耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

1 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 百科名片百科名片 革兰阳性球菌 金黄色葡萄球菌是临床上常见的毒性较强的细菌 自从本世纪40年代青霉 素问世后 金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病受到较大的控制 但随着青霉素 的广泛使用 有些金黄色葡萄球菌产生青霉素酶 能水解 内酰胺环 表现为 对青霉素的耐药 科学家研究出一种新的能耐青霉素酶的半合成青霉素 即甲 氧西林 methicillin 1959年应用于临床后曾有效地控制了金黄色葡萄球菌产酶 株的感染 可英国的 Jevons 就首次发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA MRSA 从发现至今感染几乎遍及全球 已成为院内感染的重要病原菌之一 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA 的特性 的特性 1 不均一耐药性不均一耐药性 MRSA 菌落内细菌存在敏感和耐药两个亚群 即一株 MRSA 中只有一小部 分细菌约10 4 10 7 对甲氧西林高度耐药 在50 g ml 甲氧西林条件下尚 能生存 而菌落中大多数细菌对甲氧西林敏感 在使用抗生素后的几小时内大 量敏感菌被杀死 但少数耐药菌株却缓慢生长 在数小时反又迅速增殖 2 广谱耐药性广谱耐药性 MRSA 除对甲氧西林耐药外 对其它所有与甲氧西林相同结构的 内酰胺 类和头孢类抗生素均耐药 MRSA 还可通过改变抗生素作用靶位 产生修饰酶 降低膜通透性产生大量 PABA 等不同机制 3 对氨基糖苷类 大环内酯类 四 环素类 氟喹喏酮类 磺胺类 利福平均产生不同程度的耐药 唯对万古霉素 敏感 3 生长特殊性生长特殊性 MRSA 生长缓慢 在30 C 培养基 pH 7 0及高渗 40 g L NaCl 溶液 条件 2 下生长较快 4 在30 C 时 不均一耐药株表现为均一耐药和高度耐药 在37 C 又恢复不均一耐药 均一耐药株在 37 C 或 pH 5 2时 均一耐药性可被抑制 而表现为敏感 增加 NaCl 浓度 低温孵育和延长时间 可使不均一耐药株群 体中敏感亚群中的耐药性得到充分表达 即能耐受较高浓度的甲氧西林 而对 其中耐药亚群无影响 5 但最近也有报道 高渗下延长培养时间 会影响 MRSA 的检出结果 因为在高盐情况下 培养48 h 对甲氧西林敏感的金黄色 葡萄球菌 methicillin sensitive Staphylococcus aureus MSSA 易产生大量 内 酰胺酶 可缓慢水解甲氧西林 导致细菌生长 而误认为 MSSA 所以一般 MRSA 在高盐环境孵育24 h 而耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌 MRCNS 由于 耐药亚群菌数少于金葡菌 应孵育48小时观察结果 MRSA 的耐药机理的耐药机理 1 固有耐药固有耐药 是由染色体介导的耐药 其耐药性的产生与细菌产生一种青霉素结合蛋白 PBP 有关 产生五种 PBP 1 2 3 3 和4 它们具有合成细菌细胞壁的功能 它们与 内酰胺类抗生素有很高的亲和力 能共价结合于 内酰胺类药物的活 动位点上 失去其活性导致细菌死亡 而 MRSA 产生了一种独特的 PBP 这 种分子量增加了78 1000道尔顿的 PBP 因其电泳率介于 PBP2与 PBP3之间 故称为 PBP2a 或 PBP2 6 PBP2a 对 内酰胺类抗生素亲和力很低 因而很 少或不被 内酰胺类药结合 在 内酰胺类抗生素存在的情况下 细菌仍能生 长 表现出耐药性 PBP2a 的产生是受染色体甲氧西林耐药基因 mec A 来调 节的 MRSA 与 MSSA 根本区别在于它们的 PBP 不同 2 获得性耐药获得性耐药 是质粒介导的耐药 某些菌株通过耐药因子产生大量 内酰胺酶 使耐酶 青霉素缓慢失活 表现出耐药性 7 多为临界耐药 MRSA 的分型的分型 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA 分型对追踪传染源 研究型别与感染种类和耐药性的关系有重 3 要意义 国外开展较早的有噬菌体分型噬菌体分型 将待测菌于肉汤中 35 C 孵育6 h 涂布于分型琼脂平板上 待干后将23种噬菌体注入琼脂平板中的小方格内 再 