【毕业学位论文】（Word原稿）猪肺炎支原体SYBR GREEN荧光定量PCR检测技术研究预防兽医学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 猪肺炎支原体 I 摘 要 猪肺炎支原体（ 引起猪地方流行性肺炎（ 病原。传统的 量检测方法主要有颜色变化单位 (测、菌落形成单位 (测、显微镜检测计数以及聚合酶链式反应(方法。上述方法费时费力，实验过程中容易污染，常引起鉴定、计数失误，导致试验结果具有波动性。 近年来，国内外开始利用荧光定量 术检测支原体并对支原体进行精确定量的研究，但只做到 定性检测，仍然没有解决 量检测的难题。 本实验以 布的 32 株 (o. 因、 因和因序列作为靶序列，参考 J 株（ 5934， o. 7448 株（ o. 因、 因和 因序列，设计合成了多对特异性引物，通过对荧光定量 增曲线、标准曲线、熔解曲线的分析，筛选出符合 光定量 ；构建了含有 因的标准质粒 建立了以 因序列作为靶序列的 光定量 测方法。该方法准确、快速、灵敏、无污染，具有良好的特异性、重复性，能够检测到 10 拷贝 /用于 养物和疫苗半成品的快速定量检测。 关键词 猪肺炎支原体； 光定量 因；定量检测。 is hp CU( , CR CR of of In to 32 o. as as 5934, o. 448 o. of CR to CR on is 0 of NA L. be hp in or 录 第一章 文献综述 . 1 肺炎支原体分子生物学研究进展 . 1 肺炎支原体的生物学特征 . 1 肺炎支原体的培养和分离 . 1 肺炎支原体主要抗原蛋白 . 2 肺炎支原体检测技术的研究进展 . 3 原分离培养 . 3 清学诊断方法 . 4 子生物学诊断方法 . 4 传统定量检测方法 . 5 . 6 光嵌合法 . 6 针法 . 6 测中的应用 . 7 第二章 光定量 物的筛选 . 8 料与方法 . 8 株 . 8 化试剂及试剂盒 . 8 要仪器设备 . 8 物设计 . 9 白酶 K 裂解缓冲液的配制 . 9 M 制 . 9 0%液配制 . 10 肺炎支原体基因组的提取 . 10 应体系 . 10 应循环参数 . 10 法的建立 . 11 果 . 11 增曲线的建立 . 11 准曲线的建立 . 13 解曲线的建立 . 15 论与讨论 . 17 论 . 17 论 . 17 第三章 光定量 测方法的建立 . 19 料与方法 . 19 体与菌株 . 19 化试剂及试剂盒 . 19 要仪器设备 . 20 引物设计 . 20 异性检测 . 20 因的标准质粒的构建 . 23 光定量 测方法的建立 . 26 果 . 27 异性检测 . 27 因的标准质粒的构建 . 28 光定量 反应条件 . 30 增曲线 . 30 准曲线 . 31 解曲线分析 . 31 敏度 . 32 复性检测 . 32 论与讨论 . 32 论 . 32 论 . 33 第四章 全文结论 . 35 参考文献 . 36 致 谢 . 44 作 者 简 历 . 45 V 图表目录 图 1 用 引物进行 立的扩增曲线 12 图 2 用 引物进行 立的扩增曲线 12 图 3 用 引物进行 立的扩增曲线 13 图 4 用 引物进行 立的标准曲线 13 图 5 用 引物进行 立的标准曲线 14 图 6 用 引物进行 立的标准曲线 14 图 7 用 引物进行 立的熔解曲线 15 图 8 用 引物进行 立的熔解曲线 16 图 9 用 引物进行 立的熔解曲线 16 图 10 实验室常见污染的特异性检测 28 图 11 与猪肺炎支原体混合感染细菌的特异性检测 28 图 12 物电泳结果 29 图 13 定 29 图 14 序结果 29 图 15 32 448 30 图 16 标准质粒的动力学曲线 31 图 17 标准质粒的标准曲线 31 图 18 标准质粒的熔解曲线 32 