干旱胁迫对小麦生理生化指标的影响.doc

2013-2014学年上学期植物生理学实验科技论文题目干旱胁迫对小麦生理生化指标的影响姓名曾克英学号114120243院、系生命科学院学院专业应用生物教育（A）班二0一三年六月干旱胁迫对小麦生理生化指标的影响曾克英（11级应用生物教育（A）班，学号114120243）摘要： 本实验选用小麦种子作为实验材料， 测定其抗旱指标并对其抗旱性评估， 所有抗旱指标均采用紫外分光光度计测定其在细胞内的含量；实验结果表明， 聚乙二醇模拟干旱对小麦幼苗 脯氨酸、可溶性糖和丙二醛、过氧化氢、抗氧化酶系统、 谷胱甘肽、ASA 含量均明显增加， 表现出不同程度的抗旱效应。 关键词： 小麦； 干旱胁迫； 发芽率； 生理生化指标Abstract: This experiment selects the wheat seeds as experiment material，determination of the drought index and the drought resistance evaluation,drought indexes are all using uv spectrophotometer to determine the content of its inside cells；The experimental results show that the drought of polyethylene glycol wheat seeding proline，soluble sugar and malondialdehyde,hydrogen peroxide,antioxidant enzyme system，glutathione,ASA content were significantly increased，showed different degrees of drought resistance effect.Keywords: wheat； drought stress；germination rate； physiological and biochemical index 在各种非生物环境胁迫因子中，干旱是导致作物产量下降最主要的环境胁迫因子。干旱对作物产量的影响在各种非生物的环境胁迫因子中占首位，仅次于生物胁迫即病虫害所造成的损失。据统计，全球干旱、半干旱地区约占土地总面积的36%，占耕地面积的43%（陈善福，1999）。在我国，干旱和半干旱地区约占国土面积的1/2，尤其是在我国的西部地区和北部地区，年降水量少，且季节分配不均，受到严重的干旱胁迫，这也是造成西部经济滞后的一个重要原因之一。干旱不仅引起作物减产并且致使生态环境日益恶化，引起生态危机。目前由于干旱引起的河流干涸、土地沙化、沙尘暴频发、湖泊湿地萎缩、草地退化、森林锐减、生物量和生物多样性急剧下降等一系列生态环境问题，已经严重威胁到人类社会的可持续发展，并引起了全社会的关注。干旱作为影响植物正常代谢和生长发育的最主要的非生物胁迫因子之一，对我国的农业发展、生态环境建设和城市绿化建设造成严重的阻碍。干旱在我国普遍发生，我国每年由于缺水造成国民经济损失达2000多亿元。因此，研究植物的抗旱机理，提高植物的抗旱能力、培育干旱耐受性的植物新品已经成为当前农业生产中的一个迫切问题。1 材料与方法1.1实验材料的选取和培养 各取50粒吸胀的玉米种子和小麦种子， 沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半粒）， 进行下列实验： 其中50个半粒进行TTC染色（30水浴 20 min） 另50个半粒进行曙红染色（室温染色10 min） 根据两种方法的染色情况， 分别计算发芽率。 