质粒转化大肠杆菌

质粒转化大肠杆菌 1 重组质粒的鉴定当质粒的重组或其他载体重组后 通常会发生质粒的重组失败 包括质粒的本身环化 因而要求进行筛选 把重组成功的质粒找出来 在目前常用的质粒和其他载体中含有相应的抗生素抗性基因 若重组成功 或不含质粒的自身环化 抗生素抗性基因表达 被转化的大肠杆菌便具备抵抗相应抗生素的能力 可以在含该抗生素的培养基上生长传代 若重组失败 大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡 2 为扩增质粒和其他载体作准备由于大肠杆菌繁殖快 在适宜的条件下繁殖一代仅需要20 30min 而且常用质粒可以在大肠杆菌中增殖达到几百个拷贝 因此 通过对转化成功的大肠杆菌培养 可以在短时间内极大的扩增目的质粒 一 实验目的 二 实验原理 通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理 制备感受态的细菌 这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA 如一些插入目的DNA片段的重组质粒 产生5 106 2 107个转化的菌落 当质粒与这些大肠杆菌混合后 质粒粘附在大肠杆菌的表面 在42 时 大肠杆菌出现热休克 质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内 随后 加入LB培养液 于37 振动培养可使细菌复苏 并且表达质粒编码的抗生素抗性基因 提高转化效率 转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代 形成菌落 三 实验流程 灭活物 质粒 转化大肠杆菌 挑菌 摇菌 菌液PCR 四 实验方法 冻融法 连接产物灭活70 10min 冰上解冻 大肠杆菌感受态细胞50 l 灭火物10 l 混合物 冰上放置30min 42 90sec 冰上2min 加入1000ulLB液体 无抗 37 振荡1h 离心10000rpm 1min RT 去上清800 l 留下200 l上清于1 5ul离心管中重悬 涂板 37 恒温箱 倒置培养12h 时间不得超过20h 1 无菌落 失败 或培养条件不充分 2 菌落布满如苔样 失败 可能是抗生素浓度不够或失效 3 菌落布满 抗生素浓度太高 失败 4 出现菌落 符合要求 1 2 3 4 五 结果分析和失败原因 1 有菌落 说明转化成功 但有两种可能性 其一 质粒自身环化 其二 重组成功 2 无菌落 说明实验没成功 3 菌落布满如苔样 可能是抗生素浓度不够或失效 4 出现大菌斑 大多数是霉菌污染所致 1 结果分析 1 平板中的抗生素部分失效 长出的克隆是杂菌 2 倒Ka平板时 培养基太烫 应冷却到50 以下加Ka抗生素 2 涂板时来回用力过大 涂布环或者涂布棒灼烧过热 或不待冷却就涂布 3 感受态细胞长时间处在常温状态 会严重影响其转化 操作时动作迅速 4 操作时动作过于剧烈 减少对细胞的机械损伤 切记感受态细胞比较娇嫩 5 操作过程不规范 染菌 2 转化失败的原因 六 大肠杆菌感受态细胞的制备 1 从LB平板上挑取新活化的E coliTOP10单菌落于50mlLB培养基中 37 振荡过夜 2 将该菌悬液以1 100 1 50的比例接种于100mlLB液体培养基中 37 振荡培养2 3小时至OD600 0 5左右 3 将培养液转入离心管中 冰上放置10分钟 然后于4 下4100rpm离心10min 4 弃掉上清 加入30ml0 1mol L预冷的CaCl2溶液 重悬 冰上放置15 30min后 4 下4100rpm离心10min 5 弃掉上清 加入2ml预冷的0 1mol L的CaCl 加入无菌甘油300 l 重悬混匀 冰上放置几分钟 6 分装 每管100 l 液氮冷冻后 保存于 70 冰箱 七 挑菌 摇菌 1 离心管标号 2 每个管内吸入650 lLB Ka抗生素 3 用牙签挑取单个菌 4 摇床上摇菌 时间大于8h 准备 离心管 牙签 镊子 LB 抗生素 八 蓝白斑筛选原理 蓝白斑筛选 筛选重组子 根据载体的遗传特征筛选重组子 如 互补 抗生素基因等 现在许多载体都含有一个大肠杆菌DNA的短区段 其中有 半乳糖苷酶基因 lacZ 的调控序列和前146个氨基酸的编码信息 在这个编码区中插入了一个多克隆位点 MCS 受体菌则含编码 半乳糖苷酶C端aa的序列 当外源基因插入时 二者溶为一体后 有 半乳糖苷酶表达 在生色底物5 溴 4 氯 3吲哚 D 半乳糖苷 X gal 培养基中形成蓝色菌落 而当有外源基因插入到多克隆原点 从而造成插入失活 而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑 通过颜色不同而区分重组子和非重组子 蓝白斑筛选 1 未转化的菌不具有抗性 不生长 2 转化了空载体 即未重组质粒的菌 长成蓝色菌落 3 转化了重组质粒的菌 即目的重组菌 长成白色菌落 九 菌液PCR验证 加样 easybuffer 2 5 l 样数DNTP 1 5 l 样数M13R 1 l 样数M13F 1 l 样数easyTaq 0 2 l 样数 混匀 离心 分装 样品 跑电泳 跑PCR 混匀