核酸杂交检测技术

核酸杂交检测技术核酸杂交检测技术 核酸杂交技术是分子生物学的基本技术之一 近年来正逐渐用于病毒病的特异 敏感和快速 诊断 杂交的 基本原理是碱基互补的二条单链核酸退火形成双链 用于诊断目的的杂交双方是已知序列的病毒探针和待 测样品中的病毒核酸 杂交后通过特定方法检测 如有杂交信号 则说明样品中存在病毒核酸 进而证明病 毒感染的存在 待测的病毒核酸可以从病料中提取 也可以从纯化的病毒粒子提取 提取后可在膜上与 探针杂交 固相杂交 或直接在试管 的杂交液中杂交 液相杂交 此外 也可直接在组织切片或细胞涂片 上对细胞中的病毒核酸 进行杂交 原位杂交 下面重点介绍如何建立杂交体系及适用于病毒诊断的几种 杂交方法 一 建立杂交体系 核酸杂交是多种环境因素与二条互补 核酸链综合作用的结果 它有较高的技术要求 了解各种组份及反应条件对杂交的影响是建立杂交体系 获得理想结果的基础 1 温度 杂交反应中 双链核酸的变 性与复性主要是温度控制的 选择适当的杂交和洗膜温度是实验成 败最关键的因素之一 杂 交反应通常在低于解链温度 T m 值 15 25 的条件下进行 T m 值受核酸链 组成 G C 溶液的离子强度 pH 值及反应体系是否含变性剂等的影响 在杂交体系不含变性剂的情况 下 DNA 之间的杂交反应通常在 68 进行 当含 50 变性剂甲酰胺 则在 42 进行 2 pH 值 杂交体 系的 pH 在 5 9 的范围内对复性无明显影响 杂交反应通常在 pH6 5 7 5 之间进行 较高的 pH 值产 生更严格的杂交条件 3 盐离子浓度 体 系 中往往加入单价离子的盐 因为单价阳离子与核酸链上 的磷酸基团发生静电反应 所以能降低 核酸链之间的静电排斥 维持双链 DNA 的稳定性 盐浓度增加 稳定 性提高 杂交体系中通常 采用 6 倍 SSC 1 倍 SSC 为 0 15 mol L NaCl 和 0 015mol L 柠檬酸钠 pH7 0 缓冲液 4 变性剂 杂交体系中加入变性剂可降低 T m 值 所以杂交可在更低的温度下进行 常用变性剂是甲酰胺 5 DNA 浓度 浓度愈高 复性速度愈快 所以杂交反应中应加入足够的探针 还应尽量减少杂交体积 一般每百 cm 2 滤膜用 2 5ml 杂交液 6 探针长度 溶液中 DNA 复性率与 片段长度的平方根成正比 所以用长的 探针可获得高的复性率 但原位杂交通常用较短的探针 以减少探 针进入细胞并扩散到 靶核酸的阻力 7 硫酸葡聚糖 在水溶液中 此化合物表面可吸附 DNA 探针分 子 从而浓缩探针 促进二条核酸链间的缔合 其 10 的浓度可提高杂交速度 10 100 倍 使用硫酸葡聚 糖可能导致背景加深 所以一般在探针浓度过低的情况下才使用 8 杂交时间 它受探针的长度与浓 度 反应体积等因素的影响 较短的探针 较高 的探针浓度和较小的杂交体积 需要较短的杂交时间 一 般来说 杂交时间通常在 2 16 小时 9 预杂交 在杂交前进行预杂交 封闭非特异的 DNA 结合位点 降低非特 异杂交 是杂交的前提 常用的封阻试剂有非特异性的 DNA 鲑鱼精子 DNA 或小牛胸腺 DNA 和大 分子化合物 聚蔗糖 聚乙烯吡咯烷酮 牛血清白蛋白 脱脂奶粉等 10 碱基 错配 杂交中碱基 错配将明显提高杂交本底 从而影响杂交结果的判定 因此杂交可在更为严格的条件下进行 如低于 T m 值 15 的温度下杂交 11 漂洗 杂交后的漂洗是减少非特异杂交 降低本底的关键步骤 通常用 较低盐浓度 0 1 倍 SSC 的缓 冲液在较高温度下 如 68 漂洗杂交膜 二 核酸打点杂交 1 操作步骤 核酸打点杂交是最常用的一种杂交检测方法 是作为诊断 目的的首选方法 它是将一定量 的病毒核酸 DNA 或 RNA 打点在固相支持膜 通常是硝酸纤维 素膜或尼龙膜 上 然后与放射性或非放射性 标记的 DNA 或 RNA 探针进行杂交 杂交后通过放 射自显影 检测放射性探针 或显色反应 检测非放射性探 针 检测杂交信号 阳性杂交信号表 