【毕业学位论文】（Word原稿）根部特异性启动子rRB7在拟南芥和棉花中的表达研究生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 根部特异性启动子 拟南芥和棉花中 的 表达研究 of of I 摘 要 启动子在基因表达调控中起关键性作用，它在很大程度上决定目的基因表达的时间、空间和强度。 当前商业化应用的 植物基因工程 产品大多使用的 是组成型启动子，它们驱动外源基因在植物各种组 织和所有发育阶段表达，这无疑增加了植物的代谢负担，并造成物质和能量的浪费，往往还会引起植物形态发生改变，甚至影响植物生长发育。因此，本研究 从烟草基因组中克隆根部特异性表达 因启动子 分别与 因融合，转化拟南芥和棉花，取得如下结果： 1构建成功 3 个植物表达载体： 带 35s 启动子驱动 因的表达盒； 带 动子驱动 因的表达盒； 带 动子驱动 因的表达盒。 2通过花沾法 将植物表达载体 入拟南芥 ， 分别获得 再生植株 15 株和 16 株。 利用激光共聚焦 显微镜扫描 转基因拟南芥幼苗不同部位的荧光强度，结果表明， 动子驱动 因在根尖伸长区、成熟区以及根颈部优势表达，但其荧光强度比对照 动子低约 在茎、叶中基本不表达，说明该启动子具有根组织特异性，但与 动子相比不是一个强启动子。 3 通过花粉管通道法将植物表达载体 入陆地棉品种 ， 经 卡那霉素筛选和 定，得到 转基因植株 15 株。 用荧光定量 术检测 动子驱动 因在部分单株根组织中的相对表达量，结果表明 启动子片段 驱动 因在棉花根组织特异表达，但单株表达水平均低于对照 5S 启动子，与拟南芥中的检测结果一致。叶绿素含量测定结果表明，在根部特异性表达 因对转基因棉花叶绿素含量变化的影响较小。 本论文分析 了 来源于烟草的 动子在 拟南芥及棉花中表达的组织特异性 ， 验证了该启动子在植物根组织中具有优势表达特性，并与 因融合，提高了转基因棉花的耐涝性， 为 用于植物根组织的基因工程改良研究打下了基础，并 对增强植株吸收水分，肥料及微量元素、有效抵抗 土传 病虫害以及在特殊生态环境下生存 均 具有 一定 的实际意义。 关键词 : 动子 ，拟南芥 ，棉花 ，根 an in of as in in of by of in be as 1、 2、 15 6 1 by FP in of is no in is a it is an 3、 18 by 15 by CR of by in by in is is of of on of In of in to to in it to be in of to as as in 录 第一章 绪论 . 1 对于高等植物具有重要的生理意义 . 1 的主要生理功能 . 1 良高等植物根的性状具有重要意义 . 2 动子研究进展 . 5 述 . 5 动子的一般结构 . 6 物启动子 的分类和应用 . 9 动子的选择和改造 . 14 因及其启动子研究进展 . 14 物遗传转化方 法 . 14 杆菌介导法 . 15 因枪法 . 15 粉管通道法 . 16 物遗传转化存在的问题与对策 . 17 基因植物的检测技术 . 18 基因整合状况的检测 . 18 源基因表达特征的检测 . 19 色荧光蛋白 . 20 色荧光蛋白的结构与特点 . 20 色荧光蛋白的种类 . 21 色荧光蛋白作为标记分子的优点 . 21 色荧光蛋白的应用 . 22 研究的目的意义 . 22 研究的研究方案 . 23 第二章 植物表达载体的构建 . 24 料与方法 . 24 验材料 . 24 法 . 25 果与分析 . 29 草 动子根部特异性顺式元件的获得 . 29 础质粒的酶切图谱及鉴定 . 34 质粒载体的构建及其鉴定 . 35 结 . 40 第三章 拟南芥转化及 因表达分析 . 41 料与方法 . 