【毕业学位论文】（Word原稿）日粮不饱和脂肪酸对乳脂共轭亚油酸（CLA）合成的影响及其机理-动物营养与饲料科学博士论文

密级 论文编号 博士学位论文 日粮不饱和脂肪酸 对 乳脂共轭亚油酸（ 成的 影响及其 机理 y in of F n 要 本研究在优化乳脂 要探讨了泌乳期和胎次、日粮亚油酸和亚麻酸水平、基础日粮结构及其与日粮亚油酸水平组合、鱼油及其与植物油组合对乳脂 试验结果表明：（ 1）采用高速离心或以高速离心结合有机溶剂（正己烷 /异丙醇）分离乳脂肪后进行酸碱（ 酯化，利用 100合程序升温，能够有效分离检测乳中常规脂肪酸及 4种主要 构体，对于乳 脂脂肪酸组成没有显著影响，同时提高了 奶样前处理的 效率。（ 2）在相同的饲料营养条件下，乳脂 牛个体间乳脂 倍左右。 乳脂 受胎次和泌乳日影响，同时与 产奶量、乳脂肪产量之间的相关性低。（ 3）通过豆油和亚麻油调控日粮亚油酸（ 亚麻酸（ 平，随着日粮亚油酸含量的增加，低亚油酸低亚麻酸组（ 高亚麻酸组（ 高亚油酸和亚麻酸组合组（ 和高亚油酸组（ 脂中 18:1（ 相比， g/100g、 g/10000g，而 4）在不添加脂肪的情况下，随着精料水平的提高， 307030705050535d（ p=,而对十二指肠处 日粮添加不饱和脂肪后，高精料高亚油酸组（ 低精料高亚油酸组（ 高精料低亚油酸组（ 低精料低亚油酸组（ 脂 在亚油酸采食量接近的情况下，通过日粮添加鱼油提高 著提高了乳脂 对奶牛乳腺组织 本研究的结果表明：（ 1）日粮 亚油酸、亚麻酸、 采食量对乳脂 合成以提供乳腺合成 需的底物（ 主，但亚油酸比亚麻酸能更有效的提高乳脂含量 ，而鱼油源性的长链不饱和脂肪酸主要通过调控其它脂肪酸的代谢而增加乳脂内源合成；（ 2）日粮提供总不饱和脂肪酸的含量是日粮精粗比例影响乳脂 成的前提条件，当日粮总不饱和脂肪酸含量 低于 2%，尤其是当日粮亚油酸和亚麻酸含量低的情况下，日粮结构对乳脂 成的调控程度有限；当日粮总不饱和脂肪酸含量超过 2%时，日粮结构 影响 牛奶 关键词 ：亚油酸 亚麻酸 鱼油 共轭亚油酸 乳腺 奶牛 on to ) in 2)3)to or 4)or on ( c9,LA of In a by or by et 1997) C a In 77 5on 5th of of c9,LA in to LA LA of In , in or VA c9,LA p= of in 00% 0% in VA c9,LA in in at in of c9,LA of A. VA LA 00g c9,LA .7 In , in a 4 x 4 to c9,of 30:7030:7050:505:35 VA d（ p=0:7030:7050:505:35VA p=in to of c9,LA of c9,LA p In ,to in a 2 x 2 to 60:40 0:60,C C) of K) as VA p 3 0 52 0 1 随着日粮亚油酸含量的增加， 增加。 00g，而 此表明，日粮亚油酸对乳脂 亚油酸调控乳脂 主。 言 1966）， 但乳脂 9（ 而内源生成 （ 1999； 2000； 2000） 。通过日粮途径是调控乳脂含量和组成的一条有效途径。一些研究发现，放牧奶牛（ et 1999）或者给奶牛饲喂富含亚油酸和亚麻酸类饲料（ et 1998; et 2000; 1998； et 2001; et 2002）时能增加乳脂 同时，增加反刍动物日粮 低 18:3 2001）而提高牛奶的营养学价值。 