中药制剂分析2

薄层色谱过程中斑点异常现象的探讨 一 边缘效应1 原因 这是因为当展开剂在薄层上运行时 极性较弱的展开剂和挥发较强的展开剂在薄层两边较易挥发 它们在薄层两侧的浓度比在中部的浓度小 因此产生了边缘效应 2 克服方法 1 采用单一展开剂以代替混合展开剂 2 采用共沸混合展开剂来代替一般混合展开剂 3 在展开槽内壁上贴以浸湿了展开剂的滤纸条 或用内容积较小封闭严密的展开槽 4 狭的薄层较宽的薄层边缘效应小 采用狭薄层代替宽薄层 二 拖尾现象1 产生之原因及克服方法 1 点样量太多 展开剂不能全部负载 克服方法 寻出合适之点样量后 再进行层析 2 展开剂pH值偏高 如以中性展开剂层析酸性物质时 常形成斑点拖尾 克服方法 在展开剂中加入酸 使解离受到抑制 即可防止斑点拖尾 3 展开剂的pH值偏低 如以中性展开剂层析生物碱和其它弱碱时 常观察到斑点拖尾 克服方法 在层析K值在10 3 10 8的碱性化合物时 展开剂应调至碱性 如加入吡啶 二乙胺等 4 吸附剂pH的影响 由于化合物与薄层上的酸 碱成盐而产生拖尾现象 克服方法 换用pH合适的吸附剂或调整展开剂的pH 如加入酸或碱等 5 吸附剂和展开剂中痕迹量的金属离子 如Ca2 Mg2 等 使层析后的斑点形成拖尾 特别是被展开的化合物具有 COOH及酚 OH等基团时 克服方法 采用纯净的酸来洗涤和处理吸附剂 展开剂可用精制的方法来除去金属离子 三 斑点形成念珠状1 产生之原因及克服方法 1 单一的化合物在层析过程中分解成二个或更多的化合物 因为这些化合物是十分相似的 因此Rf值也极相似 以致彼此重叠 克服方法 设法防止在层析过程中化合物的分解 如控制pH值 防止水解等 2 同系物或异构体也因为他们的结构相似而彼此Rf值相近 产生斑点重叠 克服方法 找出合适的层析方法 如采用 传荷层析 或称络合层析 可以按照化合物的不饱和度 双键位置 几何异构等情况 有效地选择结合 从而提供了因其结构的差别在层析板上出现不同的比移值 3 络合物的形成 克服方法 加入8 羟基氮萘或HCN或其它络合剂 4 被层析的检样中组分太多 以致在一定长度的薄层上排布不开 彼此重叠 形成念珠状 克服方法 将检样用不同溶剂分段萃取 使成为二个或数个检样 或适当增长薄层板的长度 延长层析距离 或进行双向展开 5 点样在原点处形成复斑 有时由于检样浓度太稀 常进行多次点样 这样容易造成每次点样中心不重合 形成具有复斑的原点 念珠状的雏形 展开后往往形成念珠状 克服方法 用浓度适宜的检样一次点样 四 在同一块薄层上出现比移值大小悬殊的斑点1 产生原因由于检样中含有极性大小相差悬殊的组份 2 克服方法 1 将检样用不同极性的溶剂萃取 使分为两个检样分别进行层析 2 可将薄层划成前景与后景两个部份分别处理 即先选用极性大的展开剂将前景展至前沿 使后景均匀展开 然后再用极性小的展开剂 使后景留在原点 使前景均匀展开 五 比移值不稳定1 产生原因及克服方法 1 展层时温度不恒定 温度影响Rf值 温度直接影响分配系数 而且影响展开剂中各溶剂的组成比例 温度还影响被层析物质的溶解度 克服方法 层析时控制恒定温度 以 0 5 左右为宜 2 层析时间不恒定 克服方法 在同一块薄板上 同一层析槽内 展至恒定的时间 立即取出 3 吸附剂规格不统一 克服方法 使用同产地的吸附剂 并最好使用同一批号之产品 必要时 将各瓶均匀混合后再使用 4 展开剂的规格批号不一致 克服方法 如出现斑点比移值不稳定的情况 并怀疑与展开剂有关时 必需亲自考查处理 如进行试剂中的水份含量测定等 5 所用之展开剂往往为多组分的混合展开剂 如配制后立即使用 常因相平衡的时间较短 或某些化学反应 如醇化等 尚未彻底进行 以致混合展开剂之组成尚未稳定 而导致斑点比移值不稳定 克服方法 展开剂在配制后 应在层析温度下放置三天后方可使用 6 展开槽之规格不一致 克服方法 应使用同一规格的展开槽 7 展开剂过多次数的重复使用 