【毕业学位论文】（Word原稿）水稻抗白叶枯病基因Xa23的图位克隆作物遗传育种博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 水稻抗白叶枯病基因 图位克隆 文摘要 植物抗病基因的研究一直是植物分子生物学研究的热点之一，到目前为止已分离了 近 70个植物抗病基因。水稻中已经鉴定 32 个主效抗白叶枯病基因， 其中 年已被分离克隆。在众多的水稻抗白叶枯病基因中，被育种利用的并不多 。 所以克隆和研究新的抗白叶枯病基因是水稻抗病研究的客观要求 。 从我国普通野生稻中鉴定发掘的 具有抗谱广、完全显性、全生育期抗性等特点，并已培育成以 金刚 30（ 背景的近等基因系 本研究利用 2代的 2562个单株为作图群体，对 建； 序 ；遗传转化等 方法克隆 要结果如下： 1. 子标记定位：根据日本水稻基因组计划 数据，筛选并合成 12 个 记的引物，进行亲本间多态性检测。找到 2 个在 有多态性的标记 2群体中的 571个感病单株进行分子检测和连锁分析， 结果表明 该标记与 记辅助选择的正确率接近 100%。 2. 利用相关基因组文库进行分子标记定位：通过筛选水稻明恢 63的 库和广陆矮 4号的 得 15 个末端片段， 其中 6个 末端片段 在双亲间有多态性 ，分别为 69B、 81N、 45B、45N、 84N 和 84B。 这些标记与 遗传距离依次为 1.1 了 一侧的遗传图谱，并使其遗传距离缩短到 0.4 3. 开发新的 记 进行 据国际水稻基因组计划测序的水稻品种日本晴的序列及上述定位的区域为依据 设计 特异 引物， 共开发出 8 个 新的分子标记 用这些标记对 标记 别为 于同一侧， 遗传距离 为 于基因另一侧， 0 4. 构建了 库，该文库包含 36,096 个克隆，平均插入片段 108盖水稻基因组 。 用紧密连锁标记 记 到 5个阳性克隆 6471916 59建立了跨叠克隆群，将 因锁定在 隆 6经脉冲电泳检测其插入片段为 80 5. 对 序列测定， 成功获得 72115 续序列。通过基因预测共有 12 个开放阅读框（ ，分别编码不同的基因，根据 码产物的同源性比较以及分子标记的位置，最后锁定 6 个 侯选基因。 6. 运用农杆菌介导转化法将选取的 10 个侯选基因克隆载体转化到受体品种中，共得到 1350株转基因苗。其中侯选基因载体 化受体牡丹江的 258 株 转基因苗，经田间接种鉴定，有 23 株表现抗病，其中 17 株表现高抗， 6 株表现中抗。其它侯选基因克 隆的转基因苗对小种表现感病。 潮霉素基因 交检测抗病株拷贝数，高抗和中抗中既有单拷贝又有双拷贝，证明所有抗病株都是转基因。结果 表明 有的基因就是本研究所克隆的目标基因成功克隆 因 。 7. 已知的其它已克隆的植物抗病基因都不同源，说明 因是一类新型的抗病基因。 关键词 : 水稻，抗白叶枯病基因 位克隆 is of of of It is to in BB . its In a F2 562 AC of AC as 1 on 12 in 2 ST 189 189 in 189 00%. 2 A 3 a .8 NA by of ST 189 AC AC of 5 2 9B, 81N, 45B, 45N, 84N 4B as 9B, 81N, 45B, 45N, 84N 4B to .4 0.4 0.5 0.6 0.6 cM .1 3 on of we CR 2 on on 4 6,096 an 08on a 30of .1 AC 6471916O8 9F8 a AC O8 an 0Kb as 5. O8 by a 2115bp by (0 by 189 a 58 23 6. of 17 6. we 189 to 7. is a of 录 中文摘要 V 英文摘要 录 略词表 一章 文 献 综 述 . 