置35 C 培养箱孵育 6 h 后移至室温过夜观察结果 用4组23种噬菌体 将 MRSA 分为4群 一般以 群为最多 8 也有报告以 群为多 噬菌体分型结 果常不满意 日本小粟 子证实有29 3 菌株不能分型 且重复性差 不宜用 于流行病学调查 质粒图谱分型质粒图谱分型较为可靠 可分为18个型 能准确地分析菌株之间的相关性 将流行菌株与非流行菌株加以区别 国内 MRSA 广泛存在分子量为1 6 Md 1 8 Md 及2 67 Md 的质粒 不同地区和不同医院会有特殊质粒带 免疫印迹分型免疫印迹分型法将 MRSA 分为9个型 以 B C 型为最常见 各型含有特 征性的分子带 该法比较稳定 染色体限制性内切酶分析可识别病原体 DNA 链上特异位点及核苷酸序列 能从基因水平显示病原体特征 MRSA 还可用血清学 凝固酶 耐药谱等方法分型 现在 Southern 印迹印迹 法法也逐渐运用于 MRSA 的分型 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA 的检测的检测 由于 MRSA 的不均一耐药性 给其检测带来一定的困难 MRSA 的检出率 受孵育温度 时间 培养基的 pH 和 NaCl 的浓度 菌液的数量等多种因素的影 响 因此 目前还没有一种最佳的检测方法 1 纸片扩散法纸片扩散法 K B 法法 平皿中 MH 琼脂厚度为4 mm 菌液调至0 5麦氏浊度 涂沫于上述平板 甲氧西林含量5 g 片 35 C 孵育24 h 抑菌圈 11 mm 为耐药 17 mm 为敏 感 由于 MRSA 通常对其它耐酶半合成青霉素也耐药 因此美国临床实验室标 准化委员会 NCCLS 推荐用苯唑西林来代替检测 MRSA 苯唑西林在贮存过程 4 中药效不易降低 且对不均一耐药性检测效果更好 所以国内多数实验室都采 用苯唑西林 苯唑西林含量为1 g 片 抑菌圈 10 mm 为耐药 13 mm 为敏 感 11 12 mm 为中介 质控菌株为金黄色葡萄球菌 ATCC 29213 耐药菌株 金黄色葡萄球菌 ATCC 25923 敏感菌株 纸片扩散法最大优点是快速 简便 价格便宜 易被检验人员接受 在合适的抗生素及培养温度 菌液的浓度 培 养基厚度等条件下 检测 MRSA 是可行的 但 Leneastre 等 9 对 K B 法和特 异性 mec A 基因 DNA 片段法鉴定 MRSA 的结果进行了比较 发现在49株用 K B 法鉴定为 MSSA 的菌株 特异性 mec A 基因 DNA 片段法鉴定却有11株含 mec A 基因 59株用纸片法鉴定为典型 MRSA 的菌株 有10株却没有特异性 mec A 基因 这两种方法大约有18 20 的差异 Chipman 10 等研究也表 明以 mec A 基因检测法为参考方法时 纸片扩散法的符合率为88 2 这可能 与纸片法中的琼脂中没有 NaCl 成份 一些菌株的耐药性得不到完全表达有关 因此 为提高纸片扩散法检测 MRSA 的可靠性 最好在 MH 琼脂中加入40 g L NaCl 2 肉汤稀释肉汤稀释 MIC 法法 美国疾病控制中心 CDC 推荐用 MH 肉汤培养基加 NaCl 至20 g L 浓度 同 时加入 Ca Mg 离子 将苯唑西林进行倍比稀释 从0 125 16 g ml 菌浓度 为104 ml 35 C 孵育24 h MIC4 g ml 为耐药 该法检出 率可达95 但操作较繁琐 3 琼脂稀释琼脂稀释 MIC 法法 用含20 g L NaCl 的 MH 琼脂将苯唑西林倍比稀释为12个不同浓度并浇注平 皿 苯唑西林量终浓度为0 125 256 g ml 再将菌液 0 5麦氏浊度 点种于含 药平皿 35 C 孵育24 h 该法适用于大量菌株的 MRSA 检测 结果容易判断 重复性好 但耗时 费力 4 琼脂筛选法琼脂筛选法 这是1997年 NCCLS 推荐的 MRSA 的确证试验 即 MH 培养基加 NaCl 40 g L 加苯唑西林 6 g ml 将菌液 0 5麦氏浊度 点种或画线35 C 孵育24 h 只 要平皿有菌生长 即使一个菌落也是 MRSA 该法敏感度为100 常用作校 正其它方法的标准 尤其适用于检测抑菌圈直径处于中介度的金黄色葡萄球菌 5 浓度梯度浓度梯度 Etest 法法 是1988年 AB Biodisk 公司推出 在含20 g L NaCl 的 MH 琼脂平板上 贴 上苯唑西林的试条 菌液调至0 5 1麦氏浊度 35 C 孵育24 h 直接读取 MIC 值 MIC4 g ml 为耐药 Etest 法结合了纸片扩散法和肉汤 稀释法的优点 长塑料条含有连续的呈指数梯度变化的苯唑西林 