也会影响斑点比移值的稳定 克服方法 新鲜配制的展开剂 最好只使用一次 8 其它如展开槽未刷净 未能彻底干燥即加入展开剂 以及展开剂保存不当等原因所引起 均应加以注意 六 斑点异形1 产生的原因及克服方法产生斑点异形的原因很复杂 主要由于吸附剂的细度 活度不均 薄层板铺陈的厚薄不均等原因 有时在层析进行过程中 挪动展开槽或薄层板 克服方法 注意上述情况 可以克服斑点异形 一般情况下 硅胶 氧化铝的粒度在200目左右为宜 活度一般在1 级 使用前吸附剂应充分混合 第三节高效液相色谱法一 基本概念1 色谱流出曲线和色谱峰1 色谱流出曲线样品被流动相冲洗 通过色谱柱 流经检测器 得到的信号 洗脱时间曲线称为色谱流出曲线 色谱图 2 基线检测器中只有流动相通过或虽有组分通过而不能为检测器所检出时 给色谱流出曲线出的流出曲线称为基线 噪音 漂移 3 色谱峰流出曲线上的突起部分称为色谱峰 正常色谱峰为对称形正态分布曲线 不对称色谱峰有两种 拖尾峰和前延峰 色谱峰的对称性用对称因子 fs 来衡量 中国药典 称对称因子为拖尾因子 对称因子可按左图由下式计算 fs W0 05h 2A B A 2Afs 0 95 1 05为正常峰 对称因子计算示意图fs1 05为拖尾峰 2 定性参数1 保留时间 保留时间 tR 死时间 t0 在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间 调整保留时间 t R t R tR t0在实验条件一定时 调整保留时间只决定于组分的性质 2 保留体积 保留体积 VR VR tRFc Fc为流动相的流速 死体积 Vo 调整保留体积 V R V R VR Vo或V R t R Fc 3 柱效参数1 区域宽度在一定实验条件下 区域宽度越大 峰越胖 柱效越低 反之 则越高 区域宽度有下述三种表示方法 标准偏差 正常峰的标准偏差为峰高0 607倍 0 607h 处的峰宽之半 标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度 小 分散程度小 极点浓度高 峰形瘦 柱效高 反之 大 峰形胖 柱效低 色谱峰的区域宽度示意图 半峰宽 Wh 2 Wh 2 2 355 峰宽 W 通过色谱峰两侧的拐点作切线在基线上所截的距离 称为峰宽或基线宽度 W 4 或W 1 699Wh 2 2 理论 塔 板数与理论塔板高度理论塔板数取决于固定相的种类 性质 粒度 粒度分布等 填充状况 柱长 流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质 理论塔板数 n n tR 2 n 5 54 tR Wh 2 2 16 tR W 2n有效 t R 2 5 54 t R Wh 2 2 16 t R W 2 理论塔板高度 H 理论塔板高度定义为每单位柱长的方差 即H 2 L实际计算时往往用柱长L和理论塔板数计算 H L n或H有效 L n有效 4 相平衡参数1 分配系数 K K Cs Cm 分配系数与保留时间的关系 tR t0 1 K Vs Vm 或t R t0 K Vs Vm 分配系数与保留体积的关系 VR Vo 1 K Vs Vm 2 容量因子 k 容量因子的定义式是 k K Vs Vm k CsVs CmVm Ws Wm tR t0 1 k t R kt03 选择性因子 相邻两组分的分配系数之比或容量因子之比称为选择性因子 K2 K1 k2 k1或 t R2 t R1要使两组分得到分离 必须使选择性因子不等于1 5 分离参数1 分离度 R 相邻两峰分开的距离与平均峰宽的比值称为分离度 R tR2 tR1 W1 W2 2 分离度的数值与相邻两峰分离状况的关系 R 1 称为4 分离 两峰基本分开 裸露峰面积为95 4 R 1 5 称为6 分离 分离后各峰露出分离度计算示意图的面积为99 7 R 1 5称为完全分离 2 