明病毒核酸的存在 检测出病毒核酸就充分说明发生了病毒感染 具 体操作方法如下 裁剪一张大小适度的硝酸纤维素膜 NC 膜 将膜在去离子水中湿透 不能完全湿透的 膜不 宜使用 再置 20 倍 SSC 中浸泡 30 分钟 然后置滤纸上 室温晾干 取变性的病毒核酸 DNA 或 RNA 1 5 l 点样于上述处理的 NC 膜上 同时点上探针同源核 酸 作为阳性对照 和非同源核酸 作为阴性 对照 室温干燥后 将点样的 NC 膜置 80 干 烤固定 2 小时 点样膜用 6 倍 SSC 0 1 十二烷基肌 氨酸钠 0 02 SDS 1 封阻试剂 一种 特殊提纯和处理的脱脂牛奶粉 柏林格公司生产 的预杂交液于 68 预杂交 4 6 小时 每 100c m 2 膜用至少 20ml 预杂交液 将膜用杂交液 预杂交液中加入 20 80ng ml 变性的探针 于 68 杂交 12 16 小时 每 100cm 2 膜用 2 5ml 杂交液 室温下用 2 倍 SSC 0 1 SDS 溶液洗膜 2 次 在 68 条件下用 0 1 倍 SSC 0 1 SDS 溶液洗膜 2 次 每次 15 分钟 如果进行放 射 自显影 则在室温下用 0 1 倍 SSC 洗膜一次 室温干燥后 进行放射自显影 如果进行化学 显色 则进行如下操作 以地高辛显色为例 用 100 mmol L Tris HCl pH7 5 150mmol L NaCl 短暂 洗涤膜 100cm 2 的膜在 20ml 抗体结合物溶液中室温反应 30 分钟 10 重复 的洗涤二次 每 次 15 分钟 11 膜在 100mmol L Tris HCl pH9 5 100mmol L N aCl 50mmol L MgCl 2 中平衡 2 分 钟后 加入显色液 于黑暗中显色 当要求的点显出颜色时 可用 TE 洗膜 终止反应 2 操作说明 1 从感染的动物组织 血液 分泌物 粪便等样品中提取的核酸经变性后可直接点在 NC 膜上 检测可 能含有的病毒核酸 2 点样量不超过 5 l 如果样品中核酸含量很低 可在上一次点样干燥后在同一点 重复点 样 也可用多孔抽滤加样器进行点样 其点样量可达 200 l 以上 3 除 NC 膜外 也可用尼 龙膜 载样 4 样品或探针是 RNA 时 所有试剂及用品均应进行无 RNase 处理 而且操作要严 格 杂交后可以不 必如此要求 5 预杂交液的配方多种多样 作者经验表明 上述预杂交 液容易配制 可用于放射性和非 放射性标记的 DNA 探针杂交 三 核 酸酶保护分析法 该方法是近年来发展起来的一种新的 RNA 检测方法 它基于一种 液相杂交方法 即被检测 RNA 链与均一分子的单链探针 放射性标记 在试管中 进行杂交 然后 用适当的单链核酸酶 S 1 核酸酶 RNA 酶 A 和 T 1 水解掉未杂交的单链核酸 电泳分离 后 通过放射自显影检测未被水解 被保护 的双链杂交体 与 Northern 分析法相比 核酸酶保护分 析法不 需要固相支持膜 所以操作简便 杂交质量也不受 RNA 转移效率和洗膜条件的影响 而且 信 噪比大大提高 其检测的灵敏度比前者提高 10 倍以上 此外 还能精确定量被检 RNA 核酸酶保护分析法对 RNA 样品的纯 度和完整性要求不高 样品可以用细胞总 RNA 即使轻度降解 也 不影响检测结果 采用的探针通常是单链 的 但必须完全均一的 DNA 或 RNA 分子 单链 DNA 探针通常采用 M 13 噬菌体系统 掺入同位素标记 的一种 dNTP 来制备 或者采用末端标记来制备 RNA 探针一般采用体外转录系统 掺入同位素标记的一种 rNTP 来制备 如前所述 1 RNA 酶保护分析法 RNase protection assay RPA 本方法所采用的探 针 是单链 RNA 它比 DNA RNA 杂交体稳定得多 杂交后加入适量 RNA 酶 A 和 T 1 它们专一性地水解未形 成杂交体的单链 RNA 而探针与被检 RNA 杂交后形成的双链 RNA 则被保护 电泳分离后 