0 016 256 5 g ml 故在检测低水平或中等程度耐药的 MRSA 时结果更为准确 Novak 11 等 报道 用 Alamar 法和 Etest 法对127株 MRSA 的检测比较 两者结果相关较高 用 Etest 法检测127株 MRSA 其中93株 MIC 256 g ml 28株在6 256 g ml 检出率达96 Etest 法具有精确 可靠 稳定性好的特点 但缺点是 价格昂贵 6 自动化药敏检测自动化药敏检测 目前有 Vitek 系统 ATB 系统 MicroScan 系统 Sensiter ARIS 等 将菌 液稀释后注入药敏板或孔内 然后通过检测菌液浊度 荧光指示剂的荧光强度 或荧光底物的水解反应来判读结果 其优点是快速 但有时对生长缓慢或延迟 表达耐药性的 MRSA 在3 4 h 内难以达到检测水平 容易漏检或误报 MRSA 7 DNA 探针杂交探针杂交 上述的方法都是检测 MRSA 耐药表型的方法 MRSA 根据其耐药频率可分 为1 2 3 4类 其耐药频率为10 7 10 4 10 3以及10 1 12 上述常 规的检测方法对于3 4类 MRSA 一般不存在问题 但对于低频率的1 2类则 很容易造成漏检 因此 对于低水平耐药或临界水平耐药的 MRSA 应选择特 异性高的分子生物学方法来检测 DNA 探针杂交是用特异性的 mec A DNA 片 段经地高辛标记 与可疑菌株进行杂交 有学者报告 13 DNA 探针仅与 MRSA DNA 杂交 与 MSSA DNA 无杂交带 其特异性高于琼脂稀释法 敏感 性高于肉汤稀释法 而且可直接用于临床标本 无需先进行细菌分离培养 但 探针较贵 保存期较短 8 PCR 技术技术 本世纪80年代末期 国外就有人用聚合酶链反应 PCR 来检测 PBP2a 的 mec A 基因 它是根据金黄色葡萄球菌 TK 784的 mec A 基因 DNA 序列 14 设 计一引物 再裂解提取被测菌的 DNA 在一定条件下进行扩增 经琼脂糖电泳 后在紫外灯下观察有无与阳性对照菌株 金黄色葡萄球菌 ATCC29213 相同的区 带 PCR 具有较高的灵敏度 只要被测菌有微量的的基因 即出现阳性结果 因此常作为检测 MRSA 的参考方法 陈秀枢实验表明 14 金黄色葡萄球菌耐 苯唑西林的耐药水平与 mec A 基因有较好的相关性 MIC 4 g ml 的22株菌均 检出 mec A 基因 由于 PCR 很灵敏 有时会因实验室的污染而出现假阳性 为使 PCR 具有更高的可靠性 必须对其扩增产物进行探针杂交或测序以提高 特异性 15 而有一些耐药基因是沉默基因 不表达 mec A 基因产物 有时会 得出假耐药结论 所以分子生物学方法并非100 的敏感和特异 加上该法前期 处理操作繁琐 且需要一定的设备 仅在可疑或特殊情况下做此试验 耐甲氧 西林金黄色葡萄球菌 MRSA 感染的流行概况 自从1961年英国 发现 MRSA 后 在欧美及亚洲一些国家相继报道了 MRSA 所致的院内感染 6 从60年代后期到80年代 MRSA 感染率大大增加 美国 NNIS 报道1975年182 所医院 MRSA 占金黄色葡萄球菌感染总数的2 4 1991年上升至24 8 其 中尤以500张床以上的教学医院和中心医院为多 因为这些医院里 MRSA 感染 的机会较多 耐药菌株既可由感染病人带入医院 也可因滥用抗生素在医院内 产生 16 欧洲1993年1417家医院 ICU 分离的 MRSA 达60 17 而日本 Kansai 医科大学附属医院 MRSA 的分离率1993年达到41 国内在70年代发 现有 MRSA 近几年 MRSA 的检出率正在逐年上升 上海1978年在200株金黄 色葡萄球菌中 MRSA 只占5 1988年上升至24 1996年激增至72 18 天津1988年调查 MRSA 分离率为47 19 北京医科大学附属医院1996年分离 MRSA 达58 3 20 山东淮坊市1996年在三家医院的婴儿室分离出金黄色葡 萄球菌198株 其中 MRSA 为112株 56 5 21 武汉同济医科大学附院1992 年分离 MRSA 就达79 6 22 MRSA 感染多发生于免疫缺陷者 大面积烧伤 大手术后患者 长期住院及老年患者 MRSA 极易导致感染的流行和暴发 MRSA 传播主要通过医护人员的手 在患者 医护人员 患者间播散 另外 衣物 敷料等物品可携带 MRSA 促进 MRSA 在院内的流行 病人一旦感染或 携带 MRSA 该菌可存在于患者身上达数月之久 MRSA 的治疗和预防的治疗和预防 1 MRSA 的治疗的治疗 MRSA