选取多粒同品系且饱满的小麦种子， 先用0.1% HgCl2消毒10 min后， 再用蒸馏水漂洗干净， 用蒸馏水于26下吸涨12 h， 播种在两个垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘（24cm16cm）中 ， 计算发芽率（注意与前面结果比较）； 挑选出长势一致的小麦苗做以下处理（去除较矮小或较高幼的小麦苗）。 1.2干旱胁迫处理 把上述小麦幼苗分成实验组和对照组， 将实验组用PEG溶液浇灌处理； 对照组小麦苗仍然用蒸馏水浇灌继续培养。 处理结束后， 把小麦幼苗转移到26下恢复培养7天， 每天光照12h， 观察对比实验组和对照组小麦苗生长差异变化情况。 1.3测定抗逆指标含量1.3.1测定抗逆指标脯氨酸（Pro）的含量 运用紫外分光光度法测定。 提取： 分别取0.1 g实验组和对照组的小麦胚芽鞘， 加入3 mL 3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂， 充分研磨后用2 mL 3% SSA冲洗研钵， 用离心机5000 rpm离心10 min ， 取其上清液并记录体积。 测定： 取上清液各2 mL， 分别加入2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮试剂， 水浴煮沸15 min， 冷却后再5000 rpm离心10 min（若没沉淀可略此步骤）， 分别测定A520。 Pro content = (mmol.g-1FW)1.3.2测定抗逆指标可溶性糖和丙二醛（MDA）的含量 运用紫外分光光度法测定。 提取： 分别取0.1 g实验组和对照组小麦苗， 加入3 mL 10%TCA和少许石英砂， 充分研磨后用2 mL 10%TCA洗研钵， 5000 rpm离心10 min， 取其上清液并记录体积。 测定： 分别取上清液各1mL， 加入0.6%TBA（用10%TCA配制） 3mL， 水浴煮沸15 min， 冷却后用离心机5000 rpm离心5 min （视沉淀有无）， 分别测定OD450和OD532。 OD450=C185.4 OD532=C17.4+15500C2求解方程得： C1/(mmol/L)=11.71OD450C2/(umol/L)=6.45OD532 - 0.56OD450公式中C1为可溶性糖的浓度； C2为MDA浓度。 1.3.3测定抗逆指标H2O2的含量 运用紫外分光光度法测定。 提取： 分别取0.1 g实验组和对照组， 加入3mL 0.3%三氯乙酸(TCA)和少许石英砂， 充分研磨后用2mLTCA 洗研钵， 用离心机5000 rpm离心10 mi， 取其上清液并记录体积。 测定： 分别取上清液各4mL， 加入0.1%Ti(SO4)2 用20%(v/v) H2SO4配制 0.2mL， 摇匀， 用离心机 5000 rpm离心10 min ， 测定OD410。 H2O2 content = (mmol.g-1FW)1.3.4测定抗逆指标抗氧化酶(POD)的含量 运用紫外分光光度法测定。 提取： 分别取对照组和实验组小麦苗0.1 g作为实验材料，加入少许石英砂和3 ml提取液（50mmol/L PBS, pH6.0,内含0.mmol/ LEDTA, 1%PVP）， 充分研磨后完全转入离心管中， 再用2 ml提取液洗研钵， 5000 rpm离心10 min ， 记录上清液体积 ， 用于测定POD和PPO酶活性。 POD测定： 取POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚， 5 mmol/L H2O2,用PBS溶解）2.95 ml， 加入酶液50 ml（空白调零用PBS取代）， 立即记时， 摇匀， 读出反应2 min时的A470。（记录每分钟的读书，记录四次，最后取平均值） PPO测定： 取PPO反应混合液（ 20 mmol/L邻苯二酚， 用PBS溶解）2.9 ml， 加入酶液0.1 ml（空白调零用PBS取代）， 立即记时， 摇匀， 读出反应 2 min时的A410。