基本分离方程式分离度的影响因素很多 可用基本分离方程式概括 R n1 2 4 1 k2 1 k2 a b c a项取决于柱效 柱效高 n大 则a项大 b项与c项相关联 都与色谱柱及流动相性质有关 但b项主要取决于固定相和流动相的种类 极性 而c项在流动相种类 包括元数 选定后 主要取决于流动相的配比 基本分离方程可用于指导色谱条件的选择 首先是提高柱效 即增加理论塔板数 方法之一是增加柱长L 更好的方法是降低理论塔板高度 其次是增加选择性 一般说来可以采取下列措施来改变选择性 改变流动相的组成 改变柱温 改变固定相 改变容量因子常常是提高分离度的最容易的方法 这可以通过调节流动相的组成来实现 一般应使k2在1 10的范围内 最好为2 5 窄径柱可更小些 二 定量分析方法HPLC定量分析的参数是色谱峰高和峰面积 定量依据是样品中组分的量 或浓度 与峰高或峰面积成正比 常用的定量方法有外标法 内标法和内加法 1 峰高和峰面积正常峰面积 A 1 065Wh 2 h不对称峰的面积可用平均峰宽来计算 A 1 2 W0 15h W0 85h h一般说来 当分离度小或流量波动时 常用峰高定量 当峰形不正或色谱柱超负荷时 用峰面积定量 各种色谱峰峰高示意图 2 外标法用与待测组分同质的标准品作对照品 以对照品的量对比求算试样含量的方法称为外标法 外标法是HPLC常用定量分析方法之一 1 外标工作曲线法 用对照品配制系列浓度的对照品溶液 准确进样 测量峰面积 A 或峰高 h 对浓度C绘制工作曲线 利用此曲线或它的回归方程式计算样品溶液的含量 A a bC或h a bC式中b与a分别为直线的斜率和截距 2 外标一点法 只有在工作曲线通过原点 即截距为零时 才可用外标一点法进行定量分析 外标一点法的计算公式如下 C样品 C对照 A样品 A对照峰形为正常峰时 式中的峰面积A可用峰高h代替 3 内标法选择适宜的物质作为内标物 以待测组分和内标物的峰高比或峰面积比求算试样含量的方法称为内标法 内标法的关键是选择合适的内标物 内标法可以分为工作曲线法 内标一点法 内标二点法及校正因子法等 1 工作曲线法 在各种浓度的对照品溶液中加入相同量的内标物 分别测量i组分与内标物s的峰面积A 或峰高h 以峰面积比Ai As与Ci绘制工作曲线 或求出回归方程式 Ai As a bCi 2 内标一点法 只有线性关系好且截距a为零时才可用内标一点法定量 Ci 样品 Ai As 样品 Ai As 对照 Ci 对照 3 内标校正因子法 被测组分单位峰面积所相当物质的量与内标物单位峰面积所相当物质的量的比值 这是相对重量校正因子 简称校正因子 常自行测定 其测定方法是配制含有内标物的对照品溶液 在完全相同的实验条件下 进样5 10次 分别测定峰面积 代入下式求各组分的相对重量校正因子 fi mi Ai ms As 式中mi与ms分别为待测组分与内标物的量 Ai与As分别为它们的峰面积 用内标校正因子法进行定量分析时 准确称取ms克的内标物 加入样品内混匀 进样 则i组分与内标物重量间有下述关系 mi ms Aifi AsfS 如果样品量为m克 则i组分在样品中的百分含量为 Ci Aifi AsfS ms m 100 4 内加法将待测组分i的纯品加至待测样品溶液中 测定增加纯品后的溶液比原样品溶液中i组分的峰面积增量 求算i组分的含量 内加法定量分析计算公式如下 mi Ai Ai mi式中 mi是纯物质i的加入量 Ai是相应增加的峰面积 三 化学键合相色谱法1 化学键合相色谱法的固定相化学键合相按键合官能团的极性可分为极性和非极性键合相两种类型 极性键合相主要有 CN NH2和二醇基键合相 常用作正相色谱 混合物在极性键合相上的分离主要是基于极性键合基团与溶质分子间的氢键作用 极性强的组分的保留值较大 非极性键合相主要有烷基键合相 如C8 C18等 和苯基键合相 其中以C18键合相 ODS 应用最为广泛 通常都用作反相色谱 极性弱的组分的保留值较大 