食物中毒性细菌及其检验

食物中毒性细菌及其检验,食品药品学院微生物课程组,内容提要,沙门氏菌检测 大肠菌群及大肠杆菌检测 副溶血性弧菌 小肠结肠炎耶尔森氏菌 志贺氏菌 金黄色葡萄球菌检测 肉毒梭菌 单核细胞增生李斯特氏菌 检测等,食物中毒(food poisoning)是指摄入了含有生物性、化学性有毒有害物质的食品或者把有毒有害物质当作食品摄人后出现的非传染性(不属于传染病)的急性、亚急性疾病。包括食入被污染的食物或腐败变质的食物；饮用含有大量化学毒物或病原微生物的水，或用这种水烹调加工的食物等。,第一节 食物中毒概述,注： 对于摄入非可食状态的食物(未成熟的水果、蔬菜)，非正常数量的食物(暴饮、暴食)，以及某些食物虽可引起疾病，其临床症状与食物中毒类似，但不属于食品中毒的范围。,食源性疾病的概念具有三个基本要素：食物是传播病原物质的媒介、引起食源性疾病的病原物质是食物中的各种致病因子、主要临床症状表现为中毒性或感染性。美国FDA对食源性疾病的定义是指由于食用受污染的食品或者饮料而引起的疾病。WHO则将其定义为“凡是通过摄食 进入人体内的各种致病因子引起的、 通常具有感染性质或中毒性质的一 类疾病”。,食物被某些病原微生物污染进食被毒物污染的食品食物本身含有天然有毒成分摄入外形与普通食物相似，而实际含有毒成分的某些动植物此外，在食品中滥加营养素，对人体也有害食物发生生物性或物理化学性变化而产生或增加了有毒物质,食物中毒的来源,潜伏期短，发病过程急剧所有病人都有类似的临床表现，且多表现为肠胃炎的症状有明显的季节性。夏、秋季多发生细菌性和有毒动植物食物中毒，冬、春季多发生肉毒中毒和亚硝酸盐中毒等。发病率高且集中，人与人之间不直接传染发病与进食同类食物有明显的因果关系,食物中毒的特征,对酶系统的干扰对血红蛋白运氧功能的阻断对神经传导的干扰变态与光毒反应,食物中毒的机理,细菌性食物中毒的致病菌。包括沙门氏菌、致病性大肠埃希氏菌、变形杆菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、椰毒假单胞菌酵米面亚种、单核细胞增生李斯特菌等。在食物中产生大量毒素而引起。包括由黄曲霉毒素、镰刀菌毒素、黄变米毒素、展青霉毒素、杂色曲霉毒素、棕曲霉毒素、交链孢霉毒素等；真菌毒素食物中毒如赤霉病麦面、霉变甘蔗中毒，霉变花生或玉米中毒等。,微生物性食物中毒的类型,第二节 食物中毒性细菌及其检验,I 沙门氏菌属,1880年E. Berth首先发现伤寒沙门氏菌，1885年Salmon与Smith又分离出猪霍乱沙门氏菌，以后取Salmon氏之名为本菌属之名。沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现2300多个血清型我国已发现血清型近200个。它是引起食物感染与食物中毒的重要致病菌，是最常见的食源性疾病的病原微生物。,沙门氏菌属生物学特性,形态特征： 革兰氏阴性，大小为130.40.9m的两端钝圆的短杆菌，无芽孢，一般无荚膜，除鸡沙门氏菌和雏沙门氏菌以外，都有周身鞭毛，运动力强。,培养特性：沙门氏菌需氧或兼性厌氧，10-42 都可生长，最适生长温度为37，最适pH为6.87.8。营养琼脂平板：3537培养1824h，其菌落大小一般为23mm，光滑、湿润、无色、半透明、边缘整齐S.S琼脂：沙门氏菌不分解乳糖，形成无色或浅粉红色、半透明的圆形菌落。产生硫化氢的菌株，菌落中心呈黑色。血平板：中等大小的灰白色菌落。,生化特性：绝大多数沙门氏菌有规律的发酵葡萄糖产酸产气，但也有不产气者，不发酵蔗糖和侧金盏花醇、不产生吲哚、不分解尿素。,沙门氏菌属生物学特性,沙门氏菌属的抗原,菌体抗原（O抗原）表面抗原（K抗原）：Vi抗原和M抗原鞭毛抗原（H抗原）纤毛抗原,引起中毒的必要条件是食物中含有大量活菌.一般来说，当食物中含菌量在105108 cfu/g范围可引起食用者中毒。食入致病力强的沙门氏菌2105cfu/g即可发病，致病力弱的沙门氏菌108cfu/g才可发病。,中毒的原因,中毒的机理,一般来说，当沙门氏菌随食物进入消化道后，可在小肠和结肠内继续繁殖，附于肠黏膜或侵入黏膜下层，引起肠黏膜的充血、水肿、组织炎症，经淋巴系统进入血液，出现菌血症，引起全身感染。,胃肠炎型：最常见，约占75。多由鼠伤寒、猪霍乱及肠炎沙门氏菌引起。