细胞培养技术视频文本.doc

一物品准备培养室的灭菌：1. 定期打扫培养室：每周打扫一次，先用自来水拖地，擦桌面，超净工作台等，然后用3的来苏或新洁尔灭擦拭。2. 二氧化碳培养箱的灭菌：先用3的新洁尔灭擦拭，然后用75%酒精或0.5%过氧乙酸擦拭，用紫外灯照射。3. 实验前打开紫外灯照射30分钟。4. 试验后用75%酒精3的新洁尔灭擦拭超净工作台，边台，倒置显微镜的载物台，打开紫外灯照射30分钟。5. 实验人员的实验准备：肥皂洗手，穿上隔离衣，戴好帽子，口罩，换上入室拖鞋。戴上手套，用75%酒精棉球擦拭双手。无菌操作演示：1. 凡带入超净工作台的酒精，PBS，培养基，胰蛋白酶的瓶子均要用75%的酒精擦拭瓶子外面。2. 靠近酒精灯火焰操作。3. 器皿使用前必须过火灭菌。4. 继续使用的器皿（如瓶盖，滴管）要放在高处，使用时仍要过火。5. 各种操作要靠近酒精灯，动作要轻，准确，如吸管不能碰到废液缸。6. 吸取两种以上的液体时，要注意更换吸管，防止交叉污染。常用物品准备：1. 玻璃吸管：实验室常用的玻璃吸管，粗的一端要用棉花盖上，防止吸液时液体进入吸头而造成污染。再将其装入吸管筒。2. 培养皿：要用专用的器皿装好或用牛皮纸包好再进行消毒。3. 离心管：有盖离心管要用盖子盖好。 无盖离心管要用铝箔纸盖好，防止灰尘掉入管内。放入饭盒，用报纸包好，写上日期。4. 盐水瓶：可用铝箔纸或者牛皮纸封口，牛皮纸封口把长约20cm宽3cm左右的牛皮纸一张反折叠1/3，包裹瓶口，用报纸包好，写上日期。5. 将所有要消毒的物品放入烤箱，注意不耐热的和塑胶类的物品不能干烤。打开开关，调节温度至160，消毒两小时。温度上升到160C时大概需要40分钟，因此要算上这部分时间。消毒完毕，关掉开关，当温度降至50度左右时方可取出物品。物品使用的有效期为7-14天。二细胞培养常用耗材介绍1. 培养板：6孔板：多用于原代培养或免疫组化等实验12孔板：用于细胞分离培养24孔板：用于记录细胞生长曲线48孔板：用于流式细胞数等96孔板：多用于NTT或克隆等实验，也可以用来测蛋白浓度2. 培养瓶：1）25cm的培养瓶：注意此种培养瓶有透气盖，放入培养箱时无需松盖；另外一种培养瓶：无透气孔，放入培养箱时需要松盖半圈。2）50cm的培养瓶：也无透气孔，放入培养箱时需要松盖半圈。同一型号的培养瓶，有透气盖的价格较贵。3培养皿：直径为35mm，60mm，90mm。盛取，分离，重离组织或测细胞毒性，集落形成，单细胞分离，同位素参入，细胞繁殖等实验使用。4. 离心管：分别有50ml，15ml，10ml。5. 冻存管：用于细胞和组织的冻存。三培养基的配制1.滤器的准备：（1）检查超滤装置有无裂缝，拧开上层滤器，取滤膜一张，光滑面朝上，放在滤器的滤盘上。盖好滤器，拧紧滤器。（2）在滤器两侧的小孔塞上棉花，上盖的三个小孔也塞上棉花。（3）一侧小孔套上接头，另一侧小孔套上小盖帽。分别用小包布包好。最后用大包布将整个滤器包裹好。2.盐水瓶的准备取铝箔纸封住瓶口，注意要防止灰尘落入瓶内。再用报纸或牛皮纸包好。并写上日期。3.盐水胶塞的准备用盒子将盐水胶塞装好，再用报纸包好，最后写上日期。4.高压蒸汽灭菌法处理：（1）打开电源开关，推锁，开盖。拿起载物篮，检查水位。当水位低于底部铁皮时需补加蒸馏水。（2）放回载物篮后，把物品放入载物篮内。盖上盖子，上锁。设置温度为121度，消毒时间为20分钟。（3）高压完毕后，待温度降至90度以下方可打开高压锅，取出物品。放入37-56度的烤箱烤干物品，消毒物品在干燥的环境下可保存2周。5.培养基的种类实验室常用的培养基有：1） DMEM培养基，每盒培养基有10小包1L。含有其他成分，如各种氨基酸，糖类及蛋白等。黑体字特别注明，每升培养基需加碳酸氢钠克数。（3.7g）2） RPMI 1640培养基：每盒10小包1L。黑体字特别注明每升培养基需加碳酸氢钠2.0g。这两种培养基广泛应用于各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养；如A9，3T6等细胞系的培养。6.培养基的溶解：以RPMI 1640培养基为例：（1） 按要求称量碳酸氢钠2g，还要称取HEPES 2g 。