提RNA+逆转录+qRT-PCR步骤.doc

【一、提RNA】一、实验准备：1、试剂：75%乙醇、Trizol、1.5mL 进口EP管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA专用)、2、配75%乙醇(DEPC水+无水乙醇)，放-20冰箱预冷；3、预冷离心机(1.5mL EP管用的)；4、清洁桌面，酒精喷过之后擦干，新手套、两层口罩；二、操作步骤：01、弃上清（不回收，直接倒去）；02、1mL/孔 PBS洗两遍（不回收，直接倒去，随后用200L枪吸尽PBS）；03、每孔加500L Trizol，轻晃，随后室温放置2min左右；04、枪头吹打，吸出放入1.5mL 进口EP管；05、加入100L氯仿(即1/5体积的trizol)；06、4离心机，12000g，15min；07、吸200L(可减少)上清放入新的1.5mL 进口EP管中（注意：只能吸到上清）；08、加入等体积异丙醇，充分混匀，常温放置10-30min(15min)；09、4离心机，12000g，10min；10、倒掉液体，加入1mL预冷的75%乙醇剧烈混匀；11、4离心机，7500g，5min；12、倒掉上清，加入1mL预冷的75%乙醇，混匀；13、4离心机，7500g，5min；14、倒掉上清，倒扣在餐巾纸上，5-10min，用针头或者200微升枪头去掉管壁上的水珠；15、每管中加入40L(40-60L)的DEPC水，吹打溶解；16、测浓度（先知楼21楼测RNA浓度，带DEPC水、灭菌的dd水、10微升枪和枪头）；三、注意事项01、如果当时不测RNA浓度，可暂时把RNA放在-20冰箱。但长时间(24h)保存，需要放在-80冰箱；02、异丙醇作用是沉淀RNA，作用比乙醇好；03、04、05、06、07、08、09、【二、测RNA浓度】一、实验准备：01、先知楼21楼-2109教室，一个冰盒+DEPC水+10微升枪、灭菌dd H2O、10L枪头(RNA专用)、本子+笔；二、操作步骤：01、登记；02、打开电脑=打开“N”软件=点击“Nucleic acid”=选择“OK”=选择“RNA”；03、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；04、DEPC水 校零：即加DEPC水一滴，点击“Blank”，擦干；05、测RNA：加样品一滴，点击“measure”，擦干，随后加下一个样品；06、记录数据，包括RNA浓度（0.1。（请注意，这个值跟仪器无关，核酸的吸光度必需大于 0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值0.1）；2.A280nm、A270nm是蛋白最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯 DNA 的 A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5 相当于50蛋白质/DNA溶液.酚的最大吸收峰在270nm。3. A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA 和 RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0 标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。A230产生负值主要是由于在很低 DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A230的负值会被校正。4. A320nm或A340nm 为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。该值应该接近0.0。如果不是，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。纯样品的A320一般是0。5. A260/A280和A260/A230 是核酸纯度的指示值。纯度好的DNA或RNA，在pH7-8.5 下A260 / A280的比值应该在2.0 或2.5。纯净的样品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、盐（胍盐）等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。当0.5BSA蛋白质污染时，蛋白污染会导致260和280的数值都下降，其净结果是260/280比值下降，但260/280的比值变化并不显著，正如分子克隆3所说。但蛋白残留会导致230的数值显著上升，显著影响260/230的比值。也就是说，如果RNA样品的260/2801.7，260 /2300.5，那么就应该考虑污染原因不是胍盐残留，而是蛋白残留.用分光光度计测量RNA时，用水而不是用TE 缓冲液稀释RNA样品会造成A260/A280比值下降。原因是低离子强度和低pH溶液会增加280 nm处的光吸收值。加氯仿离心后取上清的时候千万不要贪多，那样就很容易被蛋白污染，所以现在一般取400ul左右。6.