【毕业学位论文】（Word原稿）葡萄糖氧化酶基因和草酸氧化酶基因在甘蓝型油菜中的表达研究作物遗传育种硕士论文

中国农业科学院硕士学位论文 葡萄糖氧化酶和草酸氧化酶在 甘蓝型油菜中的表达 1 密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 葡萄糖氧化酶基因和草酸氧化酶基因 在甘蓝型油菜中的表达研究 中国农业科学院硕士学位论文 葡萄糖氧化酶和草酸氧化酶在 甘蓝型油菜中的表达 2 .) 摘 要 核盘菌 是一种广谱性病原真菌，能危害 75 科 400多种植物。在我国， 大豆、油菜、向日葵和十字花科蔬菜上引起严重的菌核病，造成巨大的经济损失。 研究表明，草酸毒素在 S. 病过程中起关键作用。遗憾的是，人们至今尚未发现对 S. 疫的或有效的天然抗源。 葡萄糖 氧化酶（ 有氧条件下催化 萄糖生成葡萄糖酸，并以结合质子形成 草酸氧化酶（ 够把毒素草酸降解为 葡萄糖酸作为代谢的中间产物可通过糖醛酸途径或磷酸戊糖途径进一步被利用。 被植物再固定。 活性氧类的一种， 具有直接的抑菌活性，又可作为信号分子诱发植物的过敏反应、系统获得性抗性等防卫反应，增强植物的抗病性。 因此，通过基因工程的手段，把 因和 因 导入寄主植物，来增强寄主植物 广谱抗病性或提高 寄主植物对 S. 性，培育抗病品种或种质 ，在生产上具有重要的意义。 本研究以来源于小麦的 因和来源于 因为外源基因，以基础，构建 基因和 基因两个植物表达载体，并利用本课题组保存的 因植物表达载体，以子叶柄为外植体，采用农杆菌介导的遗传转化方法，对甘蓝型油中国农业科学院硕士学位论文 葡萄糖氧化酶和草酸氧化酶在 甘蓝型油菜中的表达 3 菜进行转化；获得了转 因和 因的单、双价转基因工程油菜，其中，转 因油菜 12 株，转 因油菜 9 株，转 基因油菜 6 株。通过加代扩繁，目前已获得了 转基因油菜株系。 测 和 交证明， 因和 因已整合到转基因油菜的基因组中。 测表明， 转 因油菜中得以表达， 低 高 差 5倍以上，这表明 因在转基因油菜得到表达，但不同转基因株系之间表达水平可能有很大差异。对转 因油菜进行了 活性 (以 示 )分析表明，非转基因油菜 下，转 因植株的酶活性在 上，比非转基因油菜高 最大 非转基因油菜的 。用超氧钛法测定了转 因油菜中 量 。每克转 因油菜叶片 量 大多在 220 M 以上，比非转基因油菜高 最高含量为 656 M，是非转基因油菜 量 。 采用离体叶接种法对转 因油菜 系进行菌核病抗性鉴定。方差分析表明，转基因油菜和非转基因油菜抗病性差异显著，在转 因油菜上菌丝侵染迟，扩展慢，对 S. 抗性明显提高。对转 因油菜和转 O 双价基因油菜菌核病抗性鉴定尚未完成。 关键词：草酸氧化酶基因， 葡萄糖 氧化酶基因，农杆菌介导的遗传 转化，甘蓝型油菜，菌核病 中国农业科学院硕士学位论文 葡萄糖氧化酶和草酸氧化酶在 甘蓝型油菜中的表达 4 he 00 of a to be a It is no in to be or . in of 2 a of A 2 O2 2is a of be in be or of to as to as to a of of of O a to to a of is in of XO to XO O 5S a 84039. A 7 2 9 6 or/O in 2O2 in be as 56 M of is .3 in XO is as is .2 in in to of 2.9 at %. of as 国农业科学院硕士学位论文 葡萄糖氧化酶和草酸氧化酶在 甘蓝型油菜中的表达 5 is in ., 国农业科学院硕士学位论文 葡萄糖氧化酶和草酸氧化酶在 甘蓝型油菜中的表达 6 缩略词表 6 5S ,4 2,4 O R B 2-(S D 35s 35S 国农业科学院硕士学位论文 葡萄糖氧化酶和草酸氧化酶在 甘蓝型油菜中的表达 7 A 5 中国农业科学院硕士学位论文 葡萄糖氧化酶和草酸氧化酶在 甘蓝型油菜中的表达 8 目 录 摘要 . . . 缩略词表 . 第一章 前言 . 1 1 活性氧类和病原菌毒素在寄主植物与病原菌互作中的作用 . 1 寄主植物与病原菌互作中的作用 . 1 物中 产生 . 1 植物抗病过程中的作用 . 2 物中的 除系统 3 原菌毒素在寄主植物与病原菌互作中的作用 . 4 要植物病原菌毒素 5 原菌毒素在病原菌致病过程中的作用 . 6 2草酸氧化酶 (葡萄糖氧化酶 (其转基因研究进展 . 7 及其转基因研究进展 7 能是生物界最重要的草酸降解酶 . 7 组成、结构及其酶学研究 . 9 植物抗毒素基因工程中的应用 . 10 O（ 其转基因研究进展 . 11 O 的天然来源 . 11 O 的 组成、结构及其酶学 研究 . 11 . 12 3 本研究的目的 . 12 第二章 因和 因在大肠杆菌中的表达 . 材料与方法 14 料 14 株 . 14 粒 . 14 研究所构建的质粒 . 14 . 14 生素 . 15 . 15 粒 提取 . 15 中国农业科学院硕士学位论文 葡萄糖氧化酶和草酸氧化酶在 甘蓝型油菜中的表达 9 限制性酶切 . . 16 的基因的 增 16 凝胶中回收目的 16 切载体与外源 连接 17 肠杆菌感受态的制备（化学法） 17 粒 化大肠杆菌（化学法） . 18 源基因的诱导表达 18 白质的 丙烯酰胺凝胶电泳（ 18 血清的制备 . 20 2 结果与分析 . 21 因在大肠杆菌中的表达 . 21 因原核表达载体的构建 . 21 因的 导表达 . 22 . 23 O 基因保守区段原核表达载体的构建 . . 23 O 基因保守区段的 导表达 . . 23 清的制备 . 24 3小结 . 24 第三章 因 和 因 在甘蓝型油菜中的转化 . 25 1 材料与方法 25 料 . . 25 物受体 . . 25 株 . . 25 粒 . . 25 研究所构建的质粒 . . 26 . 26 . . 27 . . 27 物表达载体构建 . 27 蓝型油菜的遗传转化 . 28 菜基因组 提取 . 29 基因油菜的 定 . 29 基因油菜的 迹杂交检测 . 30 基因油菜的基因组 迹杂交鉴定 . 30 2 结果与分析 . 32 物表达载体的构建 . 32 因植物表达载体的构建 . 32 因和 因双价表达载体的构建 34 中国农业科学院硕士学位论文 葡萄糖氧化酶和草酸氧化酶在 甘蓝型油菜中的表达 10 蓝型油菜的遗传转化 . 35 性苗的获得和转基因系后代的繁育 . 35 基因油菜的分子生物学鉴定 . . 36 基因油菜的 . 36 基因油菜的 交检测 . 37 基因油菜的基因组 迹杂交鉴定 . 38 基因油菜中外源基因的遗传特性分析 . 39 3 小结 . 39 第四章 转基因油菜的表达分析及其菌核病抗性研究 . . 41 1 材料与方法 . 41 . 41 物材料 . . 41 核 . . 41 养基 . 41 . 41 . 感性试验 . 41 基因油菜的 性分析 . 