氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性

精品文档 9欢迎下载 实验三实验三 氮蓝四唑 氮蓝四唑 NBTNBT 法测定超氧化物歧化酶 法测定超氧化物歧化酶 SODSOD 活性 活性 一 实验目的一 实验目的 1 了解氮蓝四唑 NBT 法测定植物体内超氧化物歧化酶 SOD 活性的基 本原理 2 掌握氮蓝四唑 NBT 法测定植物体内超氧化物歧化酶 SOD 活性的基 本操作方法 二 实验原理二 实验原理 超氧化物歧化酶 superoxide dismutase SOD 普遍存在于动 植物体内 是一种清除超氧阴离子自由基的酶 本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四 唑 NBT 在光下的还原作用来确定酶活性大小 在有氧化物质存在下 核 黄素可被光还原 被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离 子自由基 超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙 后者在 560nm处有最大吸收 而SOD可清除超氧阴离子自由基 从而抑制了甲腙的形 成 于是光还原反应后 反应液蓝色愈深 说明酶活性愈低 反之酶活性愈 高 据此可以计算出酶活性大小 三 材料 仪器设备及试剂三 材料 仪器设备及试剂 一 材料 水稻或小麦等植物叶片 二 仪器设备 高速台式离心机 分光光度计 微量进样器 荧光灯 反应试管处照度为 4000Lx 试 管或指形管数支 三 试剂 1 0 05mol L磷酸缓冲液 pH7 8 91 5ml0 05MNa2HPO4 8 5ml0 05M NaH2PO4 2 130mmol L甲硫氨酸 Met 溶液 称1 9399gMet用磷酸缓冲液定容至 100ml 3 750 mol L氮蓝四唑溶液 称取0 06133gNBT用磷酸缓冲液定容至 100ml 避光保存 精品文档 10欢迎下载 4 100 mol LEDTA Na2溶液 称取0 03721g EDTA Na2 用磷酸缓冲液定 容至1000ml 5 20 mol L核黄素溶液 称取0 0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml 避光保存 四 实验步骤四 实验步骤 1 酶液提取 取一定部位的植物叶片 视需要定 去叶脉 0 52g于预冷的研钵中 加1ml预 冷的磷酸缓 液在冰浴上研磨成浆 加缓冲液使终体积为4ml 取4ml于4 10000r min离心 20min 上清液即为SOD粗提液 2 显色反应 取10mL试管 要求透明度好 4支 2支为测定管 另2支为对照管 按下表加入 各种溶液 各溶液显色反应用量混匀后将1支对照管置暗处 其他各管于4000lx日光下反应 20min 要 各管受光情况一致 温度高 时间缩短 低时延长 3 SOD活性测定与计算 至反应结束后 全部移入暗处 以不照光的对照管作空白 分别测定其他各管 的吸光度 注意 用放在暗处的缓冲液代替酶液的空白管调零 各试剂按比例混合好 3 5ml 缓冲液 0 5ml 甲硫氨酸 0 5ml 氮蓝四唑 0 5ml EDTANa2 0 40ml 蒸馏 水 再加 100ul 酶液 核黄素 0 5ml 最后单独加入 总体积 6 0mL 表表 1010 SODSOD 活性测定的试剂量活性测定的试剂量 试管编号1 对照 不光 照 2 对照 光照 34 缓冲液 mL 3 503 503 503 50 甲硫氨酸 mL 0 500 500 500 50 精品文档 11欢迎下载 氮蓝四唑 mL 0 500 500 500 50 EDTANa2 mL 0 500 500 500 50 蒸馏水 mL 0 500 500 400 40 酶液 000 100 10 核黄素 0 500 500 500 50 测定结果 0AckAE1AE2 表表 1111 SODSOD 活性测定 平行测定活性测定 平行测定 2 2 次 的次 的 AbsAbs 试管号2 对照 光照 34 平行测定次数第一次第二次第一次第二次第一次第二次 吸光度 A Abs 0 2030 2510 0550 1990 0350 140 五五 结果计算 结果计算 计算公式 SOD U g FW Ack AE VT Ack 0 5 W Vs 式中 VT 总酶液量 ml Vs 所用酶液量 50ul W 叶片鲜重 g Ack 用缓冲液代替酶液的照光对照管吸光度 AE 样品管吸光度 表表 1212 SODSOD 活性的计算活性的计算 VT 400uL Vs 50uL W 0 52g 平行侧定次数第一次第二次 样品管管号 3434 SOD U g FW 0 2240 2550 0640 136 六