多数起病急骤类伤寒型：多由猪霍乱及鼠伤寒沙门氏菌所引起。潜伏期平均310d败血症型：常见的致病菌为猪霍乱或鼠伤寒沙门氏菌。多见于婴幼儿儿童感冒型：霍乱型：可出现严重脱水以至循环衰竭。,中毒的症状,预防中毒措施,沙门氏菌主要来源是患病人和动物(牛、猪、羊、家禽等)的肠 道、血液、粪便、尿液，一般情况下肠道带菌率较高。,防止食品原料和成品被污染控制生长繁殖食前彻底加热杀菌,国标法参看食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验(GB/T 4789.4)。荧光抗体技术、ELISA、单克隆抗体技术等。商品化的生化快速检定系统：如API系统、R/B系统、肠管(enterotube)系统等。其中以API系统应用较为广泛，此外还BAX系统在许多国家用于沙门氏菌的快速检测。,沙门氏菌属-检验方法,API 20E,FDA BAM 沙门氏菌检验流程,前增菌 25g样+225mL乳糖肉汤 （肉制品、肉副产品、动物产品） 匀质2min，室温放置60 5min 混合均匀，测定调节PH6.8 0.2 35、24 2h选择性增菌 0.1ml+10mlMM（RV） 1ml+10mlTTB 42、24h （水浴培养） 35、24h 43、24h（水浴培养） 含菌量高 含菌量低分离培养 划线接种 选择性培养基（BS、XLD、HE） 35、2448h（BS）生化鉴定 每个平板挑取至少2个可疑菌（包括典型和非典型各2个） 接种TSI三糖铁、LIA赖氨酸铁高层斜面（LIA高层深4cm） （松盖以保持有氧条件防止产生过多H2S） 35、242h 弃去 尿素酶试验 卫矛醇、 氰化钾、丙二酸钠、吲哚试验 阳性 阴性血清学 血清学试验沙门氏菌的分类 报告结果,生鲜食物、严重污染的食品和动物饲料,ISO6579 沙门氏菌检验流程,前增菌 25g样+225mLBPW 匀质 371、18 2h选择性增菌 0.1ml+10mlRVS 1ml+10mlMKTTn 41.5 1、24 3h 37 1、24 3h （水浴培养）分离培养 划线接种选择性培养基（XLD和第二种选择性培养基，如 BS） 37、2448h（BS） 每个平板挑取至少5个可疑菌进行纯培养和确认试验 37、243h 生化鉴定 TSI、尿素酶、赖氨酸脱羧酶、-牛乳糖、V-P、 吲哚试验血清学 血清学试验沙门氏菌的分类 报告结果,ISO6579 沙门氏菌生化试验表,沙门氏菌检验选择性分离培养,XLD琼脂：FDA BAM典型菌落：粉色菌落，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可呈 现大的具光泽的黑色中心或几乎为全部黑色的菌落。 非典型菌落：黄色带或不带黑色中心。ISO中心黑色、周围由于指示剂颜色的改变而出现红色的轻微透明带。,沙门氏菌检验选择性分离培养,BS琼脂：FDA BAM典型菌落：产硫化氢菌落黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周 围的培养基通常开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而 变为黑色，并有晕环效应； 非典型菌落：有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色菌落，周围培养 基不变色。,50071 44104,Blank 50115,沙门氏菌检验选择性分离培养,HE琼脂：FDA BAM典型菌落：兰绿色至兰色，多数菌株产硫化氢，菌落带或不带黑色 中心或几乎全黑色。 非典型菌落：乳糖阳性的菌株为黄色中心黑色或全黑色。,沙门氏菌检验生化鉴定,TSI：典型反应：斜面产碱（K）：红色； 底部产酸（A）：黄色； 产H2S：黑色（少数不产）,沙门氏菌检验几点注意,冷冻样品解冻需在45以下，有自动调温器自控的水浴锅内不断搅拌进行15min或在2-8，18小时内软化。为保证检验的准确性，必须在选择性培养基上挑取足够数量的菌落进行生化和血清学鉴定。进行生化反应时，应以纯培养物进行试验，如出现血清学阳性，而生化反应特征不符合时，应对接种物进行纯化，用纯化后的培养物重新进行生化试验。测试中应同时接种阳性对照菌株。