菌种选育理论和技术

第二章 工业微生物菌种选育,1.微生物分离2.自然选育3.诱变育种4.杂交育种5.原生质体技术6.分子育种,菌种选育,第一节 微生物分离,1.1 菌种分离的一般过程,土样的采取, 预处理, 培养, 菌落的选择, 产品的鉴定,如何使样品中所含微生物的可能性大,如何在后续的操作中使这种可能性实现,目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物,问题：,1.2 采样时要注意的问题,气候、水分、空气,来源要广,结合产品的特点,标签：地点、时间、气候等,富集的三种方案：,定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集 的条件，进行培养。,1.3 目的微生物富集的一些基本方法,富集的目的：,让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。,当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑。,不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法。,定向培养的富集方法,1、底物,2、pH条件,3、培养时间,4、培养温度,等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。,定向培养的方法,物理方法：加热、膜过滤等,但主要是通过培养的方法,1.4 菌落的选出,从产物角度出发,在培养时以产物的形成有目的的设计培养基,利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素,从形态的角度,菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。,例：醛肟水解酶的筛选,-Journal of biotechnology 94(2002), 65-72,培养基中含0.05% of Z-PAOx,每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基,不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离单菌落,1.5 目的微生物富集方法的研究进展,分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物 的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同 源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等,目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的 多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。,In contrast to this traditional approach, modern molecular biology techniques allow for DNA library expression screening, which also enables access to enzymes of nonculturable organisms. By this strategy, for instance, the company Diversa (San Diego, CA, USA) identised 120 unique esterases/lipases from only 16% of the total DNA obtained from an alkaline soil sample.,第二节 自然选育,2.1 定义 利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离，筛选排除衰退型菌株，从中选择维持原有水平的菌株，又称自然分离。,二、菌种退化的原因自发突变；异核体的存在；突变株不稳定,移种,摇瓶初筛,2.2 自然选育流程图,第三节 诱变育种,3.1 定义 将生物体暴露于物理、化学或生物诱变剂作用下，促使生物体发生突变、提高变异幅度，从而选出优良菌种的过程。,稳定性试验、菌种特性考察,3.2 诱变育种流程图,3.3 诱变剂,凡能提高生物体突变频率的物质称诱变剂。 