（HEPES是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的PH范围，细胞培养常用10mmol/L，对细胞无毒性作用。）分别将碳酸氢钠，HEPES，培养基倒入锥形瓶内。（2） 先取900ml超纯水（因为最后还要定容）。往锥形瓶倒入一部分超纯水，反复将包装袋里的培养基冲洗干净。（3） 加入已经分装的青霉素和链霉素各10万单位。（即青霉素80万单位加超纯水4ml，溶解后取0.5ml。链霉素100万单位加超纯水5ml溶解后取0.5ml）。（4） 沿着瓶壁放入搅拌子，用铝箔纸封口。（5） 把培养基放在搅拌器的磁盘上。打开电源开关，调节转速至缓慢搅拌。注意不要打开加热开关。因为加热会导致培养基的营养成分消失。（6） 搅拌器缓慢搅拌一小时。7调节PH值，定容（1）关掉磁力搅拌器。PH计使用前先用这三种标定液表情后才可使用。用蒸馏水冲洗电极，再用吸水性强的纸擦干水分。（2）将电极放入培养基内，按压读数键。用碳酸氢钠和稀盐酸调节培养基的PH值为7.2-7.4之间。使用完后，用蒸馏水冲洗电极。用吸水纸吸干水分。套上电极保护套，放回原位。（3）最后定容，补加超纯水至1000ml。8培养基的过滤与分装。（1）培养室及超净台用紫外线照射30分钟。（2）在培养室内打开包布。取出滤器，打开上层盖子。倒入培养基。（3）解开包裹接头的包布。接上负压泵。按压负压泵手柄。注意压力不能超过-15kpa。注意观察过滤情况。如果滤液太慢，可能是培养基还未完全溶解，颗粒堵塞滤孔所致。如果太快，要注意滤膜有无穿孔。（4）穿戴手套，用75%的酒精消毒双手。培养基接近滤完时，要及时分离负压泵，防止液体滤干后，负压过大而把滤膜孔的微粒吸入。（5）关超净台的紫外灯，打开抽风和日光灯。将培养基放入超净台，拧紧上层滤器盖。点燃酒精灯。（6）取下接头，打开另一端的包布，取下小盖帽。注意保持这边小孔无菌，因为液体要从这边小孔倒出，用火焰烧灼镊子，取下棉花。（7）打开报纸，用镊子取下瓶口的牛皮纸，用火焰烧灼瓶口，倒入培养基。每个盐水瓶大概加入90ml的培养基，因为使用时还要加入10%的血清。用镊子取盐水胶塞，拿住胶塞，一边旋转一边压进去。用火焰再次烧灼边沿和瓶口外围。注意：抽滤装置的出口千万不要用火焰烧灼，否则会使其变形。（8）最后用油性笔在盐水瓶上写上培养基的名称和日期。放入冰箱-20度保存。培养基使用前，要吸取少量培养基放在培养箱培养24h。确定没有污染后才可使用。四PBS的配制（1） 配备1L的PBS需要氯化钠8g，氯化钾0.2g，12水磷酸氢二钠3.489g，磷酸二氢钾0.2g。（2） 将称好的试剂倒入三角烧瓶内。加入蒸馏水900ml。放入搅拌子（3） 置搅拌器上溶解。（4） 调节PH值。PH计使用前先用三种标定液调试。最后调节PH值在7.2-7.4之间。（5） 定容，加蒸馏水至1000ml。（6） 用定性滤纸过滤缓冲液，分装到盐水瓶中。注意液体不能装得太满，封口签瓶口与胶塞之间放一条棉线，以防高压时瓶内气压将胶塞顶出。将分装后的缓冲液封好，写上名称和日期。（7） 放入高压锅，121 20min灭菌。（8） 取出放室温冷却后放入4度冰箱保存。五小鼠细胞取材骨髓间充质干细胞的原代培养：目前常用的分离MSC的方法主要有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞在低血清培养基中有贴壁优势特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化及扩增MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中各细胞成分比重的不同，分离单核细胞进行贴壁培养。二者本质上无多大区别。下面以全骨髓法为例：1. 实验用品的准备：器械盒（内装：大剪刀一把，小剪刀2把，镊子4把，止血钳2把，200目滤器1个），培养皿3个，培养瓶1个，5ml注射器2个，含10%FBS的培养基，PBS液，吸管，吸头，离心管，离心架，取材木板，大头针4个，白瓷缸一个（内装75%酒精）2. 实验前将实验要用物品一一摆放在超净工作台里，照射紫外灯。3. 在培养室的试验台上铺上报纸，放上取材板和大头钉，照射紫外灯。4. PBS和培养基放入水浴箱中37预热30分钟。实验过程：1. 紫外灯照射培养室30分钟。关闭超净工作台紫外灯。