和内毒素耐受组（ETT组）。ETT组和ALF组先分别以0.1mg/kg脂多糖（lipopoIysaccharide，LPS）和生理盐水腹腔注射，每日1次，于第5次注射24h后同时腹腔注射D-氨基半乳糖（D-galactosamine，D-GalN）（800mg/kg）和LPS（8g/只），分别在注射后2、6、12、24、48h时间点留取大鼠血及肝脏标本。RT-PCR法检测肝组织中CXCR7mRNA表达；Westernblot法检测CXCR7蛋白表达。统计处理采用LSD检验、Dunnetst检验。结果ETT组大鼠肝组织病理改变较ALF组明显减轻；ETT组肝组织CXCR7mRNA表达水平虽高于正常组，但却明显低于ALF组，与ALF组比较，差异均具有统计学意义（2、6、12、24、48h时间点比较，F值分别为29.222、166.892、38.975、34.603、18.929，均P【关键词】内毒素；肝功能衰竭；趋化因子受体7Theeffectofendotoxintoleranceontheexpressionofchemokinereceptor7inratswiththeacutehepaticfailureHONGQiao，WANGKe-yin，SHIChun-wei，DONGJin-zhong，LINZhuo，LUMing-qin，CHENYong-ping.DepartmentofInfectionDiseases，FirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege，Wenzhou325000，ChinaCorrespondingauthor：LUMing-qin，Email：LMQ0906163.com【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectofendotoxintolerance（ETT）onchemokinereceptor7（CXCR7）inthelivertissueofratswithacuteliverfailure（ALF）.MethodsSDmaleratswererandomlydividedintothreegroups：normalgroup，ALFgroupandETTgroup.TheratsintheETTgroupandALFgroupwereinjectedwithlipopolysacharide（LPS）0.1mg/kgorsalinerespectively，onetime/dayfor5days.At24hoursafterthe5th-dayinjection，allratswereinjectedwithD-GalN800mg/kgandLPS8g/rat.Bloodsampleandlivertissuewerecollectedon2，6，12，24and48hoursafterinjection.ThegeneexpressionsofCXCR7intheliverweremeasuredbyRT-PCR，andtheproteinexpressionsofCXCR7weredeterminedbyWesternBlot.ThedataanalysiswasperformedbyLSD，Dunnettsttest.ResultsThehistologicaldamageinthelivertissuewassignificantlymiderinETTgroupcomparedtoALFgroup.ThegeneexpressionsofCXCR7weresignificantlymilderinETTgroupcomparedtoALFgroup（2h：F=29.222，6h：F=166.892，12h：F=38.975，24h：F=34.603，48h：F=18.929，allP急性肝功能衰竭时肝细胞发生大面积坏死，单核巨噬系统分泌大量炎性因子（如TNF-、IL-6等），加重肝细胞损伤，库普弗细胞解毒能力下降，促使机体发生内毒素血症，内毒素又激活单核巨噬系统，形成恶性循环，因此，炎症反应和内毒素血症在肝衰竭的发生发展中起着至关重要的作用1-3。机体或单核-巨噬细胞经LPS预处理后，对LPS的再次刺激呈低反应或无反应的现象，称为内毒素耐受（endotoxintolerance，ETT）4。研究表明，CXCR7是趋化因子受体（CKRs）家族中的重要成员，参与细胞吸引、免疫反应、保护细胞、抗凋亡等生理病理过程5-6。本实验通过观察CXCR7mRNA和CXCR7蛋白在内毒素耐受和急性肝功能衰竭大鼠肝组织中的表达，探讨CXCR7在内毒素耐受机制中的可能作用。