,II 致病性大肠埃希氏菌,大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为+-或-+-的细菌。与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。,大肠菌群和大肠杆菌的关系,耐热大肠菌群的定义：能在液体乳糖培养基中35/37 培养48h产酸产气，并在44.5培养24h产酸产气的细菌（依据ISO标准）,卫生学意义,大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。,大肠杆菌的生物学特性,基本形态： 此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。,大肠杆菌的生物学特性,培养特性：大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37，在42-44 条件下仍能生长，生长温度范围15-46 。,在普通营养琼脂上有3中菌落形态： 1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、 光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易 在生理盐水中自凝； 3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。,大肠埃希氏菌的抗原,菌体抗原（O抗原）鞭毛抗原（H抗原）表面抗原（K抗原）：荚膜抗原、被膜抗原、表面抗原,该菌属的抵抗力,本菌在自然界生存力较强。在土壤、水中可存活数月，在寒冷干燥的环境中可存活较久，而在潮湿、温暖的环境中，存活不到1个月。对热抵抗力不强，60加热30min即可被杀死。本菌培养物在室温中可存活数周，如密封者在黑暗室温(2022)中至少能保存1年，冻干菌种置低温(-20以下)至少能活10年。对常用消毒剂抵抗力不强，510漂白粉、3来苏儿、5石炭酸等均能迅速杀死大肠杆菌。对氯很敏感，在含有0.2mg/kg游离氯的水中，即可很快死亡。对强酸和强碱较敏感。,致病因素,多数大肠埃希菌在肠道内不致病，但如移位至肠道外的组织或器官，如尿道、胆道、前列腺、肺、骨和腹腔等其他部位则可引起肠道外感染。肠道外感染以泌尿系统和化脓性感染最为常见。,致病性E.coli引起食物中毒一般与人体摄人的活菌量有关。只有食品中活菌数在107cfu/g以上，才可使人致病。其中毒原因同沙门氏菌。,中毒的原因,中毒的机理,当致病性E.coli进人人体消化道后，ETEC可在小肠内继续繁殖，产生肠毒素。肠毒素吸附于小肠上皮细胞的细胞膜上EIEC可以侵入结肠黏膜的上皮细胞。,中毒的症状,EAEC、EPEC、ETEC、EHEC、EIEC,引起中毒的食品：主要是肉类、乳与乳制品、水产品、豆制品、蔬菜，尤其是肉类和凉拌菜。 污染途径：致病性E.coli主要寄居于人和动物肠道中，随粪便污染。预防中毒措施： 1.防止食品原料和成品被带菌的人和动物，以及污水、不洁的容器和用具等污染； 2.低温冷藏生肉、熟食品和其他动物性食品，一般应置于45低温储藏； 3.食前彻底加热杀菌。,致病性大肠埃希氏菌-检验方法,国标法参看食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验(GB/T 4789.6)。检测大肠杆菌及其肠毒素的新技术、新方法很多。如用K88单抗血清对粪中K88菌检出率比常规培养法提高1倍，最小检测菌量为10 000cfu/mL。987P酶标单抗对粪便和肠内容物最小检出菌量为2 000cfu/mL。对致病性大肠杆菌毒力基因检测，过去多用动物或细胞培养测定，现可用其单抗以多种免疫学手段检出。如用免疫磁分离法检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157：H7，可提高了大肠杆菌O157：H7感染病例的检出率。 据报道，2004年10月，美国佛罗里达大学科学家使用纳米粒子技术，开发出一种新的大肠杆菌检测法，即使样本里只有一个大肠杆菌也能检测出来，整个过程只需要20min。