黄金金 不同生长环境下豆腐柴POD同工酶的比较分析.doc

不同生长环境下豆腐柴POD同工酶的比较分析学号: 200724140102本 科 生 毕 业 论 文（设计）题目：不同生长环境下豆腐柴POD同工酶的比较分析作 者 姓 名：黄金金 专 业 班 级：生物科学2007级01班指 导 教 师：李琳玲 讲师 黄冈师范学院生命科学与工程学院二0一一年四月 第 18 页 共 17页郑 重 声 明本人的毕业论文（设计）是在指导老师李琳玲的指导下独立撰写并完成的。毕业论文（设计）没有剽窃、抄袭、造假等违反学术道德、学术规范和侵权行为，本人愿意承担由此产生的各种后果；直至法律责任，并可以通过网络接受公众的查询。特此声明。 毕业论文作者（签名）：黄金金 2011年4月8日目 录中文摘要 .1英文摘要（Abstract） .11选题背景 .21.1 豆腐柴概述.21.1.1 豆腐柴的特点.21.1.2 豆腐柴的研究现状.21.2.1 POD同工酶概述.31.2.2 POD研究现状.42 方案论证.42.1 实验方案探讨.42.2 实验原理.53 过程论述.53.1 实验过程.53.1.1 实验材料的选取.63.1.2 实验仪器.63.1.3 实验试剂.63.1.4 实验步骤.63.1.4.凝胶贮液及电极缓冲液的配制.63.1.4.2蛋白质提取液的配制.73.1.4.3 提取粗蛋白备用.73.1.4.4 凝胶制备及电泳.74结果与分析.85参考文献.15致谢.17 不同生长环境下豆腐柴POD同工酶的比较分析黄金金（生命科学与工程学院 生物科学专业 200701班）摘 要：小4号，“摘要：”与“关键词：”加粗，前面空2格；摘要段落：段前空0.5行小4号宋体居中采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法对马鞭草科植物豆腐柴在四种不同生长环境下的茎、叶两种组织的过氧化物酶(POD)同工酶酶谱进行了研究和分析 。结果表明：不同生长条件下豆腐柴的POD同工酶酶谱有明显差异，同一环境下豆腐柴POD酶谱具有明显的组织特异性。同工酶的活性变化与环境和其组织功能相适应，其特征性酶带可作为分类和进化的依据。 关键词：豆腐柴；不同组织；POD同工酶；比较分析Abstract: Used the polyacrylamide gelatin vertical board electrophoresis to the Verbenaceae plant bean curd firewood under four kind of different habitats stem, leaf two kind of organizations peroxide enzyme (POD) the isozyme zymogram to conduct the research and the analysis. The result indicated: Under the different yield condition the bean curd firewoods POD isozyme zymogram has the obvious difference, under the identical environment the bean curd firewood POD zymogram has the obvious organization specificity. The isozyme active change and the environment and its organization function adapts, its characteristic value enzyme belt may take classified and the evolution basis.Keywords: Premna; different organizations; POD isozyme; comparative analysis同工酶技术 ，作为在分子水平上研究生命现象的重要手段之一 ，在遗传学、分类学、发育生物学等学科中得到了日益广泛的应用。