2. 戴上帽子和口罩。戴上手套，75%酒精洗手。3. 在超净台内准备取材用品，在火焰旁打开PBS。烧灼瓶口和盖子，放在瓶架上。在火焰旁边打开培养基，烧灼瓶口和盖子，放在瓶架上。4. 取出吸管，套上吸头，过火烧灼，放入PBS和培养基内。5. 取培养皿两个，吸取适量PBS放入培养皿内。取大剪刀一把，眼科镊两把，眼科剪一把，止血钳两把。6. 断颈处死小鼠，放入75%的酒精内浸泡5分钟，用大头钉固定四肢。在一侧大腿处尽量剪大一些范围，注意避开股动脉，暴露股骨，用大剪刀在关节处剪断股骨。7. 离体的股骨放入培养皿的PBS缓冲液中，拿到超净台里，点燃酒精灯，取两个眼科镊过火烧灼，用眼科镊分离股骨上的肌肉。8. 取另一个培养皿，吸取PBS，将股骨转移到另一个干净的培养皿内彻底将肌肉清楚干净。9. 再将干净的股骨转移到另一干净培养皿内，取眼科剪，过火烧灼，将股骨两端头端剪断，暴露骨髓腔。10. 取培养皿一个，吸取5ml培养基放入培养皿内，将股骨放入培养基中，取5ml注射器，去掉针头盖，吸取培养基。左手用镊子夹起股骨，右手持注射器将针头插入骨髓腔，缓慢按压注射器，将骨髓腔内的骨髓冲出，用培养基反复冲洗，直至骨髓腔内的骨髓冲净。11. 取出离心管，过火烧灼，取出吸管，套上吸头，过火烧灼，放入离心管内。取出200目的滤网放入一新的培养皿内。吸取含有骨髓的培养基，经目滤器过滤肌肉血块等杂物。12. 用镊子取走滤网，取培养瓶一个，瓶口和盖子过火烧灼，吸取含骨髓的培养基入培养瓶内。过火烧灼瓶口和盖子，盖上培养瓶。用油性笔在培养瓶上写上培养细胞名称和培养日期。13. 收拾超净台上的物品，方可盖上盖子。14. 在显微镜下观察细胞的密度，形态，通常一个股骨的骨髓接种一个25cm的培养瓶，显微镜下可见有大量悬浮细胞，主要为悬浮的红细胞。15. 松开半圈培养瓶盖，放入37度，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。16. 24小时候后行首次半量换液，72小时后行全量换液，漂浮的不贴壁细胞大部分随换液除去。可见较多的贴壁细胞散在生长，分布不均，少部分呈集落性状或单个细胞存在。胞体呈长梭形，两端有长凸起，胞质内有颗粒较多，折光性差，核不清楚。在第七天时，形成明显克隆，经传代纯化的MSC细胞在形态上更趋于一致，围成纤维细胞样。六胰蛋白酶的配制1.溶解：胰蛋白酶的作用是：使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度，温度和作用时间有关。在PH为8.0，温度为37度时，胰酶溶液的作用能力最强，常用的胰蛋白酶规格为1:250。（1）按胰蛋白酶溶液浓度为0.25%，用电子天平称取等量粉剂倒入小烧杯中。对于比较难消化的细胞，需要加入0.02%的乙二胺四乙酸二钠（EDTA），因为EDTA可以络合钙离子，增加消化效力。（2）用量筒量PBS 100ml，倒入小烧杯内。封上铝箔纸。放入4度冰箱内过夜，或者冰浴中低速搅拌4小时。2.调节PH值：第二天，从冰箱取出过夜的胰蛋白酶溶液。用蒸馏水冲洗电极，吸水纸吸干。将电极放入溶液内，按压读数键，因为胰蛋白酶会使液体变为酸性，用稀氢氧化钠调节PH至8.0左右。3.过滤与分装：（1）培养室用紫外线照射30分钟。戴上帽子和口罩，戴上手套，75%酒精洗手。（2）关紫外灯，开日光灯和通风机。将胰蛋白酶放入超净台。点燃酒精灯。取出离心管，拧开盖子，过火烧灼。（3）去掉注射器的针头，抽取胰蛋白酶。打开孔径为0.22um的针头滤器，接上注射器。轻轻按压注射器，液体通过滤膜滤入离心管。过火烧灼离心管和盖子，拧紧。注意保持针头滤器的出口端无菌。用油性笔标明名称和日期。放入-20冰箱保存。七血清的分装牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成分，常用于动物细胞的体外培养，具有极为重要的功能：1.提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或者量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。2.提供结合蛋白，能识别维生素，脂类，金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。