41 料 . 41 法 . 41 果与分析 . 43 南芥转化 . 43 性转基因植株的 定 . 43 基因拟南芥中 达分析 . 44 结 . 47 第四章 利用 动子驱动 因在棉花中的表达分析 . 48 料与方法 . 48 料 . 48 法 . 49 果与分析 . 54 粉管通道法转化棉花 . 54 基因后代筛选 . 54 性植株的 测 . 54 因表达量的荧光定量 析 . 55 涝对转 因棉花相关性状的影响 . 57 结 . 60 第五章 结论 、创新点及讨论 . 61 论 . 61 新点 . 61 论 . 61 物基因工程研究中启动子的选用和改造 . 62 光定量 术检测基因的表达量 . 62 参考文献 . 63 致谢 . 74 作者简历 . 74 V 缩略词表 35S P 5S 椰菜病毒 35S 启动子 苄青霉素抗性 那霉素抗性 硫酸链霉素 鱼碱合成酶基因终止子 I 霉素磷酸转移酶基因 光值 合酶链式反应 乙二醇 二烷基磺酸钠 时荧光定量 色荧光蛋白 明颤菌血红蛋白 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 外源基因在植物中表达调控的研究是植物基因工程的重要内容。启动子在基因表达调控中起着关键性的作用，它在很大程度上决定着目的基因 表达的时间、空间和强度。目前大规模商业化的双子叶植物基因工程产品中广泛应用的启动子是 启动子，它驱动外源基因在植物的各种组织 和所有发育阶段都会表达 (et 1985； et 1990； et 1990；et 1990； et 1994； et 2002)。 这无疑增加了植株的代谢负担，并造成物质和能量上的巨大浪费 ，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。 因此，用特异性启动子 取代组成型启动子，使外源基因能够定时、定点、定量地在植物中表达，成为植物基因工程研究的重要内容，并且取得了可喜的进展。 高等植物细胞分化的本质在于不同基因差异表达的结果，多数发育调节基因的表达都具有时间性和空间性。时间性指的是特定基因的表达是不连续的，短暂的；空间性则是指特定基因具有在生物体内特定部位表达，即组织特异性表达的特性。采用分子生物学手段对农作物进行遗传改良的过程中，常常希望限制外源基因只在特定的组织中表达，从而使植物在获得目标性状的同时，其它性状基本不受影响或影响很小，这就需要通过有效的组织特异 性启动子对靶基因的表达进行调控。植物基因工程研究的重要内容之一就是用特异性启动子取代组成型启动子，使外源基因能够定时、定点、定量的在植物中表达，这样既可以满足植物分子育种的需要，又可以减少植株代谢负担，避免物质和能量的巨大浪费。 高等植物的根不仅是植物体进行营养物质和水分吸收、运输、储存与合成的重要器官，而且是抵抗病虫害和在特殊生态环境中得以生存所不可缺少的组成部分，在高等植物的整个生命过程中行使着十分重要的生理功能。 本论文的主要研究内容是分离根部特异性表达顺式用元件，并驱动 因在拟南芥和 棉花中表达，为外源基因在植物根部，尤其是棉花根组织中高效表达提供有力的调控元件和分子工具，以利借助基因工程的方法，增强植株对水分，肥料及微量元素的吸收、有效抵抗病虫害以及在特殊生态环境下生存。下面对相关研究领域的国内外研究现状分别进行简要综述。 对于高等植物具有重要的生理意义 根是植物体重要的营养器官，除少数气生根外，绝大部分植物的根生长在地下，他们以其各级分枝形成庞大的根系，合理地分布在土壤的四周和深处。在植物的生命活动中，根担负着许多重要的生理功能，对地上器官起着许多不可替代的作用。 的主要生理功能 收、输导、合成与贮藏功能 吸收作用是根的主要生理功能，它是指根对土壤中的水分以及溶解在其中的离子状态的矿质元素、少量含碳有机物、可溶性氨基酸和有机磷，以及溶于水中的 物质的吸收。