由于同工酶在其分布上具有组织特异性和种属特异性 ，因而作为基因表达的产物和标志。遗传稳定的生物个体在一定条件下同一组织的同工酶谱是相对稳定的 ，而不同种属或不同组织的同工酶谱 ，则可有明显的种属特异性和组织特异性 ，所以同工酶谱的特异性可作为阐明生物种属间亲缘演化关系的辅助手段之一。通过同工酶分析 ，可以了解生物个体对环境变化的适应及不同种群遗传变异的情况。POD 同工酶是植物体内的天然标记，它可从分子和生化水平反映机体的各种变化, 为植物的品种鉴定、纯度分析、抗旱、抗病等方面的研究提供重要的参考价值。 1选题背景 1.1豆腐柴概述1.1.1豆腐柴的特点所属科：Verbenaceae nom. conserv. 中文名：黄毛豆腐柴灌木或小乔木，高达35米，有时枝条外倾或攀援状，幼枝密被黄色平展长柔毛，具条纹，后逐渐变无毛，树皮转红褐色。叶纸质，形状大小不一，卵圆形、长圆状卵圆形或者长圆状倒卵圆形、卵状披针形、椭圆形或近圆形，长414.5厘米，宽（2.8-）39厘米，先端渐尖、锐尖、极稀近圆形或甚至微凹或倒心形，基部阔楔形、近圆形，偶尔近心形，常偏斜，有时全缘，通常具不整齐的圆锯齿，稀皱波状，有时齿尖突出，微硬，表面被较疏的稍硬黄毛，中肋及侧脉上更密而平展，背面密被柔毛；侧脉57对，斜升，微弯曲，表面明显，背面突出，横生细脉和网脉仅背面明显；叶柄长25.5厘米，每对长短不等，与小枝被同样柔毛。聚伞花序伞房状，顶生，长2.5-6厘米，宽49厘米，分枝斜升至近平展，56对，再分枝36回二歧；苞片线形，锐尖，下部的长约2毫米；花萼近二唇，长宽各22.5毫米，被微短柔毛，5齿，近相等，短，顶端圆；花冠连同花管长6毫米，喉部被长柔毛，外面无毛或微被毛，裂片4，上唇长圆形，顶微内凹，长2毫米，下唇3圆裂；雄蕊4枚，不伸出花冠外，花丝长达2.5毫米，无毛，花药干时褐色；子房球形，除顶端有少数直毛外，其余无毛；花柱长4毫米，柱头短2裂。核果卵形至球形，径35（-6）毫米，成熟时黑色，暗晦，核密生瘤突，宿萼杯状，近二唇形，径约24毫米.分布及生境：产思茅、西双版纳、河口、富宁等地，海拔500-1200米的阴处常绿阔叶林或路边疏林中。我国贵州南部、广西西南部以及泰国北部、老挝、越南（北部至中部）亦有分布。1.1.2豆腐柴的研究现状 由于豆腐柴在国外野生资源极为稀少，国外关于豆腐柴的研究尚未见报道，我国豆腐柴野生资源丰富，分布广泛,但长期以来仍处于自生自灭状态，未能得到合理地开发和利用。目前豆腐柴的研究在国内也还没有引起学者们的充分重视，其药用成分、药理机制、药品的研制、保健食品和饮料的深加工、果胶的提取工艺和设备及人工栽培等方面的研究也比较少，还存在许多需要解决的问题,随着其药用食用价值开发的需要，其营养成分、药用成分研究必将深入，对于豆腐柴的研究也将引起国内外学者的重视。1.2 POD同工酶1.2.1 POD同工酶概述同工酶（isozyme，isoenzyme）广义是指生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶。按照国际生化联合会（IUB）所属生化命名委员会（CBN）的建议，则只把其中因编码基因不同而产生的多种分子结构的酶称为同工酶。同工酶的基因先转录成同工酶的信使核糖核酸（mRNA）、后者再转译产生组成同工酶的肽链，不同的肽链可以不聚合的单体形式存在，也可聚合成纯聚体或杂交体，从而形成同一种酶的不同结构形式。同工酶是指催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，叫做组织的多态性，体现各组织的特异功能。大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能，例如动物肝脏的碱性磷酸酯酶和肝脏的排泄功能有关，而肠粘膜的碱性磷酸酯酶却参与脂肪和钙、磷的吸收。对LDH催化的可逆反应，心肌中富含的LDH1及LDH2在体内倾向于催化乳酸的脱氢，而骨骼肌中丰富的LDH4及LDH5则有利于丙酮酸还原而生成乳酸。所以同工酶只是做相同的“工作”（即催化同一个反应），却不一定有相同的功能。 