pH值 一般来说 硅胶键合相应在pH 2 8的介质中使用 2 化学键合相色谱法的分离条件选择1 固定相的选择分离中等极性和极性较强的化合物可选择极性键合相 氰基键合相对双键异构体或含双键数不等的环状化合物的分离有较好的选择性 氨基键合相具有较强的氢键结合能力 对甾体 强心甙等有较好的分离能力 同时氨基能与糖类分子中的羟基产生选择性相互作用 故被广泛应用于糖类的分析 二醇基键合相适用于分离有机酸 甾体和蛋白质 分离非极性和极性较弱的化合物可选择非极性键合相 利用特殊的反相色谱技术 非极性键合相也可用于分离离子型或可离子化的化合物 短链烷基键合相能用于极性化合物的分离 而苯基键合相适用于分离芳香化合物 2 流动相的选择正相键合相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂 通过调节极性调整剂的浓度来改变溶剂强度 使样品组分的k值在1 10范围内 反相键合相色谱的流动相通常以水作基础溶剂 再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂 如甲醇 乙腈 四氢呋喃等 一般情况下 甲醇 水 乙腈 水系统已能满足多数样品的分离要求 是反相键合相色谱最常用的流动相 在采用键合相色谱法分离含极性差别较大组分的样品时 为了使各组分均有合适的k值并具有良好的分离度 也需采用梯度洗脱技术 3 其它条件的选择一般应控制流动相的pH值在2 8范围内 分析弱酸样品时 通常往流动相中加入少量弱酸 常用50mmol L磷酸盐缓冲液和1 醋酸溶液 pH pKa 1或pH pKa 1同时采用离子对色谱 分析弱碱样品时 通常往流动相中加入少量弱碱 常用50mmol L磷酸盐缓冲液和30mmol L三乙胺溶液 pH pKa 1或pH pKa 1同时采用离子对色谱 四 样品的预处理1 液 液萃取分离 LLE 有机溶剂直接萃取法与离子对萃取法 样品萃取后需将溶液相过滤 加无水硫酸钠干燥 蒸发 浓缩 定容后才可使用 2 液 固萃取分离 LSE 1 方法简介 本法是用液相色谱的原理来处理样品的一种方法 在一小柱中装上固体萃取剂 将样品上柱后 药物在柱上保留 用选好的溶剂清洗除去杂质后 再将药物从柱上洗脱下来 2 亲脂性键合相硅胶 C18是最常用的固体萃取剂 适用于萃取 纯化水基质体液中亲脂性药物 使用亲脂性键合相硅胶LSE柱的一般程序为 柱的活化 用2ml甲醇冲洗以润湿键合相除去杂质 再用0 5ml水冲洗除去柱中的甲醇 加样 使样品流过柱子 清洗 用2 5ml水清洗以除去弱保留的亲水组分 洗脱 用2 5ml甲醇或甲醇 水洗脱大分子的肽 甾体 较亲脂的药物等强保留的待测组分 3 大孔吸附树脂 4 亲水型填料 硅藻土 硅胶 棉纤维为常用的亲水型填料 5 离子交换树脂 五 液相色谱的新进展1 胶束色谱 1 表面活性剂与胶束 当溶液中的表面活性剂超过一定的浓度 该浓度被定义为临界胶束浓度 即CMC 时 则会发生自聚 形成胶束 水溶液中形成的胶束为正相胶束 可用于反相色谱 非极性溶剂中则形成反相胶束 可用于正相色谱 常用的表面活性剂为十二烷基磺酸钠 十六烷基三甲基溴化铵 聚氧乙烯 23 十二烷醇 丁二酸二辛酯磺酸钠 2 胶束色谱的基本公式 Vs VR Vm r KMW 1 KSW Cm 1 KSW式中 Vs固定相体积 Vm流动相体积 即死体积 VR洗脱体积即保留体积 r胶束中表面活性剂的定浓比容 单位ml g Cm构成胶束的表面活性剂浓度 Cm 表面活性剂总浓度减去临界胶束浓度 单位g ml 对于一定的色谱条件 Vs Vm r KMW KSW均为定值 3 胶束色谱的柱效 正丙醇是目前最有效的修饰剂 使用含3 10 的正丙醇的胶束流动相可达到用水 有机溶剂流动相时所获得的柱效 4 胶束色谱的梯度洗脱 当固定相与高于CMC以上的表面活性剂平衡之后 进行梯度洗脱不会引起固定相溶剂化结构的变化 若再次进样 