根系吸水的主要部位在根尖。依据根尖细胞的结构特点，可以把根尖分为根冠、分生区、伸长区和中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 根毛区，吸收水分最活跃的部位是在根毛区。根所吸收的物质可通过根中的输导组织运往地上部分，又可接受地上部分所合成的营养物质，以供根的生长和种种生理活动所需，其中一部分还可贮藏在根部的薄壁组织内。 另外 ，根有很强的合成功能，它直接参与植物体内有机物的合成。根所合成的有机物对地上部分的生长发育会产生重大影响，主要表现为通过促进或抑制根系活动，调节和控制地上部分的生长和发育。如根吸收的无机盐并不是不加变化地运输到地上器官，而是有相当一部分先在根内初步转化，转变为有机物再向上运输。如根所吸收的 30%50%在根内转变为有机态氮，如氨基、酰胺、多肽或生物碱等。根也是合成植物激素的重要场所之一，如细胞分裂素是在根尖合成，生长素、脱落酸、赤毒素、乙烯等都可以在根中形成。当病菌等异物入侵植株时，根亦 和其他器官一样，能合成被成为“植物保卫素”的一类物质，起一定的防御或减灾的作用。 着与支持功能 植物的地上部分能够稳固地直立于地面，主要是由于根在土壤中的固着和支持作用。根有主根、侧根、不定根之分，这些根又有各级分枝，形成庞大的根系，在土壤中广泛分布。其分布范围及深度与地上部分相应，再加上根内牢固的机械组织和维管组织的共同作用，足以支持即使是十分高大的、分枝繁多的茎叶系统，并把它牢牢固着在常有风吹雨袭的陆生环境中。 泌功能 根有比较强的分泌作用，能分泌多种物质，主要有糖、氨基 酸、有机酸、糖苷、维生素、植物生长物质、酶等，还能分泌一些矿质盐类。这些分泌物有的可以减少根在生长过程中与土壤的摩擦力，有的使根形成促吸收的表面，有的对他种生物是生长刺激物或毒素。如寄生植物列当，其种子要在寄主根的分泌物的刺激下才能萌发，而苦苣菜属（ 顶羽菊属（ 一些杂草的根能释放生长抑制物质，使周围的植物死亡 就是所谓异株克生现象（ 有的根分泌物可抗病害，如发现抗根腐病的棉根分泌物中有抑制该病菌生长的水氰酸，不抗病的品种则无。还有的根分泌物 能促进土壤中一些微生物的生长，它们在根际和根表面形成一个特殊的微生物区系（某一特定地区植物种类的总体称为区系），这些微生物对植株的代谢、吸收、抗病性等方面起作用。 根的分泌作用可改善土壤的营养条件，如根分泌的 有机酸能使土壤中的一些难溶态矿物质溶解，以利于根系吸收；根所分泌的酶能催化土壤中复杂的有机物，使之转化为简单的无机物供植物利用。根的分泌功能在植物与植物、植物与微生物之间的关系中起重要作用。例如，根所分泌的糖、氨基酸和有机酸等是微生物的重要营养和能量来源，反之，土壤微生物的良好活动又对植物生长的 环境和条件产生多方面的影响。另外，根的分泌作用对其它植物也产生一定的影响，如某种植物根所分泌的物质对另一种植物的生长起抑制作用或促进作用等，所以在农业生产上采用连作、轮作、间作或套种时，要考虑根的分泌作用。 良高等植物根的性状具有重要意义 自然环境复杂多变，逆境胁迫以及病虫害侵害等是危害植物生长发育的主要因素。对于农作物来说，增强其抵御逆境胁迫和病虫害的能力、改善其吸收功能等能达到灾年少减产甚至不减产中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 的目的，具有十分重要的生产价值。同时，提高农作物对自然环境特别是土壤条件的适应性，也能够扩大作物 的种植范围，有效利用土地资源，对于我国这样一个人均耕地面积缺乏的国家来说也具有十分重要的社会价值。 根除了行使上节所述的生理功能外，更是植物体抵御旱涝盐碱、土传病虫害等不良因素首当其冲的植物器官。