1材料与方法1.1材料66只6周龄、体质量180220g的SPF级雄性SD大鼠购自中国科学院上海实验动物中心；D-GalN购自南通通吕生物制品有限公司；LPS购自上海闪晶生物技术有限公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成提供；RT-PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；GAPDH、辣根酶标记抗兔（鼠）IgG购于北京中杉金桥生物技术有限公司，CXCR7抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司。1.2实验方法1.2.1建立模型66只SD大鼠随机（随机数字法）分为3组：N组6只，ALF组30只、ETT组30只，各亚组6只。ETT组将50g/mlLPS溶于生理盐水，0.1mg/（kgd）连续腹腔注射5d，N组和ALF组注射等量生理盐水。第5天开始禁食，24h后，ALF组与ETT组腹腔同时注射D-GalN（800mg/kg）和LPS（8g/只），D-GalN按100mg/ml溶于生理盐水，pH调和至7.2。两组分别2、6、12、24、48h时间点各取6只，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后剖腹，门静脉取血，离心取上清液备检，留取肝组织。部分肝组织用中性甲醛固定，待做病理切片；余下组织剪碎，迅速置液氮冻存。1.2.2肝脏组织病理检查各时间点肝组织经甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE染色后显微镜观察并拍照分析肝组织结构变化。1.2.3血清ALT、AST检测采用全自动生化分析仪检测各时间点血清ALT、AST的变化。1.2.4RT-PCR检测依mRNA提取试剂盒步骤提取肝组织总RNA，紫外分光光度仪对所提RNA行定量分析，保留样本光密度（D260/D280）比值保持在1.82.0之间来提高样品纯度，记录样品浓度，将各不同时间点样品质量浓度用DEPC水均调至400ng/l后行逆转录反应，上样体积为10l。CXCR7引物序列：上游引物5-CAGCCGCGAGGTCACTTGGT-3，下游引物5-ACTGCACGGTGTCCACGACG-3，扩增片断长136bp，RT反应条件：3010min，4230min，995min，55min，1个循环；PCR反应条件：942min，9430s，6030min，7220s，38个循环。-actin引物序列：上游引物5-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3；下游引物5-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3，扩增产物452bp，PCR反应条件：945min，9430s，6130s，7230s，25个循环。PCR产物以20%琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外光凝胶成像分析系统下拍照并进行条带灰度分析，测定光密度值，最后以CXCR7mRNA/-actin值代表CXCR7mRNA的相对含量。1.2.5Western-blot检测以细胞裂解液提取总蛋白，双辛可宁酸（BCA）法测定浓度，50g蛋白样品上样，用10%的SDS-PAGE凝胶垂直电泳分离。电泳结束后，将蛋白转至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉室温封闭1h后，加12000稀释的一抗4过夜，TBST漂洗3次，每次5min，加入1800CXCR7抗体室温孵育1h，用TBST洗3次，暗室中曝光和显影。内参为GAPDH，以11000稀释。条带灰度分析使用QuantityOneMannual软件系统，最后以CXCR7/GAPDH值代表CXCR7蛋白的相对含量。1.3统计学方法采用SPSS17.0软件进行统计学分析，数据用均数标准差（xs）表示，进行正态性检验和方差齐性分析，方差齐者采用LSD-t检验，方差不齐者采用Dunnetst检验，以P2结果2.1肝组织病理变化N组大鼠肝组织小叶结构正常，肝板以中央静脉为中心呈条索状向四周放射状排列。ALF组注射D-GalN/LPS后24h时显示大片肝细胞坏死，坏死周围可见肝细胞不同程度的气球样变及嗜酸性变，小叶结构欠清，肝索紊乱甚至断裂，坏死区、汇管区见大量炎症细胞浸润，肝组织损伤严重。ETT组注射后24h时显示肝小叶中央静脉周围结构尚可，肝细胞坏死及肝索紊乱程度较ALF组明显减轻，汇管区炎性细胞浸润也明显减少。见图1。