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 /分 mM 毫摩尔每升 M 摩尔每升 量 积 合酶链式反应 光度 升 L 钟 多克隆位点 二胺四乙酸 溴化乙锭 肠杆菌 氧核糖三磷酸 氧核糖核酸 值循环数 基对 苄青霉素 十二烷基磺酸钠 S 冲液 链温度 U 位 转录酶 炭酸二乙酯 补 P 方流行性肺炎 B 培养基 糖核酸 糖核酸酶抑制剂 L 升 g 克 m 米 pH pH 蒸水 道尔顿 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 肺炎支原体分子生物学研究进展 猪肺炎支原体（ 引起猪地方流行性肺炎（ P）的主要病原。该病在国内又称为猪气喘病，具有高发病率，低死亡率的特点，发病后可出现慢性干咳，生长缓慢，发育迟缓等特点，感染后可引起猪免疫力降低，从而导致其他病原如胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、肺炎巴氏杆菌等混合感染，引发猪呼吸道综合征（ 者其他疾病，严重危害养猪业的发展 (毕丁仁等， 1998；陆承平， 2001)。 肺炎支原体的生物学特征 于缺乏细胞壁，呈高度多形性，大小不等，在液体培养 物和肺触片中常呈球状，直径约 有新月状、长链状。菌落极小，菌落中央乳头状隆起不明显，在猪血清琼脂平板上不产生溶血膜，也不溶解马、牛、猪、小鸡血红细胞，营养要求复杂，培养严格好氧。 有 3 种细胞器，即细胞膜、核糖体和拟核。电镜下可见细胞膜由 3 层单位膜所构成，厚度约为 8 11 胞质内含有大量颗粒状、由 构成的核糖体和环状双链构成的基因组。核酸中 (G+C)%含量为 23% 29%，低于一般细菌，在系统发育上与格兰氏阳性菌最为接近 (毕丁仁等， 1998；邵 国青等， 1999； F. et 2004)。 肺炎支原体的培养和分离 基因组大小一般为 580基因组全长和蛋白编码序列数量仅达到普通细菌基因组全长和编码蛋白数量的 20%携带的信息量不多，需要从体外摄取许多能通过细胞膜的比较复杂的大分子，如胆固醇、脂肪酸、核糖前体以及维生素、氨基酸等物质 (邵国青等， 1999; F. et 2004)。由于它是专性需氧菌，对营养要求较一般支原体为高，这就使得其体外培养十分困难， 也是人们不能对其深入研究的一个主要原因。 固体培养基培养比液体培养基营养要求更高，生长更为缓慢。一般在接种 5 天后方可在 60 倍放大下观察到菌落，明显的菌落特征需要 7 天时间，一般培养 10 天后方可观察到所有的菌落 (毕丁仁， 1998)。 分离工作进展缓慢，程序复杂。 用正常肺血浆块组织培养法和煮沸组织培养后再接种于无细胞培养基的方法分离到 1猪肺组织的病变部分浸于培养液中过夜后制成悬浮液分离到 苏省农科院采用“病肺块浸泡法”分离到了 苏省农业科 学研究所畜牧兽医研究室， 1973)。这些方法都需要将被感染猪肺组织的病变部分匀浆后浸泡在添加了抗生素或者抗血清的分离培养基中，盲传 3后方可观察到一定的生长现象，然后进行更进一步的稀释培养或者其他单菌落培养方法，得到纯培养后进行微生物形态鉴定和血清学鉴定。这样的步骤耗时较多，容易污染，而且分离过程中其生长经常被猪鼻支原体的过分生长掩盖， 江苏省农业科学研究所畜牧兽医研究室， 1973)。随着分子生物学方法的进步，在分离工作初期即可鉴定分离物中是否含有 低了工作强度，但是后 期的纯培养过程中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 仍然需要相当长的时间。正是由于 离工作进展缓慢，其培养、血清学研究、致病因子的研究仍然缺乏足够的研究对象，相关研究也都受到抑制。 肺炎支原体主要抗原蛋白 (1985)随机克隆构建 因文库，并表达融合蛋白。然后通过人工感染猪血清筛选出含有表面特异性抗原决定簇的融合蛋白克隆，合成的融合蛋白提纯后研制出兔抗血清 ,并以此作蛋白印渍试验 ,结果鉴定出 个蛋白可能为 白抗原 ,免疫电镜检测证明 白位于 面。 (1990)鉴定出 面脂蛋白，单抗和多抗证实 一个免疫原 ,其抗原决定簇位于细胞膜外侧的 C 端。 (1997)克隆表达的 42白(因位于一个三基因操作子内 :前部， 后部，序列比较显示 可能就是 因的一部分。由于 苷酸还原酶（ 基蛋白在试验条件下都可以在一定程度上诱导被感染猪对 生免疫反应，这些蛋白成了目前研究的热点。 （ 1991）表达筛选到一个 36 多肽 ，发现它具有种特异性的免疫原性，针对 （ 1993）证明 位于细胞内的 L 乳酸脱氢酶。染后，能产生较强的针对 白的抗体 ( et 1994; et 000)。由于 胞质蛋白，抗 体产生的时间比较晚 ( et 000)。 46 蛋白具有种特异性，用它作 原可以很好的消除其它支原体抗体的干扰，检测出人工感染两周后猪体内的抗体 ( et 995 a)。在 白 这证明了 白是一个膜蛋白。 因的编码序列也具有较强的支原体特性，含有三个 中至少一个编码色氨酸，一个 码子编码精氨酸（编码精氨酸是目前发现的第一例），而 通用密码子中是终止密码子， 是无意密码子 ( et 995 a; et 995 b)。 97 蛋白是发现最早的纤毛结合蛋白，在 J 株是一个 95 蛋白 质，在 144 L 株中则是 932两个蛋白质 (贾广乐等， 2002)。在 114 提取物中没有 明其不是脂蛋白。 发现两种抑制 合猪气管纤毛的单抗能够抑制多达 67的结合，而这两种单抗能够和一个 97蛋白产生免疫反应，遂将此蛋白命名为 疫电镜表明 白随机分布于细胞膜外侧 (J et 995)，早期的研究发现猪感染 最早产生的抗体是针对 和 ，比针对其它主要抗原的抗体早 30 60 天 (沈青春等， 2003)。 1996 年 通过 因的三个探针杂交发现其在基因组中为单拷贝， 1998 年 97纤毛结合素的启动子进行分析 ,发现 该操纵子的第二个基因位于 因下游 ,编码一个 蛋白 ,将其命名为 认为在 染中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 色体中 单拷贝 ,而 基因组中至少有 4 个拷贝 , 2004 年 通过 析 232株序列，发现 因所在的双基因操纵子存在 7 个同源拷贝，其中一个表达 白，其它六个拷贝 并不表达 (F. et 004; et 1997; et 1998; et 1998)。 因编码一个 前体蛋白，剪切掉 95 个氨基酸成熟后为 泳中表现为 97也报道了一个类似的序列 o. (. et 1997) ，同源性分析表明 因和 因 是等位基因变异，它们的不同主要是 C 末端重复序列重复次数的差异 ( et 1998)。 110 是继 后又发现的一个纤毛结合蛋白。 通过吸附抑制试验发现 另一个可能的纤毛结合素，此蛋白在猪肺炎支原体的不同株中表现不一，在 J 株和 7448 株中为 白，而在 232 株中则是 白。 一个 54亚基和两个 28亚基通过二硫键组成，这两个亚基均结合多糖构成糖蛋白 (R et 998)。 用猪的 免血清对 表达文库进行筛选时发现一个与高免血清反应的克隆子，插入片断合成的 11 d 多肽与原核生物 42 2 亚基末端同源， 1997 年又将这个编码 11肽的核酸片段克隆到沙门氏菌表达系统中，最终表达产物是一个 15杂合蛋白。该杂合蛋白的抗血清能抑制 生长。使用含有重组克隆的沙门氏菌制成活疫苗口服制剂 ,小鼠口服该制剂后肺部粘膜分泌的和血清中的抗 组蛋白的 度明显增加；单纯使用 15 杂合蛋白免疫小鼠，血清和肺粘膜的抗该杂合蛋白的 度大幅度 增加，但 种免疫方法比较，采用注射重组蛋白的方法免疫后， 果更为显著 (et 1996; et 1997)。 肺炎支原体检测技术的研究进展 对猪气喘病的诊断通常都依赖于病原的分离培养，临床症状，病理检测和组织化学检测结果综合确定，而其中最关键最准确的方法是病原的分离培养 (et 2004; et 2004; et 2002)。