3.3.1 物理诱变剂 紫外线、X射线、射线、快中子、离子束 UV：260nm，是碱基共轭体系的最高吸收峰 引起胸腺嘧啶二聚体的形成和胞嘧啶水合作用 生物学效应：DNA链的断裂；DNA分子内和分子间的交联；核酸和蛋白的交联。,实验室：15W，253.7nm，灯管与样品的距离30cm，剂量由时间（30秒、 60秒、 90秒、 120秒）或能量（格尔）决定。 死亡率控制在7090%。 诱变后注意要避光培养（因为光复活现象）。,3.3.2 化学诱变剂 烷化剂：如亚硝基胍（NTG）、硫酸二乙酯（DES）、乙烯亚胺（EI）、氮芥 作用机制：使核酸的氮原子上烷基，从而使配对错误。,碱基类似物：5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，2-氨基嘌呤,5-BU:酮式,5-BU:烯醇式,移码诱变剂：丫啶橙、丫啶黄 引起碱基丧失或增加抗癌药物：丝裂霉素、争光霉素 抑制DNA复制3.3.3 生物诱变剂 噬菌体，转座子,3.4 菌种诱变的方法,诱变育种包括出发菌种选择、诱变处理和筛选突变株三个部分。 3.4.1 出发菌种选择原则： 选取纯种作为出发菌株 选择具有优良性状的菌株 对诱变剂敏感的菌株,处理单孢子（或单细胞）悬液：,芽孢杆菌应处理芽孢,放线菌，霉菌应处理孢子,细菌指数期，放线菌、霉菌要稍加萌发后使用,出发菌株应制成均匀悬液,诱变剂的使用： 剂量以诱变剂浓度和处理时间来表示,合适剂量： 能扩大变异幅度又能促使 变异移向正变范围的剂量,3.4.2 诱变处理,还可加诱变增强剂:如LiCl,充分利用复合处理的协同效应,两种或多种诱变剂先后使用,同种诱变剂重复使用,两种或多种诱变剂同时使用,3.4.3 突变株的选择,3.4.3.1 随机筛选摇瓶筛选法琼脂块筛选法筛选自动化和筛选工具微型化,3.4.3.2 理性化筛选初级代谢产物高产菌株的筛选筛选营养缺陷型若分别筛选、高产菌株，根据下列代谢途径，应：A B C D EA B C D,EF,筛选E缺陷型,筛选F缺陷型,筛选细胞膜透性改变的突变株 筛选油酸缺陷型或甘油缺陷型,筛选结构类似物抗性突变株 结构类似物一方面与代谢物结构相似，有相似的反馈调节作用；一方面不同于代谢物不具有正常的生理功能，使细胞死亡。 添加此类物质，大部分细胞缺少该种初级代谢物而死亡，生长下来的菌株对此结构类似物不敏感，不受此反馈调节抑制。,HD:高丝氨酸脱氢酶,黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制,HT:高丝氨酸转乙酰酶,AK:天冬氨酸激酶,结构类似物抗性：Lys的类似物AEC,Thr的类似物AHV,营养缺陷型：如Thr缺陷型,黄色短杆菌F9-50的诱变谱系,Bervibacterium flavum As 1.495 (Ile-) lys.HCl 2.1 g/l,F6-16 (Ile -, Thr -) 20.8 g/l,F9-50 (leu -, Thr -, AEC r) 33.5 g/l,利用回复突变筛选抗反馈突变株 先选对产物敏感的菌株，再诱变处理得到恢复突变株（改变酶的调节位点，不受产物的反馈抑制）。,次级代谢产物高产菌株的筛选筛选营养缺陷型筛选负变株或零变株的回复突变株筛选去磷酸盐调节突变株 磷酸盐对许多抗生素的生物合成有抑制作用,筛选去除碳源分解代谢突变株 能被菌快速利用的碳源在被代谢后，对其他代谢途径的酶有抑制作用，例葡萄糖效应。 葡萄糖效应：培养基中同时含有葡萄糖和乳糖，微生物先利用葡萄糖、葡萄糖利用完后才利用乳糖，出现两次菌体生长旺盛时期，若加入乳糖酶诱导物，也不产生乳糖酶，而是在葡萄糖利用完后才产生。 方法：将菌在含有葡萄糖和以组氨酸为唯一氮源的培养基连续传代。筛选氨基酸结构类似物抗性突变株 许多抗生素和氨基酸有共同的前体,筛选二价金属离子抗性突变株 二价金属离子可与产物或其中间体结合，抑制产物合成筛选前体或前体结构类似物抗性突变株 前体或前体结构类似物对菌体的生长和抗生素的生物合成有抑制作用筛选自身所产抗生素抗性突变株,第四节 杂交育种,4.1 定义 将两个基因型不同的菌株经吻合或接合使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。 4.2 举例 一株大肠杆菌A-B+Lac-SMrT1s 另一株大肠杆菌A+B-Lac+SMsT1r 混合培养后，长出少数菌落。