（每30S读一次数，读四次，最后取平均值） 以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位（U）， 则： POD activities = (mmol.g-1FWmin-1)PPO activities = (U.g-1FW)1.3.5测定抗逆指标GSH的含量 运用紫外分光光度法测定。 提取： 分别取0.1 g实验组和对照组的胚芽鞘， 加入3mL 5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂， 充分研磨后用2mL 5% TCA洗研钵， 5000 rpm离心10 min ， 上清液并记录体积。 测定： 上清液各1mL (空白用5%三氯乙酸代替) ， 分别加入2 mL0.1M PBS (pH=7.7) 、 0.1mL 2mM DTNB， 然后于 25 下5 min， 测定A412。GSH content = (mmol.g-1FW)1.3.6测定抗逆指标ASA的含量 运用紫外分光光度法测定。 提取： 分别取0.1 g实验组和对照组的胚芽鞘， 加入3 mL 5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂， 充分研磨， 用2 mL 5% TCA洗研钵， 用离心机 5000 rpm离心10 min， 取其上清液并记录体积。 测定： 上清液各0.8 mL (空白用5% TCA代替)， 分别加入0.8 mL 0.15 M NaH2PO4 (pH=7.4) 和蒸馏水， 混合均匀， 分别加入 0.8 mL 5% TCA、 44%磷酸和4%联吡啶， 摇匀， 再加入3%FeCl3 0.8 mL， 于37 下 15 min ， 测定A525。 ASA content = (mmol.g-1FW)2 . 结果2.1计算实验玉米的发芽率 随机抽取的50粒玉米种子中， TTC染:有生命活力的有43粒； 曙红染色： 有生命活力的有45粒； 随机抽取的50粒小麦种子中， TTC染:有生命活力的有18粒； 曙红染色： 有生命活力的有21粒； 表一 曙红染色、 TTC法测定小麦、 玉米种子发芽率 *发芽率 （%） 玉米 小麦 曙红染色 90% 42% TTC 染色 86% 36% 注： *占计数种子的百分比。 2.2.计算实验组和对照组小麦中指标含量 记录实验数据并计算各指标含量： 计算含量时， 各指标单位不统一。 测定的Pro含量单位：mmol.g-1FW；可溶性糖含量单位： mmol/L; 丙二醛含量单位： umol/L。H2O2含量单位： mmol.g-1FW； POD活性单位： mmol.g-1FWmin-1；PPO 活性单位： U.g-1FW； GSH含量单位： mmol.g-1FW； ASA含量单位： mmol.g-1FW； 表二 实验小麦指标含量 序号 指标 对照组 实验组 对照组含量 实验组含量 一. Pro（A520） 0.078 2.933 2.89 108.62二. 可溶性糖（OD450）0.020 1.397 0.23 16.35 丙二醛（MDA）* 0.006 0.317 0.03 1.26 三. H2O2（OD410） 0.752 1.398 148.20 275.60四. POD活性 (A470) 0.365 0.613 49.75 83.59 PPO 活性(A410) 0.137 0.210 1086.50 1665.50五. GSH（A412） 0.072 0.274 2.09 5.51六.ASA（A525） 0.011 0.161 0.34 0.50 2.3.实验组和对照组小麦中指标含量结果分析2.3.1.干旱胁迫对小麦幼苗Pro含量变化的影响由表二第一组实验可以看出：干旱胁迫下小麦的脯氨酸急剧增加，正常小麦脯氨酸含量为2.98mol.g-1FW，,而干旱胁迫下小麦的脯氨酸含量为108.62mol.g-1FW，实验组为对照组的36倍，说明小麦在抵抗干旱胁迫时脯氨酸具有十分重要的作用。2.3.2.