亚麻酸生物氢化过程不产生 997）。 单一饲喂植物油（豆油、花生油、菜籽油和亚麻油）或油籽时能够增加乳脂1998； 2000），表明富含亚油酸和亚麻酸的油脂能够影响乳脂组成和 这些研究中 在改变，因此不能确定 此，本研究的目的在于比较研究亚油酸和亚麻酸对于乳脂 中国农业科学院博士学位论文 第四章 日粮亚油酸和亚麻酸对乳脂 成的影响 验材料与方法 验 设计 采用完全随机试验设计。选取 40 头健康、泌乳中期（ 中国荷斯坦奶牛随机分为 4 组。试验共设 4 个处理，分别为高亚油酸组（ 高亚麻酸组（ 高亚油酸和亚麻酸组合组（ 低亚油酸和亚麻酸组（ 试验期 9 周，其中 13周为预试期， 49 周为试验期 。 验 日粮及 动物 饲养管理 奶牛日粮配合参照奶牛饲养标准（ 34奶牛采用 独饲喂，每日分别于 07:00、 13:00 和 19:00h 饲喂，饲喂 30挤奶，每周记录 2 次产奶量 。 表 4验日粮及组成 of 试验处理为： 4%豆油高亚油酸组（ 胡麻油高亚麻酸组（ 油和 亚麻油组高亚油酸和亚麻酸组合组（ 不添加植物油低亚油酸和亚麻酸组（ 2 含玉米蛋白粉、玉米胚芽饼和酵母培养物。 3 含 油和亚麻油，其中维生素和微量元素的最低含量分别为： 00 00 00 00 40 100 60 5 I 35 mg o 68 kg M.。 品采集 料样品的采集与处理 试验期间记录采食量，每周收集一次饲料和剩料，取 20%分别按试验组制成混合样后于 试验处理 1 g/100-g M 蓿干草 草 米青贮 米 粕 籽粕 籽粕 米蛋白粉 混料 养成分 干物质含量 % 乳净能 M)4 蛋白质 洗纤维 洗纤维 脂肪酸 P % 国农业科学院博士学位论文 第四章 日粮亚油酸和亚麻酸对乳脂 成的影响 20 保存；试验结束后，饲料及剩料样品于 65烘干 48h，计算初水份后，根据剩余料数量适当缩小样品，粉碎过 40 目筛，保存备用 。 奶样品采集 试验期每周记录两次产奶 量，收集一次奶样，每头牛按早中晚产量（ 30： 20： 30）取样后制成混合样（共 80,其中一份（加防腐剂 4保存备测乳常规成分；另一份在 保存以备测脂肪酸组分。 液样品采集 试验期第 9周，在晨饲后 4h，利用真空采血管（血清和血浆管）采集尾根动脉血液。血浆管在 3000g， 45清管室温静止 30C 冰箱过夜，然后在3000g， 45离后的血清和血浆分离后于 保存。 析方法 饲料及剩料样 ： 6432、灰分 （ 6438、水分 （ 6435采用国家标准方法测定。中性洗涤纤维测定采用 991)方法分析，分析过程中添加淀粉酶（ 20L,， 无水亚硫酸钠。 乳常规成分：蛋白、脂肪、乳糖、非脂固形物和总固形物的测定同第二章。 脂肪酸：饲料脂肪酸分析采用 1988）的方法。乳脂脂肪酸分析同第二章。 