兽用疫苗保护剂和佐剂

兽用疫苗冻干保护剂和佐剂,冻干保护剂（稳定剂）保护剂：又称稳定剂（stabilizer） ，是指一类能防止生物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（指对疫苗生产、血清制备等）保护剂用途（不同用途加不同保护剂, 主要针对活的微生物或细胞） 菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂 细胞株保存：常用二甲基亚砜(DMSO) DMSO:二甲基亚砜，一种细胞的保护剂 疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳（或二甲基亚 砜）和蔗糖等（不同国家有不同配方） 干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖,保护剂（protector）的分类,分类：（根据其作用机理）渗透剂：如二甲基亚砜（DMSO）、甘油和蔗糖等非渗透剂：如聚乙烯吡咯啶酮(PVP)和蛋白质等（根据其分子量大小）高分子物质、低分子物质。（按其化学性质）复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物,复合物 脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等糖类 蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等盐类 乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等醇类 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等酸类 柠檬酸、酒石酸、氨基酸等聚合物 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等,一些常用的冷冻干燥保护剂,分 类 保 护 剂,疫苗冻干保护剂组成1. 营养液： 可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分； 可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状， 增加溶解度2. 赋形剂： 防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响 使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度3. 抗氧化剂： 抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存期间的稳定性，如维生素C、维生素E和硫代硫酸钠等。, 防止活性物质失去结构水及阻止结构水形成结晶而导致生 物活性物质的损伤； 降低细胞内外的渗透压差、防止细胞内结构水结晶，以保 持细胞的活力； 保护或提供细胞复苏所需的营养物质，有利于生活力的复 苏和迅速修复自身。,冻干保护剂作用机制,二、影响保护剂效能的因素 1、保护剂种类: 根据微生物种类或者用途来添加不同种 类保护剂。、保护剂浓度：严格按照配方执行。、保护剂配制方法：糖类不能用121高压灭菌处理。、保护剂酸碱度（PH值）：主要对M的影响。,三、常用的冻干保护剂（稳定剂） 明确不同种类微生物需要添加不同保护剂（一）细菌的保护剂 需氧或兼氧厌氧菌：蔗糖脱脂乳或蔗糖、 1.5明胶； 厌氧性细菌：含1.5谷氨酸钠的乳糖或10脱 脂乳或7.5葡糖血清。 注：脱脂乳：20脱脂奶粉溶于水配制而成。（二）病毒的保护剂 5%蔗糖 脱脂乳； 马立克814活细胞疫苗:保存液氮.稳定剂为10%二 甲基亚砜和50%犊牛血清的199液。 注意: 微生物保护剂缓冲液的组成比例，不同厂家有 不同的配方。,15%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂 蔗糖（或乳糖）5g，加脱脂乳至100ml，充分溶解后，110116高压灭菌3040 min。 2明胶蔗糖保护剂明胶2%3%（g/m1）、蔗糖5%（g/m1）、硫脲 1%2%（g/m1）。先将12%18%明胶液、30%蔗糖液和6%12%硫脲液加热溶解，116高压灭菌3040min； 3SPGA保护剂,兽医生物制品常用的保护剂,蔗糖 76.62g、磷酸二氢钾0.52g、磷酸氢二钾1.64g、谷氨酸钠0.83g、牛血清白蛋白10g、加去离子水至1000ml，混合溶解，过滤除菌。,免疫佐剂,一、佐剂概念与作用机理1. 佐剂（新概念）：凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质称为佐剂。 