,大肠菌群测定 MPN法检验流程（FDA BAM）,检样50g+450ml稀释液 适当十倍稀释样品选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），每管接种1mL 35 ，24 2h 48 2h 没有产气管 有产气管 报告阴性 接种BGLB肉汤管 接种EC肉汤 35 ，48 2h 44.50.5 （水浴培养） 24 2h 48 2h 查MPN表报告结果 产气管接种EMB平板（35、1824h） （大肠菌群） 从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜 面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接 种LST复检产气 查MPN表报告结果（大肠杆菌）,大肠菌群测定MPN法检验几点说明,MPN检索表： MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进行连续系列稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。初发酵和证实试验： 1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37分解乳糖产酸产气”。 LST中提供了磷酸盐缓冲体系，氯化钠可维持渗透压，月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群的生长，这个缓冲蛋白胨乳糖肉汤允许“缓慢乳糖发酵（Slow lactose fermentations）”来促进菌体产气。BGLB中胆盐和煌绿可以抑制革兰氏阳性细菌和除了大肠菌群的很多革兰氏阴性细菌。 2）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。产气量与倒管： 在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。,大肠杆菌测定EMB选择性分离鉴别,EMB平板典型大肠杆菌菌落特征：中心黑色或紫红色，有或无绿色金属光泽,大肠杆菌测定EMB选择性分离鉴别,EMB是一种弱选择性培养基，一些球菌也可在该培养基上生长；高压灭菌可使得美蓝还原从而使培养基的颜色呈不均一橘黄色，轻轻摇动培养基可以恢复原有的正常紫色，倾注平板前应先摇匀；大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色的金属光泽；该培养基受可见光易使其中的成分氧化，储存及培养细菌时都应在避光条件。,大肠杆菌测定革兰氏染色,基本原理： 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法。1884年由丹麦医师Gram创立。此法可将细菌分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌两大类。 革兰氏染色的机理主要是利用两类细菌的细胞壁成分和结构的不同。革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少。当用酒精或丙酮酸脱色时，类脂质被溶解，增加了细胞壁的通透性，使初染后的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染液的颜色。而革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的含量多而且交联度大，类脂质含量少，经乙醇或丙酮洗脱后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，因此细胞仍保留初染时的颜色。,大肠杆菌测定革兰氏染色,Gram negative,Gram positive,Gram straining,大肠杆菌测定革兰氏染色,基本步骤：将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗；滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脱色约1530s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；滴加番红复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。