血液参数 ： 血清非酯化脂肪酸 （ 和 利 用酶法试剂盒分析(其它所有血液指标均送样至 309 医院检测，其中，血浆葡萄糖（葡萄糖试剂盒 ,中生北控生物科技股份有限公司 ,北京市海淀区中关村路 6 号）、胆固醇 (胆固醇试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司 ,北京市海淀区中关村路 6 号 )、三酰甘油（三酰甘油试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司 ,北京市海淀区中关村路 6 号）、磷脂 (磷脂试剂盒， 北京利德曼生化技术有限公司， 北京市朝阳区安外北苑 5 号院四区 )、低密度脂蛋白 (低密度脂蛋白试剂盒，上海复星长征医学科学有限公司，上海市翔殷路 920 号 4 号楼 7 层， 200433)利用美国贝克曼 长激素 (生长激素试剂盒 ,北京福瑞生物科技有限公司，北京市海淀区田村路 80 号， 100039)和胰岛素 (胰岛素试剂盒，北京福瑞生物科技有限公司，北京市海淀区田村路 80 号， 100039)采用非饱和放射免疫法测定 。 据分析和统计 产奶量和脂肪酸组分利用 件包 (有重复观测数据的混合模型统计，固定效应有试验处理、试验期（周）及二者之间的交互作用。泌乳天数（ 协变量，方差结构采用)，数据为最小二乘均数，显著性水平为 P 一些研究报道，日粮添加脂肪（油）后对产奶量的影响不大 (， 1998; 1998; 2000; 2002; ， 2004)。高粗料能够限制能量的采食量，尽管本研究中日粮粗料的水平高（ ，但奶牛日粮中添加植物油后，增加了饲料能量浓度，普遍提高了奶牛对饲料的利用效率（ p，因此能增加产奶量（ p高亚油酸组奶牛产奶量和乳脂肪产量最高。日粮添加植物油后对乳蛋白和乳糖含量没 有影响，但有降低乳脂肪酸含量的趋势，其中 8%。 尽管各处理组之间乳脂肪含量没有显著的差异，但与 相比，其它几组(平均为 均有降低的趋势。日粮饲喂高含量的游离油时容易引起乳脂肪降低 (et 1980)，已经证实，增加日粮 和 的含量能够通过瘤胃氢化而增加反式脂肪酸的含量，其中 18:1 已被证实能降低乳脂肪含量 (et 2000)。因此本研究中，其它几组比 18:2 和 含量有关，具体机制可能也与降低脂肪酸的从头合成的关键酶，如降低乳腺 2000)。 各处理组之间 总的饲料利用效率（ 似，乳脂肪产奶量、乳蛋白含量和产量、乳糖含量和总固形物没有显著差异。 2002) 报道，当奶牛日粮添加 375 g 富含亚油酸和亚麻酸的植物油后不影响乳蛋白的含量。但其它的一些研究报道，奶牛日粮 中添加油或者脂肪后能减低乳蛋白的含量 (Wu 1994; et 2000)。 （ 1992）研究表明，泌乳早期奶牛氮素容易处于负平衡状态，添加脂肪引起乳蛋白降低的情况多发生在泌乳早期，而泌乳中后期的奶牛更不容易发生。本研究中，所有奶牛处于泌乳中期，因此不容易出现氮素负平衡情况。本试验总体表明，通过单独添加豆油和亚麻油或者二者组合增加了日粮的能量浓度，但对干物质采食量、能量校正乳产量或乳成分均没有显著影响。另外本试验也发现，豆油和亚麻油添加组，奶牛的 泌乳性能几乎没有差别，因此表明植物油来源的亚油酸和亚麻酸可能对奶牛泌乳性能的影响具有相同的机制。 奶脂肪酸组成 从表 4以看出，增加日粮中 含量，除乳脂 的含量显著增加外( 表 4奶脂肪酸组成 of in or or in a, b, c 同行肩标字母表示显著性水平 * 表示 P 3)对奶牛乳脂 著影响。因此认为，日粮提供总不饱和脂肪酸的含量是日粮精粗比例影响乳脂 日粮总不饱和脂肪酸含量低，尤其是当日粮亚油酸和亚麻酸含量低的情况下，日粮结构对乳脂 言 日粮粗饲料水平影响进入反刍动物十二指肠不饱和脂肪酸的流量。饲料脂肪在瘤胃水解是游离不饱和脂肪酸氢化的先决条件（ 1972）。日粮脂肪在瘤胃水解生成游离脂肪酸后，大部分不饱和脂肪酸可用于瘤胃氢化（ 981）。