在生物学中，同工酶可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。例如最原始的脊椎动物七鳃鳗（Lamprey）只有一种LDH肽链，进化到较高级的鱼类才有A、B两类肽链。又如通过对地理分布不同的物种间某一同工酶谱的普查可以推测物种的地理来源。动、植物的遗传变异可通过子代和亲代同工酶谱的比较来鉴别。法医学中也可用多种同工酶谱的分析来鉴定亲子关系。细胞杂交或植物杂交育种后是否出现新品种也可用同工酶谱的比较来确定。在个体发育中，从胚胎到出生，再到成年，随着组织的分化和发育，各种同工酶谱也有一个分化转变的过程。某型同工酶在胚胎的大多数组织中出现，成为主要型式，称为原始型同工酶。但出生后在某些组织中逐渐减少而被另一型同工酶取代，后者在胚胎组织中几乎不存在或含量极微，只在分化成熟的少数组织中存在，称为成年型同工酶。在植物的不同发育阶段，同样可见同工酶谱的相应改变。 在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段，癌瘤组织的同工酶谱常发生胚胎化现象，即合成过多的胎儿型同工酶。如果这些变化可反映到血清中，则可利用血清同工酶谱的改变来诊断癌瘤。此外，因同工酶谱有脏器特异性，故测定血清同工酶常可较特异地反映某一脏器的病变，如血清的LDH1（B4）或MB型肌酸激酶（CK-MB）增加是诊断心肌梗塞较特异的指标，较测定血清LDH或肌酸激酶（CK）总活力更为可靠。POD 同工酶是植物体内的天然标记，它可从分子和生化水平反映机体的各种变化，为植物的品种鉴定、纯度分析、抗旱、抗病等方面的研究提供重要的参考价值。1.2.2 POD同工酶研究现状同工酶技术作为一种常规的分析手段 ，已广泛应用于蔬菜的起源、分类、亲缘关系鉴定、遗传育种、病理和生理等研究领域 ，极大地推动了蔬菜园艺学科的发展遗传性高度杂合的草本植物 ，亲缘关系较复杂 ，关于起源和分类问题长期以来争论不休 ，而同工酶技术可作为一种常规手段 ，用来区分物种、变种和品种 ，并用以评价亲缘类群间的系统发育关系。目前有关这方面的报道很多。2方案论证2.1实验方法探讨提取蛋白质的方法较多，如磷酸缓冲液提取法，Tris-Hcl提取法，水提取法，由于蛋白质能溶于水，所以粗蛋白比较容易提取出来，但由于要获得过氧化物同工酶酶谱，所以要求提取的蛋白质含量较高，经实验发现针对POD同工酶，选择Tirs-Hcl提取法最合适。参照张明坤26的实验采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳。2.2实验原理过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。研究表明，植物在发育过程中，所含同工酶的种类和比例都不相同，它们与植物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系，因此作为基因表达的产物，测定同工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具，在植物的种群、发育及杂交遗传的研究中有重要的意义。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便，灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，Nmethylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(N，N，N，Ntetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） ：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。3过程论述 3.1实验过程3.1.1实验材料的选取 分别选择A,B,C,D四种生长条件下的黄毛豆腐柴的嫩茎和叶两个组织进行实验： A：模拟山间条件，光照50lx，10h，温度24。B：室内条件，光照30lx，16小时，温度25C：实验地里，光照100lx，12小时，温度30D：室外条件，光照150lx，16小时，夏季高温35。