,大肠杆菌测定生化鉴定,IMViC试验：细菌的生化反应用于鉴别细菌，尤其对形态、革兰染色反应和培养特性相同或相似的细菌更为重要。 吲哚（I）、甲基红（M）、VP（V）、枸橼酸盐利用（C）四种试验常用于鉴定肠道杆菌，合称为IMViC试验。,某些细菌有色氨酸酶，能分解色氨酸形成吲哚； 将对二甲基氨基苯甲醛加入细菌蛋白胨水培养液中，吲哚 与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛结合，呈红色反应，形成 玫瑰吲哚，为吲哚试验阳性。不出现红色则为阴性。,吲哚试验：,产气肠杆菌使丙酮酸脱羧后形成中性产物， 培养液PH5.4，甲基红指示剂呈橘黄色，为甲基红试验阴性，大肠埃希菌分解葡萄糖产生丙酮酸，培养液呈酸性 PH5.4，指示剂甲基红呈红色，称甲基红试验阳性。,甲基红试验：,大肠埃希菌与产气肠杆菌分解葡萄糖，产酸产气，为区分两菌可采用V-P试验及甲基红试验。产气肠杆菌能使丙酮酸脱羧，氧化（在碱性溶液中）生成二乙酰，后者可与含胍基的化合物反应，生成红色化合物，称V-P试验阳性；大肠埃希菌分解葡萄糖产生丙酮酸，V-P试验阴性。,V-P试验：,能利用枸橼酸盐作为唯一碳源的细菌 如产气肠杆菌，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基呈碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝（BTB）由淡绿转为深蓝，此为枸橼酸盐利用试验阳性。,枸橼酸盐利用试验:,I M Vi C生化试验,III 副溶血性弧菌,副溶血性弧菌（ Vibrio parahaemolyticus ）是分布极广的海洋细菌，为引起食物中毒重要的病原细菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常发生由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。 历史：副溶血性弧菌食物中毒于1950年在日本首发，副溶血性弧菌（V. parahemolyticus）于我国大陆沿海地区食物中毒中最常见的一种病原菌。,菌体形态学特征 本菌为G-弯曲的球杆菌，或呈弧菌，可两端浓染 ，多形态，无芽孢，单端单鞭毛，有嗜盐特性，在30-37最适温度时增长较快，一般冬季不易检出。,多形态： 弧状、逗点状 球状、丝状、 杆状、棒状等。,54,培养特性 嗜盐：VP 在含氯化钠5 (20-30最适) g/L的培养基 上生长，无盐和110g/L以上不生长。 生长温度：最适为37，4 不生长 pH: 最适pH为7.4-8.0 需氧性: 需氧性很强， 厌氧条件下生长缓慢,55,培养特性在液体培养基中，呈现浑浊，表面形成菌膜，R型菌发生沉淀。在固体培养基上的菌落通常为隆起，圆形，稍浑浊，不透明，表面光滑湿润，传代之后常出现不圆整、粗糙型菌落，或灰白色半透明或不透明的菌落。 S.S平板：菌落中等大小，1-2mm圆形，扁平，无色透明的黏性菌落，不易被接种环挑起。氯化钠蔗糖琼脂：菌落l-2mm，稍隆起，浑浊、无黏性、湿润、中心绿色的菌落，具有扩散性菌落是本菌的一个生长特点。伊红美兰琼脂：某些菌株在麦康凯上生长，生长的菌落呈圆形，平坦、半透明或浑浊，略带红色。3.5食盐琼脂平板：3724h培养多呈蔓延状生长，菌落的边缘不整齐，圆形，隆起，稍浑浊、不透明、表面光滑湿润。如培养基中含有胆酸盐则能对细菌的蔓延有一定的抑制作用。细菌在生长过程中形成色素。,生化特性,副溶血性弧菌能分解发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、淀粉和阿拉伯胶糖，产酸，不产气。不能发酵乳糖、蔗糖、纤维二糖、木糖、卫矛醇、肌醇、水杨苷。产生靛基质，液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐。过氧化氢酶和卵磷脂酶为阳性，尿素酶为阴性，V-P试验为阴性，不产生硫化氢，能分解淀粉和酪蛋白，甲基红试验阳性，对弧菌抑制剂三氨基二异丙基喋啶敏感。,57,抵抗力 敏感：淡水等无盐环境 不耐热 对酸敏感，在2冰醋酸或食醋中立即死亡， 对氯、碳酸、来苏水等一般化学消毒剂敏感： 对磺胺噻唑、氯霉素、合霉素敏感。 