【毕业学位论文】（Word原稿）里氏木霉RUT-C30甘露聚糖酶基因man1在毕赤酵母中的高效表达-动物营养与饲料科学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 里氏木霉 露聚糖酶基因 毕赤酵母中的高效表达 摘 要 甘露聚糖类物质是自然界中半纤维素的第二大组分 , 分布广泛。 甘露聚糖酶能水解底物生成甘露寡糖，释放出与之结合的水分、微量元素等。应用于猪、鸡、鸭和水产动物日粮，可提高饲料的利用效率，减少养殖业环境污染。甘露寡糖具有改善动物胃肠道微生态环境的功能。多种细菌、真菌、软体动物等分泌 甘露聚糖酶，其基因属于糖 基水解酶家族5。 甘露聚糖酶在工农业生产和环境保护等方面有着广泛的用途。因此本研究的主要目的就是构建甘露聚糖酶的工程酵母来高效表达甘露聚糖酶，以解决目前甘露聚糖酶产量低、成本高等问题，同时也为生产甘露寡糖提供有效的解决途径。 本文利用嗜甲醇毕赤酵母（ 达甘露聚糖酶（ 首先将 隆到毕赤酵母穿梭表达载体 ，构建重组质粒 性化酶切， 其整合到毕赤酵母 ）染色体上，利用 板筛选 阳性克隆，在含不同浓度 板筛选高拷贝转化子。共筛选 28 株阳性克隆，将筛选到 1 株高拷贝菌株进行 5L 发酵罐优化表达研究，经测定蛋白分泌量达 表达产物经 泳分析，重组目标蛋白质量分数达到总蛋白的 90%以上；相对分子质量为 66理论设计值大，分析是因目标蛋白发生糖基化所致。该重组转化子传稳定性良好。甘露聚糖酶活性测定结果为 250IU/槐豆胶为底物）和 470 芋为底物）。通过酶学性质研究该酶反应 最适 适温度为 60。根据 泳和酶的功能分析，证明目的蛋白已在 成功实现表达， 并且酶的表达量高于国内外文献的相关报道。 关键词：里氏木霉 ; 甘露聚糖酶 ; 毕赤酵母 of of in of in to of is an to of is to of in to an to as we in In to by by . it M D 28 4 by 418( in a 5L of of 6KD of 0% of by by of 50IU/mL as 70 IU/mL as of of it .5 0 . to is in is 目 录 第一章 文献综述 . 1 1 甘露聚糖酶的研究进展 . 1 露聚糖酶作用方式及自然界的来源 . 1 . 3 甘露聚糖酶研究的历史和菌种选育 . 3 . 4 露聚糖酶的应用 . 6 2 巴斯德毕赤酵母表达系统 . 9 赤酵母表达宿主菌 . 9 赤酵母表达载体 . 10 白在毕赤酵母中的表达 . 10 白在毕赤酵母中的优化表达 . 11 3 研究内容和技术路线 . 12 4 本研究的目的和意义 . 13 第二章 实验 . 15 1 材料 . 15 株和质粒 . 15 具酶 . 15 剂 . 15 养基和部分溶液的配制 . 15 要仪器 . 17 2 方法 . 18 露聚糖酶基因的克隆 . 18 段与 T 载体的连接 . 21 受态细胞制备及转化方法 . 21 选重组子 . 21 粒 大量提取 . 22 组载体 构建 . 23 转化毕赤酵母 . 24 组酵母的验证 . 26 达产物的检测 . 26 组酵母的高细胞密度发酵 . 27 组菌的稳定性检测 . 28 达甘露聚糖酶的酶学性质研究 . 29 达的甘露聚糖酶蛋白浓度测定 . 29 解产物的离子色谱（ 析 . 29 3 结果 . 31 氏木霉 因全编码序列的克隆 . 31 组表达载体的构建和验证 . 32 组毕赤 酵母的筛选和鉴定 . 34 组酵母在 5L 发酵罐中的细胞高密度发酵 . 35 组 . 37 组甘露聚糖酶降解终产物分析 . 39 第三章 讨论 . 41 结论 . 43 参考文献 . 44 致谢 . 51 作者简历 . 