日粮营养结构影响瘤胃氢化过程和氢化产物，与高粗料日粮相比 ，高精料日粮通常会降低氢化过程（ 1972； 1997），主要原因与高精料日粮导致瘤胃 1997）。因此改变日粮精粗比例可能影响瘤胃氢化速率，进而影响瘤胃氢化产物。 几年的研究发现乳脂 c9,1999）。 因此，本试验的目的主要在于探讨不同日粮精粗比和不同粗饲料来源条件下，对进入十二指肠处 其 量的影响，为进 一步从日粮途径调控乳脂 合成提供基础数据。 验材料与方法 验 设计 试验采用 44拉丁方设计，以粗饲料的来源和其在日粮中的比例为处理，配置 4种日粮。日粮中精料组成相同，第一种日粮以全羊草为粗饲料，其余三种日粮粗料组成相同，由羊草、苜蓿和全株青贮玉米构成。四种日粮精粗比为 30:70、 30:70、 50:50和 65:35，分别用 3070国农业科学院博士学位论文 第五章 日粮结构对十二指肠处 其前体物流量的影响 0705050535 验 日粮及 动物 饲养管理 试验动物选用 4头体重（ 48321乳日龄（ 1756d，头胎、健康且装有永久性瘤胃瘘管 (十二指肠瘘管的荷斯坦乳牛。日喂两次 （ 07:30和19:30）， 自由饮水。日挤奶两次（ 06:00和 18:00）。 以玉米、豆粕、麦麸、青贮、苜蓿干草及羊草为主要原料配制 4种不同精粗比 （依据 的日粮见表 5 表 5验日粮的组成及营养成分 of 目 粗比 1 to 070070050535粮组成 苜蓿草粉 草 米青贮 米 麦麸 豆粕 粉 酸氢钙 盐 混料 养成分 2 P， %a, % , % % % 自粗料的 % ： 13070精粗比为 30:70， 粗料仅由羊草 （ 组成 ； 3070粗比为 30:70，粗料由羊草、玉米青贮（ 苜蓿干草（ 成； 5050粗比为50:50，粗料由羊草、玉米青贮及苜蓿干草组成； 6535粗比为 65:35，粗料由羊草、玉米青贮及苜蓿干草组成 2 主要养分含量以 基础 , P、 实测值 , 计算值。 3 每公斤含有 70 万 12 万 210075060000005002I 842 品采集 料样品的采集与处理 每期试验第 1518集量为精料 400g，苜蓿干草 400g，羊草 400g，青贮饲料中国农业科学院博士学位论文 第五章 日粮结构对十二指肠处 其前体物流量的影响 贮料采样称重后及时在 65烘干测定初水份，所有样品在采样期末，混合均匀，四分法缩样，取约 500 40目筛，保存备用。 每期试验第 1619d 饲喂前半小时收集剩余料，准确称重记录，取 20%立即密封， 保存；四天采样完成后，混 合均匀， 65烘干，计算初水份后，根据剩余料数量适当缩小样品，粉碎，过 40 目筛，保存备用 。 胃液 样品采集 每期试验第 1567:30、 9:30、 11:30、 13:30、 15:30、 17:30及 19:3000层纱布过滤后取 20H， 存待测脂肪酸组成。 二指肠 样品采集 及处理 试验期第 1618d，每隔 680时间点如下： 正试期第 16d： 07:30 13:30 19:30 01:30 正试期第 17d： 09:30 15:30 21:30 03:30 正试期第 18d： 11:30 17:30 23:30 05:30 上述采样时间点组合后代表全天 24 食糜样品在 冻保存，采样结束后解冻，将每头牛不同时间点食糜混合在一起。