耐受：耐高浓度NaCl海水，盐渍酱菜中存活时间较长； 耐低温的抵抗力较强 耐青霉素、磺胺嘧啶。,中毒原因: 食入了含有106cfu/g 以上的致病性活菌 和一定量溶血毒素的食品。烹调时未 烧熟、煮、透,或熟制品污染后未再彻 底加热。 中毒食品: 副溶血性弧菌食物中毒多发生在海产 品大量上市时。中毒食品主要是海产品, 其次为咸菜、熟肉类、禽肉、禽蛋类, 约有半数为腌制品。,中毒的机理：活菌进入肠道侵入黏膜引起肠黏膜的炎症反应，同时产生Vp-TDH，作用于小肠壁的上皮细胞，导致消化道症状，毒素进一步由肠黏膜受损部位侵入体内，与心肌细胞表面受体结合。该菌食物中毒是致病菌对肠道的侵入和溶血毒素协同作用所致，是一种混合型食物中毒。中毒症状：潜伏期一般11-18h。表现为急性胃肠炎症状。主要病变在十二指肠、空肠和回肠上部。一般病后3-5d痊愈，死亡率很低。少数重症者出现严重腹泻脱水而虚脱，呼吸困难、血压下降而休克，如抢救不及时可死亡。,污染途径 海水、海产品、海盐、带菌者是污染源。预防中毒措施 防止食品被污染 最好不食用生或半熟的海产品 食前彻底加热杀菌 控制细菌繁殖,61,检验程序：副溶血性弧菌的检验多采用国标法(GB/T 4789.7),25g样品+3%氯化钠碱性蛋白胨水,TCBS平板,36 1 18h,1、镜 检 3、三糖铁试验2、氧化酶试验 4、嗜盐试验,报告结果,定性检测,36 1 24h,36 1 24h,36 1 6h,科玛嘉弧菌平板,生化实验 API 20 E,62,培养基和试剂3%氯化钠碱性蛋白胨水： 增菌用，高盐 TCBS琼脂： 科玛嘉琼脂：,分离培养用,63,范围,本标准规定了副溶血性弧菌检验方法。 本标准适用于动物性水产干制品、腌醉制生食动物性水 产品、即食藻类食品、鱼糜制品等水产食品和水产调味 品以及食物中毒样品中副溶血性弧菌的检验。,64,TCBS上的副溶血弧菌菌,科玛嘉上的副溶血弧菌菌落,65,初步鉴定 3.5氯化钠三糖铁琼脂：底层 变黄，斜面不变色，有动力， 不产生硫化氢.镜检形态：本菌为G-，可两端 浓染 ，多形态，无芽孢。氧化酶试验：VP为氧化酶阳性。嗜盐性试验：0%不生长 7%旺盛生长 10%不生长,66,ONPG试验：甘露醇试验：赖氨酸试验：MR-VP试验：,生化试验,67,结果 样品经过增菌培养、分离培养后，根据形态观察、生化试验的结果判断是否发现副溶血性弧菌并报告。,IV 小肠结肠炎耶尔森氏菌,小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)是国际上引起重视的人、畜共患病原菌之一，也是一种非常重要的新的食源性病原菌。本菌在04仍能继续繁殖，并产生毒素，如在4下能存活18个月。因此，冰箱内存放的污染食品对人仍具有感染性。耶尔森氏菌属包括11个种，其中对人有致病性的有三种：小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核菌和鼠疫菌。只有小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核菌已确定是食源性病原体.一般说小肠结肠炎耶氏菌即是指典型小肠结肠炎耶尔森氏菌。,短小、卵圆形或杆状的革兰氏阴性杆菌在陈旧培养物呈多形性，普通碱性染料易着色，美蓝染色可显示两极浓染。,形态及染色特性,本菌为需氧和兼性厌氧菌，最适生长温度2530。最适生长pH为7.27.4。在普通培养基上均能生长，对胆盐、煌绿、结晶紫、孔雀绿及氯化钠均有一定耐受性。普通琼脂：菌落呈圆形，光滑，稍隆起，透明或半透明普通肉汤：呈均匀浑浊，偶有薄膜或少量沉淀物麦康凯琼脂：菌落呈圆形，光滑，透明或半透明，略扁平，淡粉色，S.S琼脂：菌落呈圆形，光滑，稍突起，略呈浅橘红色，或淡粉色,生长要求与培养特性,生化特性不稳定，培养在25和37的反应结果有差异，能发酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖、山梨醇。尿素酶阳性，鸟氨酸脱羧酶阳性，-半乳糖苷酶阳性、MR试验阳性，V-P试验(22)阳性，V-P试验(37)阴性，不分解乳糖、鼠李糖。苯丙氨酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、H2S阴性，不利用柠檬酸盐。