3.1.2实验仪器仪器：电泳仪、垂直板型电泳槽及附件（玻璃板、硅胶条、梳子、导线等）、微量移液器、TGL-1600离心机、脱色摇床、 量筒：（500ml1，10ml1，5ml1）烧杯：250ml4 其他：玻棒、大培养皿等。3.1.3实验试剂丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，Tris-HCI缓冲液、Tris-磷酸缓冲液、溴酚兰、10%过硫酸铵溶液、联苯胺，聚乙烯吡咯烷酮，甘油，冰乙酸，3%双氧水，蒸馏水等。3.1.4实验步骤3.1.4.1凝胶贮液及电极缓冲液的配制：以下各种试剂的配制，参考赵永芳24和王晓丽25等的方法。 2MTris-HCl pH 8.8缓冲液100ml：称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）24.2g，加入蒸馏水50 mL，用浓HCl调至pH 8.8后，再用双蒸水定容至100ml 1MTris-HCl pH 6.8缓冲液100ml：称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）12.1g，加入50 ml蒸馏水，用浓HCL调至pH 6.8后，再用双蒸水定容至100mL 。 A液：30%Acr-Bis溶液100ml：称取29.2g丙烯酰胺（Acr）、0.8g 甲叉双丙烯酰胺（Bis）用双蒸水定容至100mL，充分溶解后，用滤纸过滤装入棕色瓶，并置于4冰箱中保存。B液：分离胶缓冲液100ml：2MTris-HCl pH 8.8 75ml，10%SDS 4ml 蒸馏水21mlC液：1MTris-HCl pH 6.8缓冲液50ml ，10%SDS 4ml，蒸馏水46ml电极缓冲液（Tris-Gly pH 8.3）1L：称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）3.0 g，甘氨酸14.4g。用蒸馏水溶解并定容至1000mL。 10% 过硫酸铵（W/V）：称取过硫酸铵（AP）0.5g，溶于5mL双蒸水。用时现配。40%蔗糖溶液（W/V）：称取4g蔗糖，溶于10mL双蒸水。1%溴酚蓝10ml：称取100mg溴酚蓝，加蒸馏水至10ml，搅拌直到完全溶解， 3.1.4.2蛋白质提取液的配制：100ml（过滤除去聚合的染料， 1Mtris-Hcl（pH8.0）15ml，甘油25ml，聚乙烯吡咯烷酮2g，加蒸馏水定容。） 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g3.1.4.3提取粗蛋白备用1、称取1g样品加入3.5ml提取液 2、把样品放在研钵中，用液氮研磨后加入提取液在冰上静置3-4小时3、用离心机离心8000rpm30min4、提取上清液并放冰箱冷藏3.1.4.4凝胶制备及电泳电泳槽的安装：本实验使用DYY-型垂直板电泳槽，将配套的玻璃板与胶槽安装好。分离胶：分离胶10ml成分见下表，按顺序取以下各种成分，加入小试管中，混匀并用移液枪缓缓灌入胶室，避免产生气泡，胶液加至距玻璃板顶部约3 cm处，然后将胶室垂直放置，并用胶头滴管在分离胶上表面缓缓加入0.5 cm左右的水层。10-20 min后，可以看到胶与水之间有一清晰的界面出现，此时分离胶已聚合，可以继续加浓缩胶。表 1 分离胶组成Table 1 Composition of Separation Gel试剂名称9%12%A液：30% Acr-Bis溶液B液双蒸水 10% AP TEMED 3ml2.5ml4.5ml50ul5ul4ml2.5ml3.5ml50ul5ul浓缩胶：待分离胶凝聚后，用滤纸吸干水层，并配制8ml浓缩胶。浓缩胶成分见下表，按以下顺序在小烧杯中加入各种成分，混匀后倒入胶室，避免产生气泡，并立即插入样品梳。约10min后，浓缩胶聚合。小心取下样品梳，并倒入电极缓冲液（负极缓冲液）。表2 浓缩胶组成Table 2 Composition of Concentration Gel试剂名称 凝胶浓度（4%）A液：30% Acr-Bis溶液C液双蒸水 10% AP (mL)TEMED (mL)1.4ml2ml4.6ml60ug10ug加样及电泳：取100L酶液，加入等量的40%蔗糖，再加入10L 0.025%溴酚蓝，混合均匀。