因此为植物的根组织定向的引入有益的目的性状，增强其生理功能和抵御逆境胁迫和病虫害的能力，具有十分重要的意义。 强根的抗涝性 作物受涝而萎蔫并不是因为水的问题，而是因为土壤通气不足， 量增加而溶氧量减少，这样短期内使细胞呼吸作用减弱，继而阻碍吸水；时间较长就形成无氧呼吸，产生和积累较多的酒精，根 系中毒受伤，吸水更少，因此作物受涝反而表现出缺水现象。如果能使高效的氧结合基因、分解酒精和转化 基因或是适应低氧条件的水通道蛋白基因在目标作物中表达，就能有效增强作物的抗涝性，减少受涝对作物产量性状和品质性状的影响，特别是对于不耐涝作物，如棉花、高梁等，具有重要的生产价值。 强根抵抗水分胁迫的能力 植物生长极易受环境非生物因子胁迫。其中陆生植物遭受脱水或水分胁迫主要来自于干旱、高盐和低温。植物只有对环境胁迫响应并适应这些环境胁迫才得以生存。水分胁迫诱导植物体内发生各种生理生化反应，使植 物细胞生理脱水，导致植株生长停止、光合作用受抑、呼吸紊乱、整个代谢异常，最后植物表现出受害症状。 根部有吸水的能力，而土壤也有保水的本领。植物只能利用土壤中的可利用水分 自由水，实际上植物是在和土壤争夺水分。干旱条件下，可利用水分就更少了。水分的吸收和运输是从高水势到低水势，根系从土壤中吸水，根部细胞的水势必须低于土壤溶液的水势。高盐条件下，土壤溶液中盐分浓度高，水势低于作物根部细胞，作物吸水困难，甚至失水萎蔫。 此外，大量的研究表明，干旱、低温等水分胁迫与其他逆境如高温、盐渍、高光强、 一样能引起植物体内活性氧的积累，导致膜脂过氧化和蛋白质、核酸等分子的破坏， 生物膜受损。活性氧迸发 (植物对生物或非生物胁迫响应的一个内在特征。累积的活性氧造成质膜损伤和膜透性增加是植物干旱伤害的本质之一。因此，植物抗旱性与植物抗氧化能力密切相关，特别是与那些维持膜完整的脱毒酶和抗氧化物相关。 通过植物基因工程手段向根部定向导入 渗透调节物质合成酶基因，如脯氨酸合成酶基因、使植物在水分胁迫下能合成更多的代谢产物 ，有利于提高植物的渗透调节能力，从而增强植物的抗旱性。还可以 通过导入解毒酶和氧化胁迫相关的酶基因，使植物在渗透胁迫下过量表达一些酶 (如 ，以有效地排除活性氧自由基，保护和稳定蛋白复合体和膜结构，从而提高细胞耐脱水的能力。 强抵抗土传病害及地下害虫的能力 病害是影响植物生长，导致农作物减产的主要原因之一。以棉花为例，危害棉花长势和产量的病害以土传病害为主，如表 1示。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 表 1花主要病害的传播途径及病症 of 害 病原 侵染与传播途径 症状 立枯病 立估枯丝核菌 丝融合群 丝体和菌核在土壤中或病残体上越冬，直接侵染棉籽、幼苗，种子带菌，成为翌年初侵染源。 烂种、烂芽 ， 不能正常出土 。 接近土表的根茎部显黄褐色斑点 ， 呈长条状褐色凹陷 ， 向幼茎四周扩展 ，缢缩成蜂腰状 ， 子叶萎垂 ， 幼苗倒伏枯死 。 韧皮部腐烂呈深褐色纤维状等症状。 角斑病 棉角斑单胞杆菌 籽带菌 ， 病菌科长时间存活在不易腐烂的病残组织中 棉株在整个生育期中 ， 地上部分所有器官均可受害 ， 以叶部受害为重 。 受害后引起蕾铃脱落 ， 严重时导致棉株死亡 。 黄萎病 大丽花轮支孢 病菌从根系经表皮或根部伤口进入棉株 。 苗期很少发病 ， 在棉株生长中后期 ， 受害棉株叶片变黄 ， 干枯脱落 ，结铃少 ， 脱落率高。 枯萎病 尖孢镰刀菌专化型 害棉花维管束 ， 属土传病害 。 菌丝从棉株根系的根毛或伤口入侵 ， 进入植物导管并扩散到棉株各部位 株型矮化 ， 直到枯死 。 木质部呈黑褐色条文 。 感病棉株从苗期开始出现症状 ， 至现蕾盛期为发病高峰 ，呈现半边枯死 ， 节间缩短 ， 植株矮小 ， 茎杆拐曲不直 。 叶深绿皱缩 ，增厚变脆等症状。 在众多的病害中，尤以黄萎病危害严重。