42 因油菜中 测 . . 43 基因油菜的 性分析 . . . 44 基因油菜的菌核病抗性鉴定 . . 45 2 结果与分析 . 45 . 感性试验 . 45 46 因油菜中 测 . 46 . 47 因油菜中 含量与酶活性的相关性分析 . . 48 基因油菜的菌核病抗性鉴定 . . 49 3小结 . . 50 第五章 讨论 . . 52 1. 外源基因对转化效率的影响 . 52 2. 整合 序列不完整性 . . . . 转基因油菜的抗氧化代谢能力 . . 52 参考文献 . . 54 致谢 . 60 作者简历 . . . 61 中国农业科学院硕士学位论文 葡萄糖氧化酶和草酸氧化酶在 甘蓝型油菜中的表达 11 第一章 前言 植物一生中经常会遇到病原物、动物、杂草等的侵袭，其中，病原物的危害更微妙更复杂 ,因为病 原物的侵染不同于一般的物理化学逆境，其危害具有互动性。病原物 或附生、或寄生、或腐生、二者或亲和或不亲和，构成了多种多样的互动关系。 一方面，病原物通过分泌毒素、酶、激素等对寄主施以危害；另一方面，植物又通过预成的组织结构和化学物质，如角质、蜡质、细胞壁凝集素、植保素、木质素，和病原物诱导形成的抗病相关物质，如病程相关蛋白，来抵御病原菌的浸染。 病原菌产生致病因子，寄主植物产生抗病物质，相生相克，协同进化，共同演变，构成了病原菌和寄主植物互作的内容。 可以说，互动性是植病系统最基本的特征。纵观植物病理学的发展历程， 可以说，病原菌与寄主植物的互作是植物病理学研究的主线和核心内容（王金生， 1999）。 围绕着病原菌和寄主植物的互作，植病界先后提出了基因对基因理论 ,激发子与受体生化模式等。随着植病理论和分子生物学研究的不断深入，病原菌与寄主植物的相互识别和信号转导与传递又成为新的热点。植物受病原，包括毒素，侵袭后发生识别，启动一系列的防御反应机制，如过敏反应，水杨酸途径，茉莉酸途径和氧化激增（ 途径等。这些途径之间的关系，目前还不很清楚，其中氧化激增可能发生在其它几个途径的上游，对抗病性反应有 调节作用。氧化激增中产生的 活性氧类（ 是一类抗病相关物质，在植物抗病反应中起着重要作用。适当提升植株的 平，降解病原菌毒素（ 能是基因工程培育抗病品种的策略之一。 1 活性氧类和病原菌毒素在寄主植物与病原菌互作中的作用 寄主植物与病原菌互作中的作用 植物在长期进化过程中形成了一系列防御病原菌入侵的机制。其中，氧化激增（ 植物防御过程中出现的一种早期的快速而短暂的反应，在此过程中，植物产 生大量的要包括超氧阴离子自由基（ 羟自由基（ 、超氧羟基（ 过氧化氢（ 。 诱发脂类物质的过氧化，破坏核酸和蛋白质，从而抑制病原菌的侵染。 物中 产生 自分子氧，是氧气被还原的过程中形成的高能、不稳定的中间产物。基态氧分子是顺磁性，含两个受电子自旋限制而处于相对稳定状态的不成对电子。生物体内存在很多酶类和复杂的电子载体，它们可以使基态氧分子绕过电子自旋的限制，进行单价、双价、三价的还原，从而产生 、 ， 2001)。植物除正常代谢过程会产生 ，逆境胁迫包括生物逆境（如病原物入侵）、非生物逆境（如辐射、除草剂、创伤、臭氧、二氧化硫、中国农业科学院硕士学位论文 葡萄糖氧化酶和草酸氧化酶在 甘蓝型油菜中的表达 12 极端温度、盐碱、水渍）等均可引起植物体内 增加。 常由 供。 - 和 时存在，二者处于平衡状态。 引发脂类物质的氧化。 - 和 秒钟，在中性和微酸条件下，或在超氧化物歧化酶的作用下很快歧化成 2（ 1978）。