通过放射自显影显 示杂交信号 此方法甚为敏感 可以检测每个细胞中 1 5 个 RNA 拷贝 操作过 程如下 取 5 l RNA 样品 含量取决于被检 RNA 的丰度 可 0 5 150 g 置冰浴 加 入 25 l 杂交液 80 去离子化甲酰 胺 0 4 mol L NaCl 40 mmol L PIPES pH6 4 1 mmol L EDTA pH8 5 稀释的同位素标记 RNA 探针 约 1 10 5 cpm 混匀并离心 95 变 性 3 分钟后立即置 42 50 水浴中杂交过夜 12 16 hr 加入 300 l RNA 酶消化 液 300mmol L NaCl 10mmol L Tris HCl pH7 4 5mmol L EDTA pH7 5 20 g ml R NA 酶 T 1 40 g ml RNA 酶 A 于 37 温育 30 分钟 加 20 l 10 SDS 10 l 10mg m l 蛋白酶 K 于 37 温育 30 分钟 加 2 l 10mg ml 酵母 tRNA 酚 氯仿抽提 乙醇沉淀 用 10 l 电泳上样液 80 甲酰胺 10mmol L EDTA pH8 0 0 1 二甲苯兰 FF 0 1 溴酚兰 溶解 95 变性 3 5 分钟 立即冰浴 于适当浓度的 8mol L 尿素变性聚丙 烯酰胺凝胶中电泳分离 最后放射自显影 判定结果 2 S 1 核酸酶保护分析法 此方法类似于 RPA 只是所用的探针是单链 DNA 一般不用双链 DNA 探针 所用的酶是 S 1 核酸酶 它能降解单链 DNA 或 RNA 而 RNA DNA 杂交体则被 保护 操作过程如下 取 0 5 150ng 样品 RNA 乙醇沉淀后 重溶于 30 l 杂交液 见 RPA 加入 1 10 5cpm 单链 DNA 探针 95 变性 3 分钟 立即置 52 水浴过夜 加入 300 l 冰预冷的 S 1 核酸酶溶液 0 2 8mol L NaCl 0 05mol L 乙酸钠 pH4 5 4 5mmol L ZnSO 4 1000 单位 ml S 1 核酸 酶 37 水浴 30 分钟 加入 75 l 终止液 2 5mol L 乙酸胺 50mmol L EDTA 2 l 10mg ml 酵母 RNA 乙醇沉淀 用 10 l 上述电泳上样液溶解 95 变性 3 分钟 立即冰浴 如上述电泳 和放射自显影 四 核酸原位杂交 所谓 原位杂交 就是保持组织与细胞形态的完整性 用核酸 探针直接检测细胞内的靶核酸序列 它可以检测和精确定位胞浆内或细胞器上 胞核内或染色体上的各种 靶核酸序列 该方法不需 要从组织细胞中提取核酸 对细胞中含量极低的靶序列有较高的敏感性 原位 杂交是可以用于病毒感染检测的另一方法 它能检测细胞中病毒核酸的复制与表达以及病毒的传播 并对 细胞中的病毒核酸进行定位 它能鉴定感染细胞中病毒基因的整合以及染色体上的整合位点 应用该方法 还能检测持续感染个体中何种组织含有病毒 除了必须对组织细胞进行固定 以保持原来的形态外 原位 杂交与普通杂交方法没有大的区别 对组织细胞固定的好坏直接影响杂交的效果 所以用于核酸原位杂交 的固定液必须 理化 性质稳定 能很好保持细胞形态的完整 对核酸无修饰和降解作用 并维持其在 细胞内的 定位 不阻碍探针与靶核酸的杂交 不引起杂交本底过高 符合此条件的理想的固定液有 10 甲醛 4 多聚甲醛 戊二醛和乙醇 冰乙酸 3 1 等 其中 4 多聚甲醛最为常用 病毒单链 RNA 原位杂交 的基本方法如下 将组织切片附于清洁的无核酸酶污染的载玻片上 或取 2 3 滴分散的细胞悬液直接 滴于载玻片上 室温干燥 用 4 新鲜配制的多聚甲醛 PBS 配 室温下固定 20 分钟 PBS 洗二次 不 同浓度 30 60 80 95 100 乙醇梯度脱水 切 片或涂片置于 100 乙醇中 20 保存备用 用 1 g ml 蛋白酶 K 溶于 0 1mol L Tris HC l pH8 0 50mmol L EDTA 于 37 消化 30 分钟