52 缩略表 缩写 英文 中文 基对 六烷基三甲基溴化铵 d ， 天 二胺四乙酸 g h 时 D- 丙基 D硫代半乳糖苷 道尔顿 钟 克酰胺腺嘌呤二核苷酸 放阅读框 丙烯酰胺凝胶电泳 碱度 硝基苯酚 酸对硝基苯酯 分钟转数 s 二烷基磺酸钠 溴 4氯 3吲哚 D半 糖苷 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 生物技术的迅速发展，为饲料朝着高效、无公害、无残留的方向发展提供了可能。绿色饲料添加剂进入饲料行业，在控制禽畜疾病、改善饲料品质、提高家畜生产力、保护生态环境等方面正发挥着越来越大的作用。其中饲用酶制剂和寡糖是生物技术在饲料工业中应用最广和最有前景的一个方面。酶本身是蛋白质，同时作为一种高效的生物催化剂，在饲料工业中应用的酶是安全无毒的绿色产品。 C 一种半纤维 素水解酶，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及 et 2000； et 1993)，这些底物是植物性饲料原料中除纤维素、木聚糖之外，分布最广泛、含量最高的一类半纤维素，并且这些物质在一些植物（如魔芋、椰子、槐豆胶等）中有如淀粉样的大量积累。甘露聚糖也是豆科植物种子和酵母细胞壁的主要成分 (陈小兵等 ,2005)。由于畜禽和鱼类的消化酶系中不含甘露聚糖酶，因此，对这类原料中含有的甘露聚糖物质的转化利用需要添加外源的 且这些原料经甘露 聚糖酶处理后，可以得到高品质的甘露寡糖产品。 1 甘露聚糖酶的研究进展 露聚糖酶作用方式及自然界的来源 ,4 1水解产物是不同种类的甘露寡糖。不同来源的 主要与底物的物理状态、 量、酯酰化的程度有关 (龙健儿等 ,1998)。 图 1半乳甘露聚糖的结构 1of 国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 甘露聚糖酶广泛存在于自然界中，在植物、细菌、真菌、放线菌以及一些低等动物的肠道分泌液中都含有甘露聚糖酶，而且不同来源的甘露聚糖酶其酶学性质也有很大的差异（表1 表 1同来源的甘露聚糖酶及其特性 株 来 源 分子量(等电点适 适温度( ) 参考 文献 细菌 5 0 5065 a et 2004 068 65 2 et 1997 9 0 450 et 1995 113 - 5 3524 et 2000 7 0 15 马建华等 ,1999 李文玉等 ,2000 35 0 62 - 455 60 et 1990 8 5 - et 1994 K 27 26 0 - 杨文博等 ,1995 6 - - - et 1995 2 60 - et 1972 0 5 557 et ,2002 菌 38 - 0 u et 2003 0 5 - 田亚平等 .,1998 - - - et 1984 5 - ,1990 6 5 - et 1993 植物 - 紫花苜蓿种子 41 - 40 - ,1988 瓜胶种子 4 5 40 - ,1988 动物 42 - - et 1996 注 ：“ _” 表示无资料 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 一般来说 ， 细菌中的 子量在 22间。但对大部分细菌产甘露聚糖酶而言，分子量多集中在 35 间，等电点（ 适反应温度 50 最适反应 嗜碱性芽孢杆菌的最适 菌来源的 5 电点为（ 适反应温度 55 最适反应 对于细菌而言，真菌来源的 适反应 偏低，耐热性也比较差。同时一些研究表明：许多真菌的 在细菌及植物的 襟，1997）。 自身也含有多种分子性。由于它们之间的理化性质比较相近，因此酶的纯化有一定的难度。目前 析、有机溶剂沉淀、离子交换、亲和层析等 (et 1996)。到目前为止，许多来源的 中枯草芽孢杆菌、黑曲霉 (et 1991)和里氏木霉（ et 1995）的 酶活性的测定对确定 酶的活性水平，特异性及分类有重要影响。