因此，只要有超氧离子的存 在就会有 是一种相对稳定的化合物，和生物分子的反应比超氧离子慢。羟自由基通过 应（ + ） 形成，由于反应需要过渡金属作催化剂， 在细胞中的定位可能是由金属复合物的位置决定的。 有几秒钟，研究起来比较困难。 研究表明， 产生有两个高峰，第一次是在病原物侵染后几分钟后出现，之后很快降低到本底水平。第二次则从侵染后的 1时出现，且峰值可维持 2 小时。当用不亲和病原菌接种时，这两个峰值都会出现 ，而用亲和病原菌接种时，只出现第一次峰值（ , 1993；1983）。而且，第一次峰值可被激发子所诱导，而第二次峰值则需要活的病原菌的诱导（ ， 1993）。 化酶可诱导 生。 1985）发现，马铃薯组织受到 亲和小种诱导后，位于膜上的 化酶催化产生 发现的作为 源的酶，除 化酶外，还有过氧化物酶、脂氧酶、多胺氧化酶、葡萄糖氧化酶、二胺氧化酶及草酸氧化酶 /。 植物抗病过程中的作用 直接的抗菌活性 生物体内的抗菌活性已得到充分证明，动物细胞吞噬细菌后，在细菌周围积累 达到抗菌水平。外源超氧离子和 , 1993； 1992)和细菌（ , 1995）的抗菌活性也被证实。 （ 1992）发现 22 M 的 完全抑制 孢子萌发（ 1992）。 （ 1995）发现 100 M 生长。 诱导细胞壁结构蛋白的氧化交联 用真菌激发子葡聚糖或谷光甘肽处理菜豆或大豆细胞，可导致细胞壁上富羟脯氨酸结构蛋白 分子量为 33固化（ , 1992； , 1994）。实验表明， 有类似效应，而且反应中 固化可以被过氧化物酶或抗坏血酸所抑制， 因为二者均可降解氧暴发过程中产生的 1997）用 1 细胞壁片段， 木聚糖酶等，处理培养的番茄细胞，结果导致了细胞壁的加固。他们认为，真菌激发子或 异二酪氨酸（ 化成二异二酪氨酸（ 并进一步加强已有的细胞壁蛋白的氧化交联，从而 限制了病原菌的侵入。 真菌激发子或 导细胞壁结构蛋白的氧化交联与植物细胞壁中的过氧化物酶活性直中国农业科学院硕士学位论文 葡萄糖氧化酶和草酸氧化酶在 甘蓝型油菜中的表达 13 接相关。植物细胞胞壁过氧化物酶能够利用 化酚类物质，进而形成木质素，促使细胞壁的硬化（ 1977； 1978； et 1991）。 过敏反应（ 植物受到非病原或无毒病原菌浸染时产生的一种快速、局部的程序化细胞死亡现象。离体实验表明，低剂量长时间的 理可 诱导一系列细胞防卫基因的表达，而提高 量则导致细胞死亡。用携带 因的 种大豆细胞培养物可导致细胞死亡。 过氧化氢酶分别抑制氧化激增和降解由此产生的 者都可抑制植物细胞的过敏性死亡（ , 1994; , 1991）。 诱发的 能与细胞质中 度的增加有关。用 种豇豆抗性品种后，抗病品种细胞质中 度大幅度增加 ，感病品种中 度变化不大（ 1998）。荧光成象分析表明，细胞质中 度与 积累可导致 度的提高（ , 1996）。 (中心组织者 植物受到病原菌弱毒株或不亲和株的侵染后，可对随后同种病原甚至不同病原的浸染表现出广谱和持久的抗性，称诱导抗性 (在 诱发过程中，何种信号分子通过何种途径传递信号是目前植物分子病理学研究的重点。很多报道认为，水杨酸（ 系统信号（ , 1990）。提高植物内源 平，能够提高植物抗病毒和抗真菌的能力 , 2000）。 在烟草中曾发现 合蛋白（ 其 列和过氧化氢酶高度同源， 合物的大小及其亚基大小也与已知的过氧化氢酶一致（ , 1993）。纯化的 够将 2O 和 预示着 能通过抑制包括 内的过氧化氢酶的活性来提高体内的 平，从而引 起苯甲酸（ 积累。 