用微量进样器在第个样品孔里面加入10L样品，加样过程中，避免样品溢出样品孔。加样完毕后，将电泳槽放置在4冰箱中，接通电源，调节电压至150V，待指示剂（溴酚蓝）进入分离胶后，稳压200V电泳。染色：联苯胺-醋酸-过氧化氢染色液预先配制1号溶液：2g联苯胺溶于18ml冰醋酸，再加72ml去离子水；2号溶液：3%H2O2 电泳结束时，取1号溶液4ml和2号溶液1.6ml，加入76ml去离子水，即配成一块胶板所需染色液。电泳后将胶板剥下，用去离子水冲洗清洁，浸入配好的染色液中，在室温上，显现蓝色谱带，随时间的延长，过氧化物谱变为红褐色，然后用水冲洗清洁。最后拍照并绘图。4结果与分析4.1水、磷酸缓冲液提取蛋白质与Tris-Hcl提取液提取效果的比较1 2 3 1 2 3 水提取法、磷酸缓冲液提取法与Tris-HCI缓冲液提取方法后的染色效果 1 2 3 1 2 3 水提取法、磷酸缓冲液提取法与Tris-HCI缓冲液提取方法酶带模式图如上图所示，1，2，3 是采用室外条件下豆腐柴的叶片，分别用水提取法， Tris-Hcl提取液与磷酸缓冲液提取蛋白质提取效果的比较，由此可以看出，用Tris-Hcl提取液提取的效果最好。因此本实验选用Tris-Hcl提取液提取粗蛋白。4.2四种生长条件下豆腐柴POD同工酶谱分析 5 6 7 8 1 2 3 4 四种环境下豆腐柴茎、叶POD同工酶谱 POD-A1 POD-A2 POD-A3 POD-A4 POD-A5 POD-A6 POD-A7 POD-A8 POD-A9 POD-A10 POD-A11 POD-A12 5 6 7 8 1 2 3 4 四种环境下豆腐柴茎、叶POD同工酶谱模式图 表一：四种环境下豆腐柴茎、叶POD同工酶条带数和酶带迁移率酶带迁移率（Rf）=编号12345678POD-A110.110.110.110.110.1POD-A210.1310.13POD-A311POD-A410.3610.3610.3610.3610.36POD-A510.4410.44POD-A610.5710.5710.57POD-A710.5910.59POD-A810.63POD-A910.6610.6610.6610.6610.66POD-A1010.7310.7310.73POD-A1110.7610.7610.7610.7610.76POD-A1210.8310.83总数15373972 表二： 四种环境下豆腐柴茎、叶 同工酶谱带强度表：酶带编号12345678POD-A1-+ + + + + + + + + + +POD-A2-+ +-+ +-POD-A3-+ +-POD-A4-+ + +-+ +-POD-A5-+ + + +-POD-A6-+ + + + +-POD-A7-+ + +-POD-A8-+ +-POD-A9+ + + + +-+-POD-A10-+ + +-+ +-+-POD-A11-+ + + + +-+POD-A12-+ +-+ 1-8号分别表示：1：山间条件下豆腐柴的茎2：室内的茎3：地里的茎4：室外的茎5：山间条件下的豆腐柴叶6：室内条件下豆腐柴的叶7：地里的叶8：室外条件下的叶 POD-A1-A12分别表示同工酶谱编号，“”表示谱带缺失，“”表示谱带存在，“”的多少表示谱带强度。4.2.1豆腐柴相同组织的POD同工酶差异如表一所示：1和5、2和6、3和7、4和8都是相同环境下豆腐柴POD茎和叶的酶带条数和迁移率，表二为酶带强度，由表可以看出，相同条件下豆腐柴茎与叶相比，叶中POD同工酶酶带要多，且平均迁移率快，酶带强度大，说明豆腐柴POD同工酶的表达具有明显的组织间差异。4.2.2四种环境条件下豆腐柴POD同工酶差异如表一：1-4表示四种环境条件下的豆腐柴茎的同工酶酶条带和条带强度，4号2号3号1号，可知，室外条件（4号）下豆腐柴茎的POD同工酶条带数最多，迁移率快，酶带强度大，山间条件（1号）下生长的豆腐柴POD同工酶条带最少，5-8分别表示四种环境条件下豆腐柴叶片的同工酶谱条带和条带强度，6号7号5号8号，可知室内条件（6号）下豆腐柴的POD同工酶谱最强，条带最多；室外条件（8号）下豆腐柴POD同工酶条带最少，酶谱最弱，其次是5号。