1 植物抗病基因研究进展 . 1 植物一病原菌互作的分子机制 . 1 植物抗病基因克隆策略及方法 . 2 已克隆的抗病基因及功能 分析 . 9 水稻白叶枯病抗性基因研究进展 . 14 水稻白叶枯病概述 . 14 水稻对白叶枯病的抗性 遗传研究 . 15 水稻白叶枯病抗性基因的分子定位 . 18 水稻白叶枯病抗性基因的分离克隆 . 18 水稻抗白叶枯病的分子育种 . 22 第二章 论文选题及技术路线 . 24 立题依据 . 24 研究目标、内容及方 法 . 25 研究目标 . 25 研究内容 . 25 研究方法 . 25 技术路线 . 26 第三章 水稻抗白叶枯病基因 精细定位 . 27 前 言 . 27 . 27 材料与方法 . 27 结果与分析 . 29 论 . 31 利用相关基因组文库加密 . 32 材料与方法 . 32 结果与分析 . 33 讨 论 . 36 开发新的 记进行 . 37 材料与方法 . 37 结果与分析 . 38 讨 论 . 41 第四章 因近等基因系 库构建及跨叠克隆群 . 43 前 言 . 43 材料与方法 . 43 植物材料 . 43 载体 . 43 . 44 选 . 47 结果与分析 . 47 . 47 库构建 . 48 筛选阳性 . 50 构建覆盖 . 50 侯选阳性 克隆的稳定性检测及插入片段大小 . 51 讨 论 . 52 构建 库优化体系的建立 . 52 快 速筛选文库的方法 . 53 覆盖 因跨叠克隆群的构建 . 53 第五章 库构建、测序及生物信息学分析 . 54 前 言 . 54 材料与方法 . 54 . 54 小片段 . 54 目标片段 库 . 55 亚克隆文库的测序、拼接及预测 . 56 结果与分析 . 57 . 57 目的片段 . 57 克隆文库构建 . 58 序及拼接 . 59 生物信息学分析 . 59 X 讨 论 . 61 库测序应注意的问题 . 61 序列拼接中的难题 . 62 基因组中的重复序列 . 62 关于 因座位 . 62 第六章 选基因的遗传转化及功能验证 . 64 前 言 . 64 材料与方法 . 64 水稻转化受体材料 . 64 筛选 库 . 64 电极法转化农杆菌 . 65 水稻转化受体系统的建立 . 66 转基 因植株的鉴定 . 67 结果与分析 . 68 筛选侯选基因的 . 68 农杆菌介导的水稻遗传 转化 . 68 转基因植株的鉴定 . 69 . 73 讨 论 . 73 转化受体的选择 . 73 选取 达载体的优点 . 73 田间接种鉴定验证转基因的可靠性 . 73 转基因植株分子检测与田间接种鉴定不统一的原因 . 74 . 74 . 74 第七章 结 论 . 76 参考文献 . 77 致 谢 . 88 作者简介 . 89 文 缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 2,4,4,46苄 青 霉素 乙酰丁香酮 部基本序列搜索工具 bp 基对 羧苄青霉素 头孢噻吩钠 CH 解酪蛋白 蒸无菌水 化已锭 达序列标签 潮霉素 哚乙酸 丙基 那霉素 碱基对 激动素 氨酸重复 苷酸结合位点 等基因系 放阅读框 丙烯酰氨电泳 合酶链式反应 制性片段长度多态性 福平 分钟转速 核苷酸多态性 单序列重复 定序列标签位点 g 克 l 升 43中国农业科学院博士学 位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文 献 综 述 植物抗病基因研究进展 植物一病原 菌互作的分子机制 植物在其整个生长期内都会遭受各种病、虫不同程度的侵害， 需要不断地抵抗病原微生物和昆虫的侵袭， 在长期的进化过程中，这种植物与病原菌长期并存 ,相互影响，使植物逐渐获得了一系列防御机制来保护自己。 