化为 等， 1995）。 然而后来的研究结果并不支持这种论断 , 因为 种烟草后 ,形成过程中并未见检测到 平的增加；另一方面，用递增浓度的 积累呈剂量依赖性型（ ， 1995）。这一事实揭示 能处于 游，作为关键的信号分子激发 发生。 此外， R 反应，与病原激发子诱导的氧化激增，细胞壁交联，防卫基因的表达，在时空上非常一致（ , 1992）。由此可见， 能是 中心组织者。 物中的 除系统 如果植物体内的 度过高，就会对植物细胞本身产生毒性。在长期的进化过程中，植物体形成了自身的 除系统。植物中的 除系统有两类：小分子清除系统和酶清除系统。 小分子清除系统包括抗坏血酸、谷胱甘肽、类胡萝卜素、维生素 E、酚类和类黄酮类化合物等。类胡萝卜素、维生素 E、酚类和类黄酮类化合物能清理单线态氧（ 1(1998； , 1990； , 1995)，抗坏血酸能清理 1987），谷胱甘中国农业科学院硕士学位论文 葡萄糖氧化酶和草酸氧化酶在 甘蓝型油菜中的表达 14 肽能保护酶清除系统的酶。 植物中的 清除系统包括超氧化物歧化酶（ 抗坏血酸过氧化物酶（ 谷胱甘肽还原酶（ 过氧化氢酶等。前三者形成一个高效的抗坏血酸 要用来降解植物体内过多的 和 1过氧化氢酶对 和性不高， 1M，主要降解好氧生物过氧化物酶体中的 在植物中的 清除系统中的作用可能并不十分重要（ 1985）。只有在逆境条件下，植物体内的 聚增加，造成抗坏血酸 降解 作用才变得相对重要。 图 1物中的抗坏血酸 in 原菌毒素在寄主植物与病原菌互作中的作用 上世纪初，当植物病理学还处于发展初期时，科学家们就开始注意到植物病源菌的另一致病因子 毒素。在研究病原菌侵染植物及鉴别病原物在病程中的作用时，人们发现毒素能产生所有 或至少是多数的症状，因而启发人们进一步去认识病源菌毒素的地位与作用。然而，人们对毒素的概念一直比较模糊，直到上世纪 80 年代才有了一个较为明确的定义：毒素是病原物的代谢产物，在低浓度下就有很强的生理活性，对寄主植物有明显的损伤作用，是植物病害发生、发展过程中的致病或致毒物质。 长期以来，植病学家、化学家，分子生物学家一直致力于毒素的化学本质研究，对那些重要的致病毒素进行分离、纯化和结构测定，结果发现除少数毒素为蛋白质外，其它均为低分量的次生代谢物质，如糖甙、萜类和酮醇等。病原菌毒素既非激素，也不属于酶类物质， 它与真菌激发子（ 抑制子（ 间也有明确的界线。后两者主要是真菌细胞壁的组成成份。 近年来，国内外的毒素研究工作者对水稻稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、棉花黄萎病菌、玉米大小斑病菌和果蔬上造成叶斑病害的炭疽病菌、褐斑病菌等毒素开展了深入的研究，取得了很重要的进展，为研究 病原菌毒素在寄主植物与病原菌互作中的作用提供了很多有用的材料。 中国农业科学院硕士学位论文 葡萄糖氧化酶和草酸氧化酶在 甘蓝型油菜中的表达 15 要植物病原菌毒素 毒素有两类，即寄主专化性毒素 (非寄主专化性毒素(在已经发现的毒素中， 21 种， 约 50 种（章元寿， 1997）。 寄主专化性毒素（ 对产生该毒素的病原物的亲和寄主表现出毒性，而对抗病寄主或非寄主植物不表现出毒性。已鉴定的 要出现在为害双子叶的链格孢属（ 和为害单子叶的长蠕孢属（ 中。 燕麦维多利亚长蠕孢菌（ 产生，是一种与含氮倍半萜相连的多肽，含萜部分无寄主专化性，多肽部 分与接合位点相亲和，决定了该毒素的专化性。研究表明，燕麦对 由该菌产生的 b 基因和个