当260/230加1号试剂（2L）=加3号试剂(0.5L)=加4号试剂(0.5L)=加2号试剂(0.5L)=加RNA=离心=上机；02、上机：OPEN=点击“User”菜单下的“clx”，点击“Accept”=选择“run”下面的到“exp001 rt”=修改体系“10L”(默认为25微升)=点击“Start”，进入界面；03、37.0 15min=85.0 5s=4.0 60min；04、4冰箱保存；三、注意事项01、加液尽量无气泡，枪不要打到底；02、严格冰上操作，防止RNA降解；【qRT-PCR】一、实验准备：01、试剂：Roche的SyBr Green(rox)02、1.5mL EP管、0.2mL EP管、96孔板/八连冠；10L、20L、100L、200L、2.5L、1000L枪；03、冰盒一个、Rox化冻(避光)、引物化冻（GAPDH）、cDNA、DEPC水；二、操作步骤：01、 Rox 10L；+ dd H2O 6L；+ P1(F) 1 + P2(R) 1 + cDNA 2-20L体系02、计算：每个样，X个抗体(至少包括GAPDH-内参,还有目的)，三个副孔。 即如果六个样，2个抗体(GAPDH,PLK1)，三个副孔。6*1*3=1820(PLK1)，6*1*3=1820(GAPDH)；1234567891011126/PLK16/PLK16/PLK15/PLK15/PLK15/PLK16/GAP6/GAP6/GAP5/GAP5/GAP5/GAP4/PLK14/PLK14/PLK13/PLK13/PLK13/PLK12/PLK12/PLK12/PLK11/PLK11/PLK11/PLK14/GAP4/GAP4/GAP3/GAP3/GAP3/GAP2/GAP2/GAP2/GAP1/GAP1/GAP1/GAP PLK1 Rox：10*20=200L DEPC水：6*20=120L F：1*20=20L R：1*20=20L GAPDH Rox：10*20=200L DEPC水：6*20=120L F：1*20=20L R：1*20=20L03、稀释cDNA 10倍(18L DEPC水+2L)=配置Mix(Rox+ DEPC水+F+R)=加样(一横排先加18L mix(GAPDH)，随后加入18L mix(PLK1)。 随后六个孔加同一个cDNA；06、去除气泡：加好样后，观察有无气泡。如果有气泡，弹开，随后2000rpm离心，时间不定(5s即可)；07、上机+设置程序： A、双击打开程序“ StepOne Software v2.1 ”=点击“ OK ”=点击“Ignore & Continue Startup ”=点击“ Advanced Setup ”=进入“ Experment Properties界面 ”；B、Experment Properties界面： 将Expriment Name从Untitled 修改为“日期，如2015-12-17”，将User Name(Optional)修改为“CZL”； Which instrument are you using to run the experiment ?中选择“96 wells”，一般无需修改； What type of experiment do you want to setup ?中选择“Quantitation-Comparative CT(CT)”； Which reagents do you want to use to detect the target sequence ? 中选择“SYBR Green Reagents”； Which ramp speed do you want to use in the instrument run ? 中选择“Fast( 40 minutes to complete a run)”；C、Plate Setup界面-Define Targets and Samples界面： Define Targets栏中：如果有GAPDH、PLK1、Akt、PI3K三个引物，则点击“ Add New Target ”三下，出现“Target1、Target2、Target3、Target4”三个=将其重命名； Define Samples栏中：如果有6个样品(N;1.5;3;6;9;12)，则点击“Add New Sample ”，出现“Sample 1、Sample 2、Sample 3、Sample 4、Sample 5、Sample 6”六个=将其重命名； Plate Setup界面-Assign Targets and Samples界面：GAP/1GAP/1GAP/1GAP/2GAP/2GAP/2GAP/3GAP/3GAP/3GAP/4GAP/4GAP/4Plk1/1Plk1/1Plk1/1Plk1/2Plk1/2Plk1/2Plk1/3Plk1/3Plk1/3Plk1/4Plk1/4Plk1/4Akt/1Akt/1Akt/1Akt/2Akt/2Akt/2Akt/3Akt/3Akt/3Akt/4Akt/4Akt/4PI3K/1PI3K/1PI3K/1PI3K/2PI3K/2PI3K/2PI3K/3PI3K/3PI3K/3PI3K/4PI3K/4PI3K/4GAP/5GAP/5GAP/5GAP/6GAP/6GAP/6Plk1/5Plk1/5Plk1/5Plk1/6Plk1/6Plk1/6Akt/5Akt/5Akt/5Akt/6Akt/6Akt/6PI3K/5PI3K/