虽然植物缺乏像动物一样的循环系统和抗体，也缺乏特异的防卫细胞，但它有一套区别于脊椎动物免疫系统的抗性防卫体系。在这一体系中，植物的每一个细胞都有对病原物的侵染产生组成型抗性 (of 诱导型抗性 (能 力。组成型抗性又称为被动抗病性，主要靠形态和组织结构产生的机械障碍，主要 包括细胞壁的角质、蜡质、木质素、特殊的气孔结构、小分子抗病物质 ( 如毒性脂肪酸、酚类化合物、类萜与类黄酮类植保素以及有关的过氧化物酶、多酚氧化酶与苯丙氨酸解氨酶等 )、种子固有的抗真菌蛋白和能与真菌几丁质结合的凝集素、破坏真菌细胞透性的蛋白质和核糖体失活蛋白等 (王钧 , 1998)。 诱导抗性又称为主动抗性，是在植物和病原微生物长期相互作用中产生的，指寄主植物被病原物侵染后，产生或激活的抗病特性。 寄主对病原物侵染后作出的反应包括局部反应和系 统反应。 前者主要是指过敏反应( 过敏反应是一种引起被病原物攻击的宿主细胞迅速坏死， 使病原菌不易获取养分，同时又诱导周围细胞合成抑制病原菌生长的物质，从而限制了病原菌的增殖 (1996)， 这种反应一般是局部的，起到阻止病菌扩展，使病害症状局部化的作用。 一是由 是植物病原细菌在入侵非寄主植物时诱导产生的，这样的超敏反应主要是由植物病 原细菌中的 因家族决定的 (窦道龙等，2002)。在 胞内还会产生许多生物化学的变化，如细胞中电解质流失 (如钾离子氢离子交换反应 )、磷脂酶活性变化、钙流动现象、蛋白质磷酸化、脂氧合酶活性变化、活性氧的产生以及有关防卫基因的活化等 (et 2000)现象。 在 初称为坏死 (后来被认为是编程性细胞死亡 (et 1996)。而系统反应是建立在局部反应基础之上的，又称系统获得抗性 ( 一种较为有效的抗病反应 。它是指植物受病原菌侵染后局部的 种信号分子能诱发整个植株防卫基因的表达， 表现出的更为广谱、系统、长效的防卫机制 ，从而使植物对更多的病原菌产生抵抗作用，其特点是不出现局部抗性那样的枯斑，却能抗多种病原物引起的病害 (et 1996)。 另外，还有诱导系统抗性反 应 (，是植物根部受到促生根瘤菌定植时整个植株所获得的抗病反应。 植物和病原菌的互作分为亲和性互作和非亲和性互作两种。 1956） 根据对亚麻锈病(的研究提出基因对基因学说，认为 寄主植物的每一个抗性基因 ( 国农业科学院博士学 位论文 第一章 文献综述 2 , 在病原菌中就存在相应的无毒基因 (, 与 无毒 基因相对应的是病原菌的毒性基因 ( 含有 因 的病原菌对含 R 基因的寄主分别表现出非亲和性与亲和性。只 有当带有无毒基因的病原与带有抗病基因的寄主结合 ,才表现出抗病反应（即非亲和性） ,其他情况均表现为感病（即 亲和性） 。抗病基因的产物主要作用是识别并结合无毒基因产物 ,启动信号传导过程 ,最终引起防卫基因的表达 ,使植物表现抗病。 但是对于寄主抗病基因来说，病原物为了继续生存，迟早会出现毒性基因来克服寄主的抗性，因此植物抗病基因要参与同病原菌共进化的较量，植物抗性和病原毒性不断地相互适应 (et 2001)。在病原菌和植物的竞争过程中，植物首先产 生抗病基因，然后病原菌产生新的小种克服植物抗病基因，植物抗病基因也会随之进化产生新的抗性功能，启动其它的防御机制来抵御病原菌的危害，实现植物和病原的共进化。 植物抗病基因克隆策略及方法 植物抗病基因克隆研究随着分子生物学及相关技术方法的不断发展而日趋深入， 并成为目前国内外研究的热点 。从遗传学的观点来看，基因克隆的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。