,生化特性,本菌对热敏感，6030min，651min即可杀死。牛乳中的耶氏菌通过巴氏灭菌不能完全被杀死。对低温有较强的耐受性，在4下可活存18个月，在-20-18冷藏肉的保藏过程中，菌数明显减少。本菌对抗生素的敏感性不定，但对青霉素、红霉素、先锋霉素、氨苄青霉素不敏感。 辐射对本菌有一定的杀灭作用。,抵抗力,该菌可寄生于所有恒温动物，引起出血性败血症；该菌有侵犯中胚层性细胞的倾向，一般表现为淋巴腺鼠疫和肺鼠疫的发生。肠毒素：该菌能产生耐热性肠毒素，但肠毒素的产生仅限于2225；侵袭性：Hela细胞感染阳性株多是人类致病常见血清型；自凝性：菌接种于10小牛血清的组织培养液内，22培养，菌液浑浊，而37培养，细菌凝结，上层液体透明，即为有毒力的菌株，称为自凝阳性。VW抗原：在25生长时不需要钙的菌株即含VW抗原。毒性质粒：耶氏菌病和小肠结肠炎耶尔森氏菌带有4148Mu的质粒有关。,致病因素,主要原因是食入了具有侵袭力的活菌及其肠毒素食品，尤其是冷藏食品食用前未彻底加热杀菌，引起中毒。潜伏期35d主要症状是胃肠炎，以小肠、结肠炎为多见，腹痛，腹泻多为黏液或水样便，头痛，体温3839.5。此外，引起腹膜炎、结节性红斑、反应性关节炎、肠系膜淋巴结炎和败血症等。,中毒的原因与症状,主要通过污染食物(猪肉、牛肉、牛奶等)和水源引起感染。主要存在于乳与乳制品、蛋制品、肉与肉制品、豆腐及其制品、海产品和蔬菜等。据检测，猪比其他动物，如牛、羊、鸡、鸭、鹅等带菌率高，猪是此菌的主要宿主。,引起中毒的食品及传播途径,防止食品被污染食前加热杀菌。加强卫生宣传。检验方法,预防中毒措施,V 志贺氏菌,志贺氏菌属(Shigella)是人类及灵长类动物细菌性痢疾(简称菌痢)最为常见的病原菌，俗称痢疾杆菌(dysentery bacterium)。,形态及染色特征： 革兰氏阴性短小杆菌，无芽孢，无荚膜，有菌毛,志贺氏菌-生长要求及培养特性,需氧或兼性厌氧菌，对营养要求不高 普通琼脂：菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色半透明、边缘整齐；宋内志贺氏菌菌落一般较大，不很透明。S.S琼脂：菌落形态和沙门氏菌相似，为无色、半透明、中等大或较小的菌落，边缘整齐、光滑、稍隆起。由于志贺氏菌不产生硫化氢，故在S.S琼脂培养基上的菌落中心不形成黑色。普通肉汤：呈均匀浑浊生长，无菌膜,志贺氏菌-生化特性,本菌属都能分解葡萄糖，产酸，不产气，均不分解乳糖宋内志贺氏菌个别菌株迟缓发酵乳糖甲基红试验阳性，V-P试验阴性，不分解尿素，不产生H2S，对甘露醇的分解和产生靛基质的能力因菌种而异,志贺氏菌-抵抗力,志贺氏菌属对外界环境中的各种因素抵抗力不完全一样。以宋内志贺氏菌最强，福氏志贺氏菌次之，痢疾志贺氏菌最弱；志贺氏菌属对理化因素抵抗力较弱，志贺氏菌属对酸敏感 ；引起水源型或食物型的暴发流行；志贺氏菌对各种消毒剂敏感；一般50、15min，60、10min及阳光照射30min均能杀死志贺氏菌。,志贺氏菌-致病因素,菌毛的作用使菌黏附于回肠末端和大肠黏膜的上皮细胞，继而在侵袭蛋白作用下穿人上皮细胞内；内毒素：志贺氏菌属中各菌株都有强烈的内毒素。内毒素作用于肠壁外毒素：该毒素具有3种生物活性：神经毒性，细胞毒性，肠毒性。,传染源：食物、病人、粪便和苍蝇等。中毒的机理与症状：菌随食物进入胃肠后侵入肠黏膜组织，生长繁殖。当菌体破坏后，释放内毒素，作用于肠壁、肠黏膜和肠壁植物性神经，引起一系列症状。,引起中毒的食品和传播途径 ： 主要是水果、蔬菜、沙拉、凉拌菜、肉类、乳类及其熟食品。预防中毒措施： 与小肠结肠炎耶森氏菌食物中毒相同。主要措施包括加强食品卫生管理，严格执行卫生制度，加强食品从业人员的肠道带菌检查。,志贺氏菌-检验方法,目前志贺氏菌检验多采用国标法(GB/T 4789.5)。,VI 金黄色葡萄球菌概述,根据伯杰氏鉴定细菌学手册，按葡萄球菌的生理化学组成，将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)和腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)，其中金葡多为致病性菌，表葡偶尔致病。金黄色葡萄球菌是人类化脓性感染中最常见的病原菌。