佐剂（旧概念）：当一种物质先于抗原或与抗原混合或同时注射于动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答,发挥其辅佐作用的物质. 以前作为佐剂使用时没有免疫原性，但现在有所改变，如IL-2是佐剂和IL-8一类细胞因子佐剂却不一样, 具有免疫调节和免疫增强作用,单独使用时却具有免疫原性。注意:佐剂和免疫增强剂的关系? 有时佐剂也是免疫增强剂.,作用特点： 明显增强抗原性微弱的物质诱导机体产生 特异性免疫应答。 用最少的抗原和最少的接种次数，产生足 够的免疫应答。,免疫佐剂作用机理, 改变正常免疫机能，吸引大量巨噬细胞以吞噬抗原； 改变抗原的构型，使抗原物质降解，并加强其免疫原性； 延长抗原在组织内的贮存时间，使抗原缓慢降解和缓释， 并发挥免疫系统的细胞间协同作用（巨噬细胞与T细胞， T细胞与B细胞）。,作用方式, 抗原递呈（antigen presentation） 抗原寻的（antigen targeting） 免疫调节（immune modulation）,作用机理,抗原递呈： 指抗原分子递呈给T细胞的方法。佐剂与疫苗联合使用，有助于抗原性物质在胞内被加工，被MHC分子特异性的结合、保护、运输并递呈给效应细胞。,抗原寻的（antigen targeting） 指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。包括吸引巨噬细胞到达组织部位、活化吞噬细胞、促进抗原与细胞受体的结合等有重要作用。,免疫调节（immune modulation） 是指任何可以修饰的免疫效应细胞对抗原或表位进行加工的机制。通过这种机制，可以改变特异性免疫应答的本质或强度。T细胞有Th1和Th2两个亚类。同一抗原和不同佐剂一起使用能够引起不同的免疫反应。因此，通过筛选特定的佐剂，可以达到诱导正确的免疫应答的目的。,1. 按佐剂物理性质 颗粒型佐剂 非颗粒型佐剂2. 按佐剂的生物学性质（即Ballanti分类法） 微生物及其组分 非微生物物质3. 按佐剂在体内存留的时间 贮存型佐剂（depot type adjuvant） 非贮存型（non-depot type adjuvant）,佐剂的分类,（一）颗粒性佐剂1盐类佐剂 氢氧化铝胶、明矾、磷酸铝等。2油水乳剂佐剂 弗氏完全佐剂（Freunds complete adjuvant, FCA）、弗 氏不完全佐剂（ FIA）和矿物油白油佐剂。3免疫刺激复合物佐剂（ISCOM）4蜂胶佐剂（propolis）5脂质体佐剂（liposomes）。6其他：MF59佐剂、微囊化佐剂（micro-encapsulation)、 硬脂酰酪氨酸佐剂和菊粉等。,（二）非颗粒性佐剂1肽类佐剂（peptides）：胞壁酰二肽（MDP）及其衍生物、 去胞壁酰多肽、脂肽和免疫调节多肽。2表面活性分子类佐剂：海藻糖合成衍生物（TDM）3核酸及其衍生物类佐剂：合成核苷酸聚合体、CpG 4含硫复合物类佐剂：左旋咪唑5碳水化合物高分子类佐剂：香菇多糖、DEAE-葡聚糖6细胞因子类佐剂（cytokine）：IL-2、IL-4和-IFN等。7脂质分子类佐剂：脂多糖、Vit A和Vit E等脂溶性维生素8其他：霍乱毒素（CT）、百日咳毒素（PT）和破伤风类 毒素（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；维生素B12等。,合成方法: （1）用铝粉加烧碱合成法 2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4Al2(SO4)318H2O A12(SO4)318H2O+6NaOH2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O（2）用明矾加碳酸钠合成法 2 KAl(SO4)2+3 Na2CO3+3H2O2Al(OH)3+3Na2SO4+3CO2 （3）用三氯化铝与氢氧化钠合成 A1C13+3NaOHAl(OH)3+3NaCl,氢氧化铝胶 (铝胶）,用铝粉加烧碱合成法： 2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4Al2(SO4)318H2O A12(SO4)318H2O+6NaOH2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O,用铜纱筛滤过，用布袋脱水过夜，收存于容器内，可约得600kg铝胶。