,4.2.1 细菌杂交,在细菌中实现杂交的种类尚不多，主要是大肠杆菌，其他还有鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、淋病奈氏球菌等。 大肠杆菌中存着致育因子F，有F因子为F+，没有F因子称F-。整合状态为Hfr。 F因子有明显的感染性，大肠杆菌的接合，实质上是F因子的转移，所以F+和Hfr称供体菌，而F-称受体菌。,4.2.2 酵母杂交育种技术,酵母繁殖方式： 酵母为单细胞型真菌，一般以出芽方式生殖，在通常情况下，繁殖体为双倍体，但经过特定条件的诱导，可使其产生单倍体孢子并可出芽产生单倍体繁殖体。 单倍体细胞具及2两种交配型。两种交配型细胞经其细胞壁上特定的凝聚因子诱导而进行交配，恢复为双倍体；同一交配型细胞之间，则因细胞壁上凝集因子的存在而不能进行交配。 在生活过程中，酵母细胞还可以形成三倍体、四倍体、多倍体或非整倍体细胞。,一般而言，杂交育种运用了酵母的单双倍生活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。,第五节 原生质体技术,菌体经溶菌酶处理后，去掉了细胞壁，露出球形且特别脆弱的原生质体。它对渗透压、振荡、离心等十分敏感。 但由于原生质体结构与生理活性均未发生改变，故在适宜的条件下，可以再生出细胞壁进行细胞分裂。,原生质体制备和再生的过程,培养菌丝(细胞),洗涤菌丝,溶菌酶处理菌丝,形成原生质体、离心,用高渗溶液洗涤原生质体,原生质体融合,第六节 分子育种,6.1 提高次级代谢产物的产量,基因工程技术提高抗生素产量的主要手段1. 增加限速酶的基因拷贝数2. 增加正调节基因,去除负调节基因3. 增加抗性基因的拷贝数,6.1.1 增加限速酶的基因拷贝数,原理： Ea Eb Ec Ed A B C D E ( 代谢产物） 限速酶 Rate-limiting enzyme (Bottleneck)例1: 起始原料 Ea Eb Ec -aminoadipic acid ACV三肽 异青霉素N 青霉素 L-cysteine L-valine Ea: ACV合成酶（限速酶） Eb:异青霉素N合成酶 Ec:异青霉素N酰基水解酶,例2. 头孢菌素C生物合成的限速酶,在头孢菌素C 的工业发酵生产中，人们发现发酵结束后在得到的发酵液中，除了主要产物是头孢菌素C外，在发酵液中还积累另一种产物-青霉素N。 问题：积累中间产物-青霉素N 原因：下一步反应为限速酶反应 解决：导入额外的扩环酶/羟化酶基因 结果：使头孢菌素C的产量提高 25-50%， 积累的青霉素N消失。,6.1.2 增加正调节基因, 去除负调节基因,调节基因根据其作用的不同分为正调节和负调节。正调节促进生物合成结构基因的转录，负调节阻扼结构基因的转录。,去除负调节基因使结构基因超量表达,6.1.3 增加抗性基因的拷贝数,抗性基因的作用是避免抗生素产生菌被自身产生的代谢产物所杀灭。 其作用可通过三条途径实现：抗性基因产物(酶)将抗生素作用的底物加以修饰;将抗生素的分子结构加以修饰,使其失活; 将抗生素分子排出细胞外。,例1. Davies J. 利用链霉菌质粒pIJ702 从卡那霉素产生菌克隆了6-N-氨基糖苷乙酰转移酶AAC6的基因(aacA),该基因产物在乙酰辅酶A的存在下,可将氨基糖苷类抗生素的氨基糖6乙酰化。将aacA基因转入新霉素和卡那霉素的产生菌中, 结果显著提高了抗生素的产量.,转化,转化子- 链霉菌细胞 氨基糖苷类抗生素产量提高,卡那霉素6-乙酰转移酶AAC（6） 的作用,例2. 螺旋霉素抗性基因srmB 重组质粒 转化 S.ambofaciens（生二素链霉菌） 转化子 使螺旋霉素产量提高。,6.2 改进代谢产物的组分,链霉菌产生的次级代谢产物常常是一组结构相似的混合物。每个化合物称为它的一个组分。多组分产生的分子基础是因为次级代谢产物的合成酶对底物的选择性不强以及合成途径中分支途径的存在。 通过基因工程手段，灭活某分支途径的酶，就可以去除该分支途径的产物。此策略常用来去除发酵产物中的无用组分，提高有用组分的含量。,只产Avermectin “2”组分基因工程菌的构建,aveC 脱水酶,阿维菌素“2”组分,阿维菌素“1”组分,aveC基因在染色体上的位置,重组质粒的构建,pC04,Bgl,II,p,pC05,图,1,-,8,质粒,pC05,的构建过程,Fig,.,1,-,8,The procedures in the,construction of plasmid pC05,pC03,Ligase,重组质粒的转化,转化阿维菌素产生菌,tsrR amR,tsrR amR,Gene