2.2血清ALT、AST检测结果ALF组大鼠造模后2h时血清ALT、AST均明显高于N组，24h达峰值，各时间点ALT、AST检测结果与N组比较，差异均有统计学意义（ALF组：F=87.125、1254.964、1239.025、931.199、258.315，均PALF组、ETT组2h时CXCR7mRNA表达水平较N组显著升高，差异均具有统计学意义（P2.4肝组织CXCR7蛋白的表达ALF组、ETT组2h时CXCR7表达水平即升高，24h时均达峰值，且与N组比较差异均具有统计学意义（P0.05）。见图3，表2。3讨论内毒素耐受是指以小剂量内毒素或其同系物预处理机体或细胞后，短期内再给予内毒素时，机体或细胞表现为低反应性或无反应的一种状态7。多数学者认为，内毒素耐受是一种保护性调节机制，可避免机体对大量内毒素刺激产生持续过度的反应8。本实验验通过建立大鼠ETT模型，结果发现ETT组肝组织病理改变较ALF组明显减轻，同时血清ALT、AST水平也明显下降，证实ETT状态可明显减轻肝组织炎性坏死及肝功能损害的严重程度。由于内毒素耐受状态时机体能抵抗大剂量内毒素的毒性作用，因而有学者提出将其作为预防性治疗，以降低内毒素血症导致的病死率，但内毒素临床应用的安全性尚待评估9。因此，阐明内毒素耐受机制在减轻内毒素相关疾病的研究中显得尤为必要。近年来，从细胞内信号转导途径、基因转录调控水平来探讨内毒素耐受的发生机制逐渐成为研究的热点，Triantafilou等10发现LPS受体识别并非单一受体作用，LPS与CD14结合后激发多种生物活性分子，形成LPS受体簇后共同完成信号转导，发现CXCR参与其中，因此，推测趋化因子受体（CKRs）成员可能参与ETT的发生过程。CXCR7是CKRs家族中的重要一员，广泛表达于淋巴细胞、活化的内皮细胞和胎肝细胞等转化细胞表面11，在炎症反应、免疫调节、细胞凋亡、血管病理生理等12方面发挥不同程度的作用。本研究结果发现，CXCR7mRNA和CXCR7蛋白在正常肝组织中仅有少量表达；ALF组造模后2h时CXCR7mRNA和CXCR7蛋白均明显升高，分别于12、24h达峰值；ETT组造模后2h上述指标也示升高，且均于24h升至峰值，但与ALF组比较升高幅度明显下降，相同时间点的CXCR7mRNA进行比较，差异均有统计学意义（P参考文献1陈华文，祝伟，李树生，等.内毒素预处理对内毒素血症大鼠肝衰竭的保护作用J.中华急诊医学杂志，2009，18（3）：262-265.2NakanoY，KondoT，MatsuoR，etal.Plateletdynamicsintheearlyphaseofpostischemicliverinvivo.J.SurgRes，2008，149（2）：192-198.3刘宝，王华，邵敏，等.加贝酯D-氨基半乳糖加脂多糖引起的大鼠急性肝衰竭的保护作用J.中华急诊医学杂志，2006，15（7）：612-615.4ShiDW，ZhangJ，JiangHN，etal.LPSpretreatmentamelioratesmultipleorganinjuriesandimprovessurvivalinamurinemodelofpolymicrobialsepsisJ.InflammRes，2011，60（9）：841-849.5JuarezJ，BendallL，BradstockK，etal.Chemokinesandtheirreceptorsastherapeutictargets：theroleoftheCXCL12/CXCR4axisJ.CurrPharmDes，2004，10（11）：1245-1259.6HattermannK，Held-FeindtJ，LuciusR，etal.ThechemokinereceptorCXCR7ishighlyexpressedinhumangliomacellsandmediatesantiapoptoticeffectsJ.CancerRes，2010，70（8）：3299-3308.7MatsushitaH，OhtaS，ShiraishiH，etal.endotoxintoleranceattenuatesairwayallergicinflammationinmodelmicebysuppressionoftheT-cellstimulatoryeffectofdendriticcellsJ.IntImmunol，2010，22（9）：739-747.8MeloES，BarbeiroHV，ArigaS，etal.ImmunecellsandoxidativestressintheendotoxintolerancemousemodelJ.BrazJMedBiolRes，2010，43（1）：57-67.9武文，朱玉珍，韩德平，等.Alpha-黑素细胞刺激素对内毒素血症小鼠肝肺组织表达高迁移率族蛋白1的抑制作用J.中国急救医学，2008，28（5）：426-429.10Triantafilou