由于缺乏高抗黄萎病的陆地棉品种资源，且对黄萎病菌的致病机理及棉花抗黄萎病遗传方式的了解较少，至今国内外在棉花黄萎病的预防和抗病育种方面都没有取得显著进展。目前已经通过基因工程的手段将一些广谱抗菌和抗真菌 蛋白（如几丁质酶、 3葡萄糖氧化酶等）基因转入棉花。但绝大多数获得的基因工程抗性品种资源使用的是组成型启动子（ 动子 ）。组成型启动子具有持续性，不表现时空性，驱动基因在生物体的所有组织中表达，造成物质和能量的浪费，而且对于某些抗病基因，如系统获得性抗性相关基因，如果使其在农作物的整个生育期和各个器官高效表达，产生强烈的超敏反应导致死亡，这样就失去了抗病的意义。如果能使抗病基因在植物根部高效特异的表达，使根部具有持续高效的抗病能力，就能从源头阻断土传病害的传播和对植物的危害。因 此，根部高效表达的特异性启动子将为增强植物根部的抗土传病害的能力提供了有力的分子元件。 地下害虫也叫土壤害虫，是指生活在土壤中，并以作物地下部分 (包括播下的种子 )为主或作物近地面部分为食的害虫，它是我国农作物上的主要害虫，水田、早地、丘陵、山坡地、林地、中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 5 果园、草原等均有发生。从春季到秋季，从播种到收获，咬食植（作）物的幼苗、根、茎、种子及块根、块茎等。苗期受害，造成缺苗断垄；生长期受害，破坏根系组织，使植株变黄，降低产量，影响品质。同时地下害虫为害造成的伤口常引起病原菌的侵染，使农作物遭受更大的损失。目前以 化学防治为主导，使用的基本都是高毒、高残留的乳剂、可湿性粉剂和颗粒剂等，用量大，利用率低、毒性大、污染环境。设想使抗虫相关基因在根部持续高效表达并分泌到土壤中，在根系周围土壤中形成抗虫的微环境，能够在植物整个生长过程有效防治地下害虫且对环境无污染。 在增强营养物质及矿物元素的吸收、合成和运输中的生理作用 根是高等植物最重要的吸收器官，植物生长所需的各种营养成分、矿物质、无机盐、微量元素等绝大多数来自于根的吸收并转化成植物可利用成分在运输到植物体的各个器官和组织。根的吸收能力的强弱直接影响到整 株植物的营养供给和其他器官和组织的生理机能。特异性的改善植物根部的吸收和运输能力不仅能够有效的维持地上部分的生理功能，加快植株的代谢和物质合成速率，促进植物的生长发育，而且能够使植物在贫养条件下充分吸收和利用有限的营养物质，在生产上具有十分重要的意义。 于增强植物对土壤条件的适应性和改善土壤环境的作用 目前我国重金属污染土壤的面积在逐渐扩大，程度不断加深。通过基因工程手段向植物根部定向转入从超积累植物中获得的金属硫蛋白 (植物鳌合肽 ( 金属转运蛋白等相关基因，能够提高根部以及整 株植物对于高金属含量土壤的抗性。同时能够达到一定的去除污染和修复生态的作用。另外向根部导入特异性根分泌物相关基因，为植物基因型的遗传改良、矿质营养育种以及基因工程的应用提供了有效途径。 动子研究进展 述 在细胞生长和分化过程中，遗传信息的表达（由 录为 译为蛋白质的过程）是严格地按照一定的时间顺序和空间发生变化的，同时也表现出在细胞内外环境的影响下进行着调整的过程。遗传信息的表达调控表现在各个不同阶段和水平，有转录水平的调控、转录前后水平的调控、转译水平的 调控和蛋白质活性调节水平调控等。通过研究表明，真核细胞基因表达的调节，一方面受控于基因调控的顺式作用元件（ 另一方面同时受到一系列反式作用因子（ 调控，即具调控作用的蛋白质因子。作用于真核细胞基因表达的顺式作用元件由启动子（ 节序列（ NA 成。生物体内基因的表达，受到生物体内外各种理化因素的调节控制，使生物能够根据需要及环境的变化，定量、定时及定位地表达所 需的基因产物。植物细胞基因总数约为 4个，但在一定的发育阶段、在某一类型细胞当中，则只有 15%左右的基因得以表达，产生约 6000不同的 子。