由于 离培养困难，需要较长时间，病原的分离培养在临床检测中并不被经常使用 (et 2004)。临床检测 多的是采用各种血清学和分子生物学检测方法。 原分离培养 离困难，需要较长时间，且分离效率较低。即使分离成功， 体特征不明显，显微镜观察菌体无法得到明确的结果。 固体菌落直径仅 500m，菌落特征与其他支原体菌落特征区别不明显 (毕丁仁等， 1998)，分离培养的结果仍然需要通过血清学实验或者 法确认，故分离培养法一般不作为 主要诊断方法。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 清学诊断方法 血清学诊断方法在一定程度上具有特异性，因此在分子生物学方法得到充分发展前，血清学诊断是 主要诊断方法，现在仍然被广泛使用。目前应用的血清学诊断方法有：免疫荧光技术，免疫酶技术，凝集试验，放射免疫酶试验，补体结合试验，间接血凝试验以及 间接血凝试验、补体结合试验、 放射免疫酶试验更为常用 (沈青春等， 2003)。 疫荧光技术，免疫荧光技术用于检测抗原的存在，从 1970 年 L先使用这个技术检测猪肺中的 1984 年 改良的直接荧光抗体技术连续检测人工感染猪(J et 999; et 997)，发现接种后 2 12 周在病猪支气管和细支气管上皮检测到 4 6 周荧光最强， 8 12 周荧光强度逐渐下降。但是免疫荧光技术仅能检测到大量存在的支原体，由于治疗或者随着感染后期支原体数量下降时，则可能无法检测。 接血凝试验、补体结合试验、 放射免疫酶试验通过检测血清中抗 体的存在来确定是否感染 是血清学方法 存在的普遍问题有：待检测血清中抗体可能存在同其它微生物的抗原存在交叉反应，比如和 源性最高的絮状支原体往往干扰 血清学检测结果，导致假阳性的出现；无法区分抗体来自疫苗免疫还是自然感染 ( et 1990)。就几种血清学检测方法本身的对比来说，间接血凝试验灵敏性相对较低，可能出现假阳性，结果的判定主观性较强 ( et 1990; A et 984)，因此间接血凝试验不适合于商品猪群检测；补体结合试验在猪群被人工感染猪肺炎支 原体 14 天后可检测到 体， 21天后检测到抗体，放射免疫酶试验在 35 天后才检查到抗体，但是自然感染的猪补体结合试验需要21 天方可检测到抗体；在感染后 3 5 周 测比补体结合试验检测灵敏度高，而在 6 7周后两者灵敏度相当，但是感染一年后 可检测到的抗体，而补体结合试验只能检测感染半年内的抗体 ( et 1990; A et 984)。 子生物学诊断方法 目前针对 括核酸探 针检测和 测又包括常规 机引物 方法。 核酸探针 (1989)将 酶切片断随机克隆后，用重组产物制成探针，在严格的试验条件下对 异，但易与絮状支原体产生交叉反应；可检测到 10 无法直接检测到气喘病病肺中的 后 (1991)将 因文库中的一个 1.3 断用硫的同位素标记，可特异性的检测到 100 (1992)等使用与列互补的 3 个 30 右 探针检测 有较好的特异性和敏感度。 (1999)等用 增的 520 物作为 针，用地高辛标记后通过组织原位杂交检测自然感染了 猪肺，能有效检测出自然感染猪组织中的 酸以及病原核酸分布(et 1999; 肖国生等， 2003)。核酸探针目前主要用于基因克隆和克隆产物的鉴定，但在临床病例的检测上，敏感度和特异性尚需要更进一步的发展，而且探针检测 步骤复杂，不如 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5 法应用方便。 测 术具有扩增效应，灵敏度高，因此可以检测到微量的 特异性 高了其特异性，避免了交叉反应的出现。 (1991)用 增了 520 物经过寡核苷酸探针印迹杂交检测证明为特异性产物。 (1993)根据 16s 列设计引物进行 过种特异性寡核苷酸探针进行鉴定，能够特异性的检测到人工感染 猪气管分泌物，肺病灶和自然感染猪鼻拭子样品中的 对鼻拭子样品的检测仅限于一段时间， （ 1995）认为这是由于不同时期不同因素的存在抑制了 设计的 系灵敏度达到 500 据 32 株基因组大小 (F. et 004)计算出该方法可检测到约 4 免疫荧光检测结果对比，符合率达到了 121/143，具有较好的特异性 ( et 996)。 (1998)利用溴化十六烷基三甲铵 (处理猪支气管洗出液，提取 后 增 853 产物，该方法由于在模板制备过程中采用新的方法，灵敏度达到了 10 是在某些情况下灵敏度只能达到 100 (1997)通过对 200 头猪的人工感染和检测统计表明 测仅适用于急性感染期，此时 法明显优于 免疫荧光方法。 随着 法的出现，对 测灵敏度和特异性都得到了极大的提高，同时对临床样品的可检测时期也被延长。 (1997)发展的 检测到一个 存在， (1998)则根据 重复序列 o. 计引物，将功的应用于检测试验条件和野外条件下空气中的 验条件下可以检测到少于一个 因组的 断，但是无急性病例的猪场的空气样品中的 能检出，需要增加采样数量方可保证结果。 （ 2000）证明了 测气管拭子中 肺特异性病变之间有很好的 相关性。 传统定量检测方法 猪肺炎支原体的定量检测可以通过菌体镜检的方法进行。猪肺炎支原体采用姬姆萨染色法，染色后呈现极细小的颗粒，和染液中的染料颗粒难以区分，严重影响计数结果。况且人为观察存在主观差异，不利于实际应用。 传统的支原体 测方法和 测方法通常需 15 至 30d，特别费时，而且实验过程中污染几率较高，不同培养基、不同操作方法以及不同判断标准都会导致检测结果的不一致，很难在实际生产中应用 (毕丁仁等， 1998；沈青春等， 2003)。 测结果与检测时猪肺炎支原体的生长活性 密切相关，当部分菌体活性不强时， 检测结果可能与菌体量不符，且 测只能将菌体数量确定在 10 倍级数量级水平。另外，猪肺炎支原体在琼脂培养基上生长时，难以获得满意的菌落，菌落直径通常小于 500 m，且不同菌株菌落形态不一样 (毕丁仁等，1998)，没有经验的观察者计数时往往会漏掉菌落或者将气泡与菌落混淆，导致结果不准确。 (定方法详见附录 1。 ) 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 6 在 技术 ( A et 1997)，在国内常被称为荧光定量 仅广泛应用于基因表达解析，还广泛应用于 型解析、物种鉴定、病毒和病原菌的检测、转基因食品的定量分析、导入基因拷贝数的解析等诸多领域。 快速、高灵敏度检出等优点，同时克服了普通 能准确定量、容易污染等不足。它不仅实现了对 板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、实时性和准确性 等特点 (张立国等 ,2003;张蓓 , 2003;蔡刚 ,2003; 阳成波 ,2003)。 通过 终对实验数据进行分析处理的方法。根据引入荧光信号的方法不同，可将 光嵌合法 (法 )； 交探针法；分子信标法 ( 针法 (张立国等 ,2003;张蓓 , 2003;蔡刚 ,2003;阳成波等， 2003年 ;2006;王小红 ,2001; . et 2003)。目前应用最广泛的是荧光嵌合法和 针法。 光嵌合法 荧光嵌合方法通常使用 作为荧光物质，因此又称为 是一种能够非特异性结合于所有双链 游离状态下不发出荧光。它与 激发光 照射下产生荧光，通过荧光强度的检测，可以实时监测 于 可非特异性结合于 此它 可以与任意引物、模板相配合 ， 用于任意反应体系中 ， 从经济角度考虑 ， 它比其它的探针的价格要便宜得多 ， 但由于同样的原因，一旦反应体系中出现非特异扩增 ， 那它就会影响到定量结果的可靠性与重复性。要避免这些不利因素 ， 一方面可以通过对扩增产物进行熔解曲线分析( 以区分由 物和引物二聚体或