可引起局部化脓性感染，如疖、痈、皮下脓肿、外科切口及烧伤创面的感染；也可引起肺炎、伪膜性肠炎、肾盂肾炎、心包炎等多系统的化脓性感染；还可引起败血症、脓毒症等全身性感染。葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶。,金黄色葡萄球菌生物学特性,金黄色葡萄球菌呈球形，直径0.8m左右，排列成葡萄串状 ，无芽孢，无荚膜。,革兰氏染色阳性，但衰老、死亡或被白细胞吞噬的菌体，常呈革兰氏阴性。,金黄色葡萄球菌生长特性,金黄色葡萄球菌在肉汤中呈浑浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈浑浊生长。,血平板上金黄色葡萄球菌呈金黄色，有时也为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。,Baird-Parker平板上金黄色葡萄球菌圆形突起、光滑、湿润，颜色呈灰色到黑色，边缘淡色，周围为一浑浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度。,金黄色葡萄球菌检验方法适用性,MPN法：适用于检测带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的含少量金黄色葡萄球菌的食品。直接平板计数法：适用于检查金黄色葡萄球菌数不小于10/g（ml）的食品增菌培养法：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。,定量方法,定性方法,金黄色葡萄球菌检验直接平板计数法,检样（50g+450mL稀释液） 适当十倍稀释样品 选择23个连续适宜稀释度 吸取1ml菌液按照0.3mL、0.3mL、0.4mL分别涂布于 3块90mmBaird-Parker平板上（做平行试验） 35 ，4548 h 确证试验 报告,或涂布于1块140mm平板上,FDA BAM 金黄色葡萄球菌检验MPN法,检样（50g+450mL稀释液） 适当十倍稀释样品 选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管10% NaCl TSB肉汤，每管接种1mL 35 ，48 2 h 从生长的管中接种1环划线于 Baird-Parker平板上 35 ，48 h 确证试验 报告,含1%丙酮酸钠,FDA BAM 金黄色葡萄球菌确证试验,1.凝固酶试验方法：从平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落，移种到TSB/BHI肉汤中，置35培养18-24h。取肉汤培养物0.3mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆充分混合，置35培养，定时观察是否有凝块形成，至少观察6h。 试验中需同时做已知阳性和阴性对照。结果判定：以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流动为阳性。部分凝固（2+和3+）的必须进行生化鉴定加以证实。,FDA BAM金黄色葡萄球菌确证试验,2.革兰氏染色对所有的可疑培养物都要进行革兰氏染色。3.生化鉴定过氧化氢酶试验葡萄糖厌氧利用试验甘露醇厌氧利用试验金葡溶菌酶敏感性试验耐热核酸酶试验（辅助）,Staphylococcus aureus on DNase Agar,FDA BAM 2种葡萄球菌和微球菌的典型特性,ISO 金黄色葡萄球菌检验MPN法,检样（xg+9xmL稀释液） 适当十倍稀释样品 选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管modified Giolitti and Cantoni broth， 37 ，2448 h 从变黑或出现黑色沉淀的管中 接种1环培养物于 Baird-Parker平板上 37 ，48 h 确证试验 报告,接种10mL 于10mL双料肉汤，接种1mL 于9mL单料肉汤。,小心的于接种管中培养基顶部倾注一定量的水琼脂，使其凝固形成密封塞。,ISO 金黄色葡萄球菌确证试验,凝固酶试验结果判定： - 1+ 2+ 3+ 4+,negative p