正向遗传学 (也就是通常所说的“功能性”克隆 (依赖目 标基因所表现的功能为基 础，通过鉴定基因的产物或某种明显的表型突变等信息合成寡核苷酸探针，从 制备相应的蛋白抗体，在 反向遗传学 (径则是直接对基因本身进行分析，通过其特定的序列或在染色体上的位置、 编码的氨基酸序列及结构特点来 克隆 基因 。 八十年代以来分子 生物学研究技术不断进步， 为植物抗病基因的克隆开辟了新的途径，主要有转座子标签技术、图位克隆技术，以及建立在 括 位克隆法 图位克隆 (称定位克隆 (由英国剑桥大学986年提出的， 是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法 。 用该方法分离基因无需预先知道基因的 无需预先知道其表达产物的有关信息。对于基因组复杂的真核生物来说，许多基因的作用机制和产物都是未知的，该法的提出极大地推进了高等植物基因的分离。 利用图位克隆法克隆一个基因一般需要以下六个过程：（ 1）构建用于分子标记定位的作图群体；（ 2）目的基因的定位和精细定位，即找到与目的基因紧密连锁的分子标记。目的基因与分子标记距离越近越好；（ 3）构建包含目的基因的 大片段基因组文库 (如 ；（ 4）用紧密连锁的分子标记筛选基因组文库；（ 5）对得到的阳性克隆进行染色体步移，构建目的基因区域的跨叠克隆群即物理图谱，确定含目的基因克隆；（ 6）将筛查出的包含目的基因克隆的 得侯选基因，进行互补实验、功能鉴定。上述每一个步骤对克隆一个基因都很关键。 (1)遗传作图群体 中国农业科学院博士学 位论文 第一章 文献综述 3 要进行分子定位和遗传分析，质量可靠的定位群体非常关键。 常用的作图群体主要包括以下几种 : 由两个亲本单交产生；回交群体 (对于自交不亲和材料或研究某种特殊问题如雌雄配子交换率的差别， 就必须利用回交；重组自交系 (是由 1代个体连 续多代自交或姐妹交直到后代基因组相对纯合为止；双单倍体(H)是由 染色体加倍处理形成双单倍体群体。 近等 基因系 (；分离群体分组分析法 (叫集团群分法。 研究表明，近等基因系法，分离群体分组分析法是目前获 得与目标基因紧密连锁标记的最有效方法。 近等基因系（ ，是轮回亲本与供体亲本通过杂交以及多代回交（一般至少回交五代），除目的基因外其它性状基本与轮回亲本一致，这样该系与轮回亲本就构成了一对 近等基因系。由于 般凡 是能在近等基因系间揭示多态性的分子标记就很有可能与目的 基因紧密连锁。在植物中特别是水稻中针对不同性状构建了许多 近等基因系。比如针对水稻抗白叶枯病的不同抗性基因，以籼稻品种 单基因为目的的从套籼稻近等基因系和小种之间的鉴别互作表现清晰的专化抗性。自 1986年开始，章琦等以一个高度感白叶枯病的粳稻品种沈农 1033为轮回亲本，培育了一套适合我国生态环境的粳稻近等基因系，包括 琦等， 1993， 1996）。近年，又从野生稻中挖掘出一个广抗谱 基因 以籼稻品种金刚 30为轮回亲本培育成了近等基因系 琦等， 2000）。这些含有不同抗性基因的近等基因系正广泛用于水稻白叶枯病抗性基因的定位和克隆。 分离群体分组分析法（ 是 主要筛选目标基因所在局部区域的分子标记（ et 991） 。该方法将 抗病和感病）分为两组，将每组中的单株 于分组时 仅对目标性状进行选 择，因此两个混合池之间理论上主要在目标基因所在局部区 域有差异，这非常类似于 也称作近等基因池法。 (2) 分子标记遗传连锁图及目的基因的精细定位 近年，随着 遗传标记图谱的迅速发展， 已有 30 多种植物构建了分子连锁图谱，并且一些植物的图谱不断被加密。 动植物基因组作图中最先使用、应用最广泛的一种分子标记，基于 乎所有的重要农作物都构建了基 于 连锁图谱。 水稻中第一张连锁图谱是 用籼粳交 包含 135个 盖染色体