到目前为止，测定 粘法、刚果红染色法、查马雷亮蓝染色法等。其中还原糖测定法由于操作简单、重复性好、反应时间短而得到普遍的使用。相比其它的方法，还原糖测定法的专一性比较差，因此在确定 薄板层析法、纸层析法进行水解产物的鉴定。现在测定 豆胶、魔芋粉等 (沈庆等 ,1995)。而初步筛选产甘露聚糖酶菌株一般采用刚果红染色法，可以通过多聚糖结合的染料 菌落周围产生透明环的方法直接地看见微生物产酶的情况（ et 1994）。 1958年， 甘露聚糖酶的真菌。 1960年， 甘露聚糖酶。 1965 年， 出了 以后的研究打下基础。七十年代后，许多产 变，并进行了培养基成分特别是碳源对酶产生影响的研究，进行了多糖结构的分 析。同时，许多中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 不同来源的 酶基本性质的研究也取得了较大发展。 国内自八十年代开展微生物甘露聚糖酶发酵生产技术研究，进展很快。 1980 年我国李欣等首次系统研究甘露聚糖的化学组成。 1985 年以后，随着 菌种筛选和诱导育种等相关研究竞争也显著加剧。如杨文博等研究了产 1995)。崔福绵等研究了枯草芽孢杆菌中性 育菌种的酶产量达到 120U/999)。我国另一项有特色的 工作是分泌 中国科学院微生物研究所较早提出了利用极端微生物菌种分泌的碱性 用嗜碱芽孢杆菌 酵生产 酵液的酶活力达到 500U/露寡糖提取收率在 80%以上 (马延和等， 1991）。 进入九十年代以来，随着基因工程和蛋白质工程技术的广泛应用， 组表达和酶活性工程的研究上，并取得了很大发展。 剂使用大多随饲料添加，在畜禽消化道内发挥作用，必须适应畜禽的消化道环境才能得到高效利用。因此，有必要通过基因工程等手段选育所产酶的最佳表达条件与畜禽消化道环境相一致的饲用 0 年代后期，现在 因库中已列入近百种不同来源的 1 这些基因经过序列分析 , 大多只有一个开放阅读框 (在该阅读框前有与 16核生物成熟肽的序列前还有比较明显的信号肽序列及加工位点。而且 除了荧光假单胞菌产生的 et 1995)，其它 时具有纤维素结合域 (因此属于纤维素 于植物纤维素与半纤维素总是相伴存在， 有利于破坏植物聚糖的晶体结构，促进水解 (967)。 到目前为止，不同来源的 大肠杆菌表达系 统中表达的 于 表达 产量低， 蛋白易形成包涵体，使后续的纯化过程复杂，产业化 生产 困难 大，因此也有 利用 其他 表达系统来 表达。如利用毕赤酵母表达系统表达的 基因是来源于一种海洋软体 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5 表 1年来克隆到的部分甘露聚糖酶基因 of 株来源 基因名称 参考文献 96 雅楠等 , 2005 et 2005 et 2000 et 2005 et 2004 E2 et 2003 et 2003 et 2001 et 2004 et 1999 et 1993 et 2000 6 a et ,2004 表 1用基因工程技术表达不同来源的 of to 因来源 表达 载体 宿主菌 酶活力（ u/ 最适 适温 度 参考文献 细菌 - - et 1991 - et 1995 - - et 1999 10 - , et 005 5 谭秀华等 .,2005 真菌 - et 1995 - 文静等 ,2003 - et 2001 - et 2001 0 Xu et 2002 注 ：“ _” 表示无资料 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 6 动物 （ 在 14 升的发酵罐中表达量达到 900， 酶的比活力为 u et 2002)。总体来说，酶的表达量较低，达不到工业生产的要求。