干旱胁迫对小麦幼苗可溶性糖、 MDA含量变化的影响由表二第二组实验可以看出：干旱胁迫下小麦的可溶性糖、 MDA含量大幅度增加，干旱胁迫下小麦的可溶性糖含量为16.35mmol/L，实验组为对照组的71倍，干旱胁迫下小麦的MDA含量为1.26umol/L，实验组为对照组的42倍，说明小麦在抵抗干旱胁迫时可溶性糖、 MDA具有十分重要的作用。2.3.3.干旱胁迫对小麦幼H2O2含量变化的影响由表二第三组实验可以看出：干旱胁迫下小麦的H2O2含量有所增加，干旱胁迫下小麦的H2O含量为275.60 umol/L，实验组为对照组的1.8倍，说明小麦在抵抗干旱胁迫时H2O2也具有十分重要的作用。2.3.4.干旱胁迫对小麦幼苗抗氧化系统变化的影响由表二第四组实验可以看出：干旱胁迫下小麦的POD、PPO含量也有所增加，干旱胁迫下小麦的POD含量为83.59mol.g-1FWmin-1，实验组为对照组的1.7倍，干旱胁迫下小麦的PPO含量为1665.50U.g-1FW，实验组为对照组的1.5倍，说明小麦在抵抗干旱胁迫时POD、PPO具有十分重要的作用。2.3.5.干旱胁迫对小麦幼苗GSH变化的影响 由表二第五组实验可以看出：干旱胁迫下小麦的GSH含量有所增加，干旱胁迫下小麦的GSH含量为5.51mol.g-1FW，实验组为对照组的2.6倍，说明小麦在抵抗干旱胁迫时GSH也具有重要的作用。2.3.6.干旱胁迫对小麦幼苗ASA含量变化的影响由表二第六组实验可以看出：干旱胁迫下小麦的ASA含量也有所增加，干旱胁迫下小麦的ASA含量为0.50mmol.g-1FW，实验组为对照组的1.47倍，说明小麦在抵抗干旱胁迫时ASA也具有重要的作用。3. 讨论本文以实验室提供的小麦种子作为材料， 在实验室种植， 评估小麦种子发芽率， 并利用PEG模拟小麦干旱胁迫， 通过紫外分光光度计法测定小麦幼苗各生理生化指标综合评价干旱胁迫对小麦生理生化的影响， 实验发现， 干旱胁迫下， 小麦幼苗 脯氨酸、可溶性糖和丙二醛、过氧化氢、抗氧化酶系统、 谷胱甘肽、 抗坏血酸含量均明显增加， 表现出有效的抗旱效应， 说明在干旱胁迫下， 植物能够通过合成自身所需的以上物质来达到抗旱的作用， 而且这些物质可以作为植物抗旱指标来对植株进行抗旱性评价。 正常情况下，植物体内的活性氧的产生和清除处于平衡状态，植物体内产生的过氧化氢（H2O2）可以被过氧化物酶（POD、PPO）等活性氧清除酶以及GSH、ASA等抗氧化剂清除掉。但在干旱生境下，由于光合作用暗反应速度的下降，导致光能过剩并诱发活性氧的积累。在活性氧中，OH可以直接引发膜脂过氧化自由基链式反应，造成膜相分离，破坏膜的正常功能，并且其过氧化产物丙二醛（MDA）的产生和积累会加剧对细胞的毒害，而O2，H2O2等活性氧可以分别通过HaberWeiss反应和Fenton反应等途径转化为OH后诱发膜脂过氧化。脯氨酸是一种有机渗透调节物质， 在干旱胁迫下植物体内会迅速积累脯氨酸。 脯氨酸含量的增高能够降低叶片细胞的渗透势， 防止细胞脱水； 脯氨酸具有很高的水溶性， 可以保护细胞膜系统， 因此脯氨酸积累的多少常作为植物抗逆性筛选的指标,它与植物的抗旱性有密切关系。 本实验表明， 干旱胁迫诱导植株体内渗透调节发生变化， 脯氨酸是改善作物渗透调节能力的重要代谢产物之一。 可溶性糖不仅是植物合成其他有机物的起始物质， 还是植物体内重要的渗透性调节物。MDA是膜脂过氧化重要产物之一，它可以与细胞膜上的蛋白质、酶等结合、交联使之活化，从而破坏生物膜的结构和功能，是有细胞毒性的物质，对许多生物大分子均有破话作用，人们常以MDA作为判断膜脂过氧化作用的一种主要指标。许多研究表明MDA含量与细胞膜相对透性呈正相关。 前人利用不同浓度的外源H2O2处小麦实验结果表明， 外源H2O2理导致小麦中脯氨酸质量分数增加， 即便是较低浓度的H2O2胁迫下也能诱导小麦脯氨酸的积累， 从而缓解活性氧胁迫对植株造成的伤害， 提高小麦对氧化胁迫的适应能力本实验并未提供外源H2O2， 然而模拟