具体而言，生物体在基因表达的转录、转录后加工、翻译、翻译后加工、运输及定位等各个环节都进行精细的调控，在这一系列过程中，涉及到启动子、终止子、 列等调控元件，其中，启动子的作用尤为重要，因此，对启动子进行深入的了解，有助于更好地中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 6 控制外源基因在转基因植物中的表达。 动子的一般结构 启动子是指基因中一段可与 合酶及其其它一 些影响转录的反式作用因子结合而准确有效的起始转录的 列。它是基因准确和有效地进行转录所必需的结构。整个启动子由核心启动子和上游元件两个部分组成。当 合酶定位并结合在启动子上即可启动转录过程，因此启动子是基因表达调控的重要顺式作用元件，它与 合酶以及其他蛋白辅助因子等反式元件的相互作用是启动子调控模式的实质。启动子分三类：启动子 I、启动子 动子 有启动子 导 转录。真核生物的启动子 两大部分组成：核心启动子元件（ 上游 启动子元件（ 心启动子元件 ( 核心启动子是在基因转录起始位点（ +1）及其 5上游近端大约 100 200内的一组具有独立功能的 列，每个元件长度约为 7 20决定 合酶 录起始点和转录频率的关键元件。核心启动子单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录。真核生物基因启动子的典型核心结构（ 约在转录起点 50 之间，具有结合并 控制转录起始前复合物的装配、定位转录起始位点并控制转录的方向、对细胞内临近或远处的激活子或抑制子做出响应的功能（ 2001），由 合酶 导转录的基因核心启动子大多包含一个 和（或）起始子（ 转录起始子 有些第二类启动子在转录启始位点附近存在保守序列，这些位点提供最佳的转录起始，它们被称为起始子（ 并且具有一致的保守序列，即 表嘧啶（ C 或 T），N 代表任何一个碱基，并且加下划线的 A（腺嘌吟）是转录起始位点（ et 2000； et 1999； et 1998）。起始子与转录起始位点相重叠，其功能与 相似，能指导转录起始前复合物的装配、决定转录起始位点并调节上游激活蛋白的活性。高等植物基因的转录起始位点通常位于翻译起始密码子（ 游 。大多数情况下（ 90%）转录起始位点周围为嘌呤残基， 分析了 61 种植物的翻译起始密码的序列后指出，植物 为 录起始位点发生变化或缺失就会影响转录，但也有 学者认为该位点不足以成为转录的必须信号（ ， 1995）。 是第二类启动子中最为典型的组件，保守序列为 常第五或第六个碱基由 T 代替 A。它约在基因转录起始点上游约 50，基本上由 基对组成，是决定基因转录起始的关键（ et 1981； et 2004），为 合酶的结合处之一，启动子的活性取决于转录因子和 合酶组装起来的前转录起始复合物。它在转录起始位点处组装并启动转录过程。在第二类启动 子中， 作为接合蛋白因子组装的起始位点。第一个与其接合的蛋白因子是 接合蛋白（ et 2004），随后它在吸引接合中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 7 其它蛋白因子，直到组装成前转录起始复合物，起始转录（ et 1997）。 是绝大多数植物启动子正确启动转录所必需的（ P， 1987；李一醌等， 1998），不含 的基因的精确转录受起始因子（ 导。 件并无一个十分严格的同源顺序，其中最为关键的核昔酸是 +1 的 A 和 +3 的 T。 如果 5 N 为任意核苷酸）的两侧 +4 到 +5 和 嘧啶，则成为强的 功能上与 类似，常常通过与 能介导上游至少一部分激活因子的调控作用，与 件与转录起点重叠。 游元件（ 较为重要的上游元件有两种：一种是一般上游元件，如 和 ，