取约700干，计算水分含量，粉碎并过 40目筛， 4保存备用，此样品代表十二指肠全食糜。 试验期每天早晚挤奶，称重测定产奶量，将牛奶搅拌均匀。将乳样采样器垂直缓慢插入奶桶，封闭采样器一端，提起采样器取样，每头牛每次采集乳样约为牛奶总量的 2%。分装后的牛奶样品立即 存备用。 析方法 饲料及剩料样： 6432水分（ 6435用国家标准方法测定。中性洗涤纤维测定采用 991)方法分析，分析过程中添加淀粉酶（ 20L,， 无水亚硫酸钠。 乳常规成分 ： 蛋白 （ 、脂肪 （ 、乳糖 （ 、非脂固形物 （ 和总固形物（ 利用 测定。 脂肪酸 ： 饲料及食糜脂肪酸分析采用 1988） 等方法 ； 乳脂脂肪酸分析方法同第二章。 指示剂中 品用硝酸 高氯酸湿式分解法处理后，用原子吸收分光光度计（ 西电子，北京，中国）测定 测器为乙炔 品经湿法消化后，加入 15 氯化铵，用蒸馏水定容到 100 用石墨炉法在原子吸收分光光度计（ 西电子，北京，中国）上测定 中国农业科学院博士学位论文 第五章 日粮结构对十二指肠处 其前体物流量的影响 数据分析和统计 统计学检验利用 件 行 4 4拉丁方试验方差分析 ,统计模型为 : 、 P、 验期效应和日粮效应， 为总体均数， 果用最小二乘均数表示，多重比较采用 著水平为 但日粮添加植物油能够降低乳脂率约 16%（ 但添加植物油后显著降低了中短链脂肪酸的含量 (但日粮粗料水平及粗料水平和植物油组合影响奶牛日粮干物质的采食量（ 但随着 日粮 平的增加（四组日粮 ，产奶量有降低趋势，分别为 d、d、 d 和 d。该结果与日粮粗饲料的水平或者日粮 浓度增加时会降低产奶量的规律一致（ ， 1995）。 整个试验期内， 乳脂率的变化规律如图 6管日粮添加植物油和粗饲料水平之间对乳脂率没有显著 互作效应（ P但日粮添加植物油能够降低乳脂率约 16%（ 精粗比例和添加植物油之间组合 (p乳脂率没有显著影响。当高精料日粮添加植物油后（ ）显著降低了乳脂肪的含量，但并不降低乳脂肪的产量（表 6 乳蛋白、乳糖和非脂固形物的含量不受日粮处理的影响（ p这与 （ 1988）的报道结果一致。 图 6验期内不同处理间乳脂率的变化 of in 牛奶脂肪酸组成 增加日粮粗饲料的水平可能会降低不饱和脂肪酸对瘤胃微生物的抑制作用（ ，1991）而改变不饱和脂肪酸在瘤胃的氢化过程，本研究中日粮粗饲料水平不影响短链脂肪酸中国农业科学院博士学位论文 第六章 日粮结构与不饱和脂肪酸组合对乳脂 影响 ）和中链脂肪酸（ 和 ）的含量 (P但添加植物油后显著降低了中短链脂肪酸的含量 (但日粮添加植物油能显著引起血液胆固醇、磷脂、低密度脂蛋白和胰岛素浓度升高（ 但当添加 2%的鱼油后，乳脂肪的含量比 0%（ ,在亚油酸采食量接近的情况下，通过日粮添加鱼油而提高 著提高了乳脂 18:1和 对奶牛乳腺组织 言 乳腺是乳脂 970;972）， 过前面几章的研究表明，植物油能有效的调控乳脂 中植物油源性的亚油酸是乳脂 。从乳脂 饱和脂肪酸对）间接反映出：植物油源性的亚油酸或亚麻酸对乳腺 乳脂 此日粮不饱和脂肪酸对乳脂 是日粮添加不饱和脂肪酸（植物油和鱼油）在提高乳脂 引起其鱼油引起 近些年的研究发现，日粮脂肪酸，尤其是多不饱和脂肪酸可能对乳脂合成相关酶基因的表达有调节作用，但目前针对这些关键酶基因表达方面的研究比较少。乳中脂肪酸主要通过乳腺从头合成和吸收血液循环来源的脂 肪酸形成。