,取氢氧化铝干粉5055kg，加入6万毫升沸水中，搅拌均匀;倒入硫酸100kg，爆沸至棕褐色，经3060min后，加温水，边加边搅拌约至总量为35万毫升；用前加水稀释至100万毫升，温度约为80，盛装在一个缸内,另一缸盛80kg烧碱，加水至100万毫升，加温至75,两液等量逐渐流入另一耐酸搪瓷缸内，蒸汽吹沸熟化10min，调节pH 6.9土0.1，继续熟化3min，稳定pH 6.9土0.1,静置沉淀，弃上清后加入约5倍量软化水，搅拌洗涤、弃上清，如此35次，检查至硫酸盐合格为止。, 氢氧化铝吸附力较强，所以要用软化水或去离子水洗涤。 氢氧化铝胶为两性化合物，过酸或过碱都会失去胶态。故要 掌握好化合时的pH值。 贮存铝胶应放在耐酸搪瓷缸或耐酸池中，严密封盖，贮放期 不超过3个月。 铝胶室温保存，以免破坏胶态。,注意事项,是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。 该类佐剂主要在抗原寻的过程中起作用，使抗原在注射部位保持稳定，为抗原在淋巴系统中转运提供载体，增加单核细胞的形成和积聚。油乳剂疫苗的免疫效力高低，直接与乳化作用的好坏和乳剂成分的质量等有关。一种好的乳剂疫苗应是油包水（W/O）或水包油（O/W）型，粘度低，颗粒均匀，稳定性良好，呈乳白色。“乳剂”是将一种溶液或干粉分散成细小的微粒，混悬于另一不相溶的液体中所成的分散体系。被分散的物质称为分散相（内相），承受分散相的液体称连续相（外相），两相间的界面活性物质称为乳化剂。,油乳佐剂,乳化剂 天然乳化剂：阿拉伯胶、海藻酸钠、蛋黄以及炼乳 人工合成乳化剂离子型 阴离子类乳化剂：十二烷基磺酸钠和硬脂酸铝 阳离子类乳化剂：氯化苯甲烃铵、溴化十六烷三甲基非离子型：月桂酸聚甘油脂、山梨醇脂和单油酸脂、 司本-80、吐温-80,白油佐剂国内外常用白油：Drakocel-6VR、Marcol-52和Lipolul-4 7号或10号白油质量标准: 无色无味 50运动粘度7m2s左右 紫外吸收A250-3500.1，紫外消光系数12108； 单环芳烃与双环芳烃含量低于0.5，无多环芳烃； 小鼠腹腔注射0.5ml或家免皮下注射2.0ml白油，观察60d，表现正常。,乳剂配方与乳化方法（1）剂在水中法： 将乳化剂直接溶于水中，在激烈搅拌下将油加入，可直接生成O/W乳剂。若欲得W/O型，可继续加入油，直到发生变型。该法通常用匀浆器或胶体磨，高速搅拌而得到较好的乳剂。（2）剂在油中法： 将乳化剂溶于油相，将油相直接加入水相中得O/W，如水相直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，继续加入至变型。该法制成的乳剂，一般均匀颗粒直径在0.5m左右，比较稳定。,免疫实验动物用的佐剂配制: (1)弗氏佐剂：矿物油75%85，乳化剂1525%，混合后经除菌过滤而成为FIA；如向其中加入0.5mgm1死结核杆菌即为FCA。使用时，将含抗原的水相，与上述任一佐剂等量混合，用力振摇即可成为均匀的乳剂。(2) 白油佐剂：9份油和1份司本-80混合后加2吐温-80和12%硬脂酸铝，经高压灭菌后备用，注射前将配好的油佐剂与抗原水相1：1混合，强力振摇，可配制成性状良好的乳剂疫苗。,大量生产乳剂疫苗: 油相: 94白油、6司本-80、1%2硬脂酸铝，灭菌即可； 水相：抗原液加24%吐温-80 乳化：将油相与水相按3：12：1比例配制，先缓速混合，再 通过胶体磨充分乳化，可获得稳定的油包水乳剂苗。 或者将粘稠的W/O乳剂疫苗，再加2吐温-80生理盐 水，通过搅拌或胶体磨乳化，可制成双相乳剂疫苗。,油乳剂检验（1）粘度测定：流出法、Saybolt粘度计法。吸管内口直径为1.2mm，室温下吸满lml乳剂，垂直放出0.4ml所需时间作为粘度单位。以 2-6 S为合格，不得多于10-15 S。（2）乳剂稳定性测定： 加速老化法：疫苗于37贮存10-30d不破乳。 离心加速分层法：3000rpm离心15min不分层，相当于保存1年以上不破乳。,蜂胶佐剂（ Propolis）,是一种优良的天然药物 供免疫佐剂用的蜂胶外观应具备其固有的特征 具有广泛的生物活性和药理作用（抗菌、抗病毒、抗肿瘤、消炎） 具有免疫增强作用： 能保持抗原特性，增强巨噬细胞的吞噬能力，促进抗体的 产生，提高机体的特异性和非特异性免疫力。,（1）蜂胶的处理： 蜂胶（4以下贮存） 粉碎过筛 按1：4（W/V）加95乙醇 室温浸泡2448h 冷却 过滤或离心取上清 透明栗色纯净蜂胶浸液 4以下保存备用 除去干渣计算出浸液中含蜂胶量。（2）蜂胶佐剂疫苗的制备： 灭活菌液或病毒液，加入蜂胶乙醇浸液，使每毫升菌液中含蜂胶10mg，边加边摇荡，成为乳浊状，即可。,蜂胶佐剂疫苗制备方法：,细胞因子类免疫佐剂 （cytokine）,细胞因子的概念 是机体的各种细胞在其生命周期中所释放的具有不同生物学效应的物质，是免疫细胞间相互作用的调节信号。该类物质相互诱生，相互影响，构成一个巨大的细胞因子网络（cytokine network）系统，各种细胞借助自己所释放的细胞因子完成各自的功能，在免疫应答中发挥作用。