表 1列出了国内外通过基因工程手段表达 露聚糖酶的应用 露聚糖酶在饲料中的应用 甘露聚糖类物质作为半纤维素的第二大组分，广泛分布于自然界中。它 是所有豆科植物细胞壁的 主要 组成成分 ，在其他植物性饲料原料中含量也很高，如豆粕、小麦、菜籽粕、麸皮中半乳甘露聚糖占非淀粉多糖的比例很高（表 1，同时在一些植物胶、椰子、莴苣、合欢、魔芋以及针叶树中也 都含有丰富的甘露聚糖和异甘露聚糖 (987)。这使得 表 1用饲料原料中半乳甘露聚糖占非淀粉多糖的含量 of of 料原料 甘露聚糖占非淀粉多糖含量 ,% 饲料原料 甘露聚糖占非淀粉多糖含量 ,% 小麦 菜籽 粕 皮 燕麦 米 高粱 箐 大豆粕 于畜禽和鱼类的消化酶系不含甘露聚糖酶，因此 甘露聚糖 类物质 是一种 主要的 抗营养因子 。微生物来源的 解 4 糖苷键降解甘露聚糖，产物为甘露寡糖和甘露糖。已广泛证实 括： (1) 促进动物生长 ,提高动物的饲料转化效率：饲喂 %,饲料转化率 提高肉猪增重 饲料转化率 (et 1998;et 2002)。同时， 报道在火鸡日粮中添加 80的甘露聚糖酶，可以提高火鸡的日增重和饲料的转化效率，过多或过 少的甘露聚糖酶的添加量将起不到明显的效果 (1999)； (2) 甘露聚糖酶可以促进营养成分消化，改善动物肠道微生物生态 ,改善动物体的健康状况(et 1998; et 1999)。 在玉米 /豆粕日粮中添加 露聚中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 7 糖酶可使肉鸡盲肠沙门氏菌数量比对照减少 12%(1998)； (3) 降低肠道内容物的粘稠度，减少粪便排泄，减轻环境污染 (et 1996)； (4) 甘露聚糖吸附微量元素，抑制其消化吸收，添加甘露聚糖酶可 提高微量元素的生物利用率 (杨锦健等 ,1993; 汪儆 等 , 2001 )； (5) 酶降解产物甘露寡糖可促进动物肠道有益菌的生长； (6) 酶及降解产物甘露寡糖可正向刺激机体免疫活性； (7) 寡糖还能够吸附真菌毒素，减少抗生素等化学药物的使用 ,是生产绿色动物食品的添加剂。 我国猪鸡的主要日粮是玉米 /豆粕型日粮，其最主要的抗消化粘性多糖是甘露聚糖。玉米和豆粕中甘露聚糖占非淀粉多糖的比例分别为 大豆多糖可吸收自身重量七倍的水，并吸附多种微量元素，降低其生物利用率。 /豆粕型日粮非常有效的饲用酶制剂，它可以降解其含有的抗消化粘性多糖，促生长提高饲料利用效率的效果非常显著，而且生成的甘露寡糖在畜禽养殖中也起到十分重要的作用。 露寡糖在畜禽养殖中的应用 露寡糖在养禽业中的应用 甘露寡糖（ 养禽业的应用多见于肉仔鸡、雏鸡、和火鸡，可以提高日增重以及饲料的转化效率，提高家禽的免疫力，改变家禽肠道状态使之有利于养分吸收。另有研究指出，火鸡或肉仔鸡日粮中添加甘露寡糖可取得与添加抗生素相当的效果。 饲料中添加 减少盲肠、肝、脾的沙 门氏菌数 (et 1994)。在肉用仔鸡的育雏、生长及肥育阶段均添加甘露寡糖，达到上市体重所需要的时间减少一天，显著提高经济效益 (et 1994)。多个饲养试验的结果表明，鸡料中添加 活率平均提高 研究认为，甘露寡糖可显著地减少鸡肠道沙门氏菌的定植，提高肠黏膜的完整性，而对肠道 无影响 (et 2000)，所以推断可能是甘露寡糖通过吸附致病菌来阻止其与肠粘膜的结合。 露寡糖在仔猪生产中的应用 甘露寡糖可提高断奶仔猪的日增重和饲料的转化率。据报道，给幼龄仔猪日粮添加甘露寡糖，实验组的饲料转化率和日增重分别比对照组提高 5%和 7% (et 1998）。添加甘露寡糖能显著降低仔猪肠道大肠杆菌的数量，效应随添加量的加大而增强，同时腹泻率也呈中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 8 降低的趋势 (周红丽等 ,2002）。在基础日粮中添加 g/猪的腹泻频率降低了 54%，血液淋巴细胞数 (外周血液 量均较