脂肪合成酶（ 乙酰辅酶 参与脂肪酸从头合成的关键酶，同时，脂蛋白脂酶（ 肪酸分子的摄取和转运有关（ 1974； 1999； 996），而 因此，本试验分别以奶山羊和奶牛为试验模型，探讨： 1）植物油来源的亚油酸和鱼油源性的 2）利用实时定量 一步研究营养环境（日粮亚油酸 、 乳腺 讨营养素提高乳脂而为进一步调控 中国农业科学院博士学位论文 第八章 不饱和脂肪酸对乳脂 成关键酶基因表达影响 验材料与方法 验设计 物油源性的亚油酸对奶山羊乳腺脂肪酸合成相关酶基因表达影响 选用 12只胎次相同、泌乳期相近（ 36d 3d）的西农莎能奶山羊，随机分为两组（ 每组 6只。采用简单反转试验设计，试验处理为不添加亚油酸（植物油）的对照组和添加亚油酸（植物油）的处理组，试验开始前所有奶山羊饲喂 2周相同日粮，每期试验 28天，前 3周为预饲期， 第 4周为采样期。两期试验之间的过渡期为 2周。 图 8验设计 he 油源性的 奶牛乳腺脂肪酸合成相关酶基因表达影响 选用 15头中国荷斯坦奶牛，按照完全随机试验安排，随机分为 3组，每组 5头。试验处理及日粮不饱和脂肪酸的组成如表 8验期 35天，前 4周为预试期，第 5周为采样期。每组随机抽取 3头奶牛手术采乳腺样品。 验 日粮及 动物 饲养管理 奶山羊日粮配方参照 1984）饲养标准。试验开始前称重，单笼饲喂，自由饮水；每日分别于 0800和 1800工挤奶，每日分别在 0830和 1830只羊奶量单独称重记录。 奶牛日粮配合参照奶牛饲养标准（ 34奶牛采用 独饲喂，每日分别于 07:00,13:00 和 19:00h 饲喂，饲喂 30挤奶。 品采集 料及样品采集 试验期间记录采食量，每周收集一次饲料和剩料，取 20%分别按试验组制成混合样后于 存；试验结束后，饲料及剩料样品 65烘干 48h，计算初水份后，根据剩余料数量适当缩小样品，粉碎过 40目筛，保存备用。 样采集 奶山羊：从预试期开始后第 1923天收集早、晚奶样制成两份混合中国农业科学院博士学位论文 第八章 不饱和脂肪酸对乳脂 成关键酶基因表达影响 ，一份（加防腐剂 4保存用于测定乳常规成分，另一份 奶牛：试验期第 5 周开始连续记录前 5 天产奶量，并连续收集前 3d 天奶样。每头牛按早中晚产量（ 30： 20： 30）取样后制成混合样（共 80,其中一份（加防腐剂 4保存备测乳常规成分；另一份在 保存以备测脂肪酸组分。 山羊血液样品采集 从预试期开始第 2425天采集血样，每天 0730、 1030、 1500、 1930、 2030和 2430浆管在 3000g， 45清管室温静止 30 冰箱过夜，然后在 3000g， 415离血清。血清和血浆分离后于 保存。 腺样品采集 奶山羊和奶牛乳腺样品采集参照 996)方法。 奶牛 ： 下午挤奶前保定奶牛 ， 肌肉注射甲苯噻嗪 （ 35 45ug/新西兰产 ）， 在右后乳房 1/4 中部上选约 102 水洗后用 70 酒精和碘酊消毒后 ， 皮下注射盐酸利多卡因 （ 20 mg/ 局部麻醉。用手术刀片切 5 6口，切破皮肤及乳腺体膜，避免皮下大量出血。切取乳腺组织 1到经干热烘烤的铝铂纸上，折裹好压成薄片，放到灭菌的纱布袋，然后置于液氮罐中。采样后用 3 5 布条塞入伤口止血，皮肤切口节节缝合（ 14 3 ，外撒消炎粉（土霉素，盐酸土霉素 2， wt/同时肌肉注射青霉素，硫酸链霉素（ 400W） 。处理完后两小时内挤奶， 7 10天后拆线。 奶山羊：