不需重新平衡 只需少量流动相冲洗一下混合器和预柱 胶束色谱的梯度洗脱不影响电化学检测器的使用 2 离子对色谱1 基本原理反相离子对色谱用疏水性键合相为固定相 被分离的A 与B 同时存在于强极性流动相中 生成的AB离子对复合物在两相间进行分配分离 其分配系数DAB与容量因子K 为 DAB AB org A aq EAB B aqK DABVS Vm EAB B aqVS Vm从上式看出K 随 B aq与EAB的增加而增加 K 在1 10之间较好 因K 太大 则分析时间太长 2 IPC的影响因素IPC中的pH将决定离子型物质的解离程度 通常pH为2 0 7 4 最大不超过9 0 一般测酸性物质时 pH需调在7 0 7 5 测碱性物质时调至3 0 3 5 反相离子对色谱 其流动相的pH应控制在2 0 8 0范围内 以防止硅胶基质的溶解 通常在反相离子对色谱中平衡离子的非极性部分愈大 K 也愈大 采用无机离子 K 显著减小 三 三维色谱高效液相色谱与多通道光谱检测器 MCPD 的联用技术 它能同时描绘某个化合物的三维模式图 图中用X轴表示被分离组分的保留时间 Y轴表示紫外吸收强度 Z轴表示紫外波长 三维高效液相色谱技术在中药制剂的定性定量方面非常有价值 该技术的主要优点是 信息量大 能同时获得被分离组分的保留时间及其紫外吸收曲线 第四节气相色谱法气相色谱法特点 1 分离效能高理论塔板数可达105 1062 分析速度快几分钟至几十分钟3 灵敏度高检测限可达10 12g4 可以多机联用GC IR GC MS等气相色谱法的主要局限性样品必须具有一定的挥发性和热稳定性 在做定性鉴别时需要与对照品比较 一 分离条件的选择1 载气的选择1 载气与所用的检测器匹配 TCD H2 He为载气效果最佳 FID 一般以N2或H2为载气 ECD 高纯氮 99 99 为载气 2 载气流速 一般为20 100ml min 3 高流速 选用H2 He 低流速 选用N2 2 柱温的选择高沸点样品 采用低固定液配比 高柱温 中等沸点样品 采用中等固定液配比 中等柱温 低沸点样品 采用高固定液配比 低柱温 宽沸程样品采用程序升温 3 固定液的选择选择固定液时 根据样品的组成 组分的结构及沸点范围等 按 相似相溶 原则进行选择 即极性溶质选用极性固定液 非极性溶质选用非极性固定液 麦克雷诺常数 McReynoldeConstant 表示及比较某一液相对两种不同类型化合物所显示的分离能力的常数 IRX为极性变化值 b为正链烷烃净保留时间的对数与碳原子数的函数曲线的斜率 r为相邻正链烷烃净保留时间的比率 不同类化合物 选 IRX差值大的固定液 同系物选b r高的固定液 4 其他条件的选择1 采用低进样量 液体为0 1 2 l 2 气化室温度 等于样品沸点或稍高 不超过沸点50 以上 3 检测室温度 等于气化室温度或高于柱温30 左右 二样品的处理1 分解法将高分子化合物分解为低分子化合物 借分析低分子化合物来对高分子化合物定性 定量 2 衍生物法酯化法 高级脂酸肪甲酯化是高级脂肪酸分析最常用的方法 甲酯化常用BF3 甲醇试剂 余略 三 应用举例1 样品处理 葵酰乙醛 鱼腥草素 亚硫酸氢钠用吐温增溶 BaCl2溶液沉淀使葵酰乙醛游离 氯仿萃取葵酰乙醛 2 分析方法 GC内标法定量 3 系统适应性 SE 30熔融石英毛细管柱 25m 0 32mm df0 52um 气化室250 检测室300 初温150 终温240 线性升温速度5 min 分流进样 分流比1 50 He 99 999 31KPa FID 四 闪蒸气相色谱法闪蒸气相色谱法是将样品直接放置在闪蒸器内 在一定的温度下 样品中的易挥发组分在短时间内蒸发出来 被载气带入气相色谱柱中进行分离分析 关键是选择适当的闪蒸温度与闪蒸时间 通常在进行中药制剂中挥发性组分分析时 闪蒸温度多选在110 300 之间 时间为10 20秒的范围内 第五节荧光分析法特点1 灵敏度高10