4.是细胞贴壁，铺展在塑料培养基质上所需因子来源。5.起酸碱度缓冲液作用。6.提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。大部分血清使用前必须灭活处理，即56 30分钟，灭活的目的是去除补体成分，避免补体对细胞产生毒性作用。血清经过灭活也会损失一些对细胞有利的成分，如生长因子，因此也有人提出血清不灭火直接用于细胞培养。大包装的血清经过灭活后，需分装成小包装，保存在-20。使用前放4冰箱，应尽快使用。过程：1.培养室用紫外线灯照射30分钟。2.关紫外灯，开日光灯和通风机。点燃酒精灯。取10ml刻度吸管，接上电动移液器。过火烧灼吸管。3.打开血清瓶的瓶盖，过火烧灼，取离心管，过火焰烧灼，置于离心管架上。用电动移液器吸取血清10ml，将血清缓慢注入离心管内。拿起离心管，再次烧灼瓶口和盖子，拧紧。4.最后用油性笔写上日期，名称和剂量。收拾超净工作台。用酒精棉球擦拭工作台。开紫外灯照射30分钟。八细胞的传代培养当细胞培养成功之后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，细胞之间不断接触而发生接触抑制，生长速度减慢。甚至停止。而另一方面也因营养物不足及代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小部分，重新接种到培养器皿和培养瓶内再进行培养。这个过程就成为传代（passage）或再培养（subculture）。对于单层培养而言，80%融合或者单层融合是较为理想的传代阶段。实验过程：（1） 预热培养基，将含10%FBS的培养基，PBS和消化液，0.125%的胰蛋白酶加0.02%EDTA放在37水浴箱浴温30分钟。（2） 从培养箱中取出细胞一瓶，拧紧瓶盖。放置显微镜下观察，如果生长良好，而且细胞达到80%以上的融合即可传代。（3） 关紫外灯，打开日光灯和通风机，点燃酒精灯。打开PBS和培养基瓶盖，消化液，过火烧灼瓶口和瓶盖。取出吸管套上吸头，过火烧灼，分别置入PBS，消化液，培养基内。（4） 过火烧灼培养瓶瓶口和盖子，倒去旧的培养液，吸取PBS液至培养瓶内进行漂洗，吸取残余血清后吸取PBS液漂洗2-3次。（5） 吸取少量消化液,以刚好覆盖细胞为宜，过火烧灼瓶口和盖子，拧紧瓶盖。轻轻用手拍打瓶壁以使细胞分割脱落。在倒置显微镜下观察消化情况，见细胞收缩变圆即可终止消化。对于难消化的细胞可以放入培养箱中进行消化。（6） 加等量含血清培养液终止消化，取两只离心管放置在离心管架上。取弯头吸管，套上吸头，过火烧灼。置入离心管内。（7） 用弯头吸管吸取培养瓶内的培养液反复吹打瓶内细胞，使已经消化的细胞脱离瓶壁。吹打过程要有序进行。要从一边开始，另一边结束。尤其是瓶的四角处，确保器皿的四壁细胞都被吹打脱离，吹打时动作不宜过猛。力度要适中，否则会直接损伤细胞并产生能够伤害细胞的气泡。（8） 最后将细胞悬液移入离心管内。（9） 配平离心管，用1000转离心5min。离心完毕后取出可见细胞沉着于离心管底部。过火烧灼离心管和盖子。去除上清液，用新鲜培养液将细胞重新悬浮。（10） 取出两个新的培养瓶，将细胞悬液平均分派到3个培养瓶中。补加适量培养基。（11） 用油性笔写上日期，名称。放在倒置显微镜下观察细胞的分布庆康，拧松瓶盖半圈，放入CO2培养箱。培养条件：5%CO2，饱和湿度，温度37。九细胞计数及生长曲线的绘制细胞计数法是用来计数细胞悬液中的细胞数量的一种方法，一般利用计数板，血球计数板进行。即可用于分离细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。无论计数的对象如何，需制备分散的细胞悬液。1.4%台盼蓝母液的配制：称取4g台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加蒸馏水至100ml，用滤纸过滤，4保存。使用时，用PBS稀释母液至0.4%即可。用4%的台盼蓝母液1ml加9ml的PBS制成0.4%的台盼蓝染液。2.制备细胞悬液：细胞浓度以能数清数目为宜，且数目不低于每毫升104个。3.制备计数用的细胞溶液：用移液枪吸取100ul细胞悬液至E