综合比较可知山间培养条件（1号和5号）下，豆腐柴组织的POD同工酶含量较少，说明山间条件最适宜豆腐柴的生长。4.3讨论4.3.1关于同工酶在遗传分析上的优点同工酶（等位酶）作为一种重要的遗传标记被广泛应用于生物学研究的各个领域，例如探讨物种的起源进化，了解植物自然种群的遗传结构，探查种群的交配体系，鉴定种质资源的特征特性，并为分类提供重要的依据28,29,30。基于等位同工酶技术的相似性比较，是解决种内和种间变异及物种形成问题的有力工具，它不仅仅是利用遗传一致度值，还同时结合形态学、解剖学、细胞学和地理学等经典资料，将会更清楚地认识物种的进化过程、机制和进化的复杂性，有助于解决传统方法所无法解决的难题27。同工酶是由等位基因编码的，具有相当的稳定性和特异性。因此，利用同工酶进行遗传分析是可靠、可行的。大量研究者通过他们在其它植物上的研究，发现POD同工酶在进化过程中是高度保守的，而且，与其它同工酶相比，其条带较丰富。因此，选择POD同工酶作遗传分析是可靠的。4.3.2关于同工酶电泳的一些体会在本实验过程中，经过反复摸索，笔者发现许多因素对电泳效果有影响。在酶的提取过程中，提取液的量及提取时间对酶液的浓度有影响；酶对于反复冻融十分敏感，这可能是由于加快了溶酶体的破裂，导致酶降解失活，或是因为引起酶高级结构的改变所致。在不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，为了达到较好的分离效果，分离胶浓度应控制在10左右，POD对凝胶浓度较敏感；浓缩胶长度应在1.5-2.0 cm。每次配制的电极缓冲液只能用10次左右，过长时间使用会影响分离效果。为了使条带清晰，每孔点样量至少10l，并避免溢出导致相互干扰。经过多次比较，结果表明稳压电泳效果比稳流电泳更好，且电压在200-300V，时间在1h左右。染色过程中，POD染液在原配方的基础上多加0.5mL联苯胺可以加速显带，而且效果更好；并且用时现配，染色需要控制好温度，避光。本研究结果在实验条件等方面为今后的豆腐柴同工酶研究及遗传分析积累了经验。由于此次实验样品较少，同工酶标记与豆腐柴亲缘关系及等位基因表达的空间差异性还有待进一步的研究。4.3.3关于豆腐柴POD同工酶的遗传分析豆腐柴的遗传多样性研究对豆腐柴遗传资源的保存和开发利用具有重要意义。一直以来、国内外开展豆腐柴遗传多样性的研究都较少，本实验对豆腐柴过氧化物酶同工酶进行了初步研究，发现不同环境下其酶谱表现不同，而且会出现明显的组织差异性。因此，我们认为，过氧化物酶可作为POD同工酶首选的同工酶遗传标记。4.3.4展望为了更系统地了解豆腐柴对环境的响应，还需要进一步完善豆腐柴的同工酶谱资料，增加所测同工酶的种类、增加豆腐柴样品数。实践证明，多个同工酶比较的结果对于遗传分析是相互补充的。此外，还需要将同工酶技术与其他遗传分析技术相结合，互为补充。5参考文献1 胡能书 ,万贤国. 同工酶技术及其应用M.长沙:湖南科学技术出版社 ,1985 ,3047、7085.2 贾守菊 ,张永普 ,陈艳乐,等.中国石龙子的同工酶J .动物学杂志2002 37(5).3 禹邦超,刘德立. 应用酶学导论M. 武汉:华中师范大学出版社,1995.2 中国科学院植物志编辑委员会. 中国植物志:第72 卷 M .北京: 科学出版社,1988:236- 238.3 毕淑锋,朱显灵豆腐柴资源及其开发利用J林业实用技术4 王燕,许锋,张风霞等豆腐柴研究进展J中国野生植物资源2007, 26(4): 12-145 吴德邻.广东植物志:第4 卷 M . 广州: 广东科技出版社,2000:291-310.6 赵尊练，王鸣非洲西瓜种质资源的抗病性鉴定及其 PO D同工酶分析 J西北农业学报，1994，35)：8791 7 吴少伯植物组织中蛋白质及同工酶的聚炳烯酰胺凝胶盘状电泳 J植物生理学通讯，1979(1)：3033 8 盛红梅,安黎哲,陈拓,等. 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