,细胞因子类免疫佐剂 （cytokine）,细胞因子的分类（根据生物活性）1. 经典的细胞因子：淋巴毒素（LT）、肿瘤坏死因子（TNF） 干扰素（INF）2. 对体液免疫和细胞免疫具有调节作用的因子： 白细胞介素（IL）和集落刺激因子（CSF）,1多效性： 免疫调节作用的多样性 作用方式的非特异性：不表现抗原特异性2靶细胞的多样性：构成机体细胞细胞调节网络3多源性：4高效性：有免疫激素（immune hormone）之称5快速反应性：即对激发因素的迅速反应,细胞因子的作用特点,多样性Pleiotropism 交叉性Redundancy 协同性Synergy 对抗性Antagonism,1作为免疫佐剂，提高疫苗的免疫效果2作为免疫治疗剂，预防和治疗某些病原感染3通过基因重组，构建新型基因工程疫苗 IL-2-AIV-HA重组痘病毒,细胞因子的应用,几种重要的细胞因子,白细胞介素-2（IL-2） 白细胞介素-4（IL-4） 白细胞介素-12（IL-12） -干扰素（IFN-）,刺激物为抗原或促有丝分裂原（ConA）； T细胞分泌； 无抗原特异性 糖蛋白，含133aa ，分子量15-35kDa； 7030min及pH值2-9范围内稳定,IL-2,刺激物：抗原或丝裂原；由Th细胞产生分子量1520kDa，有23个糖基化部位，140个氨基酸一种强有力的佐剂候选因子,IL-4,是目前发现的唯一主要由B细胞产生的细胞因子，与IL-2有协同作用，所以曾被称为细胞毒淋巴细胞成熟因子（CLMF）和天然杀伤细胞刺激因子（NKSF）。 糖蛋白，分子量75kDa，由40kDa（P40）和35kDa（P35）两个亚单位构成，两个亚单位完全由不同的基因所编码，只有结合为一个完整的分子时才能发挥生物学活性。 IL-12活性高于IL-2和IFN，在极低浓度时就有显著活性，对灭活疫苗、肿瘤和寄生虫抗原具有有效的佐剂活性。 IL-12诱导产生的Th1应答反应尤为引人注目，可望用于主要诱导细胞免疫应答的疫苗佐剂。,IL-12,由致敏T细胞在活的或灭活的病毒等干扰素诱生剂和某些细胞因子作用下所产生； 糖蛋白，分子量2025kDa，由144个氨基酸组成。 有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和免疫佐剂等免疫生物学活性。 目前IFN-与抗原杂合的融合分子的研究是个热点，期待其成为一个有效的佐剂。,IFN-,目前，我国已开发研制成功猪白细胞干扰素（swine interferon）。该制品系用鸡新城疫病毒诱导健康猪白细胞，经培养、灭活病毒、除菌、分装等工艺制成。用于防治猪流行性腹泻。,CpG DNA，CpG OND,CpG DNA：指含有非甲基化CpG（胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸）基序的脱氧核糖核酸DNA。 CpG基序（ motif）：指以非甲基化的CpG为基元构成的回文序列，其碱基排列大多为5-Pur Pur- CG- Pyr Pyr-3，具有较强免疫活性，称为免疫刺激序列（ISS，immunostimulatory DNA sequences）。 CpG OND：含有非甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸 。,细胞因子的分泌和细胞的分化,CpGDNA的免疫刺激效应（作用机制）,温度能量,酸化内体小泡,DNA-PK,TLR-9,胞质内受体蛋白,有丝分裂原蛋白激酶和转录因子等信号通路,引起B细胞分化，分泌IL-6、IL-10等细胞因子和表达MHCII、B7-1、B7-2等表面分子，并阻止B细胞的凋亡。 直接激活单核细胞、巨噬细胞和树突细胞，分泌IL-12、INF-r等Thl样为主的细胞因子，并刺激MHCII、B7-1、B7-2的表达。 在IL-12协同下激活NK细胞，杀伤活性增强，并分泌IFN-r，IFN-r反过来进一步促进单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的激活。 协同刺激抗原特异性B细胞和T细胞分化，在Thl细胞因子的作用下，显著增强获得性细胞免疫-优良的T细胞免疫佐剂。,1 CpGDNA对多种免疫细胞有激活作用,含有GACGTT-基序的CpG OND小鼠淋巴细胞含有AGCGTG基序的CpG OND小鼠的NK细胞含有GTCGTT基序的CpG OND人淋巴细胞含有ATCGAT基序的CpG OND鸡外周血单核细胞含有GTCGTT基序的CpG OND牛B细胞的增殖和分泌IL-6 PBMC分泌IL-6、IL-l2和IFN-r；含有ATCGAT基序的CpG OND猪 (Kamstrup，2001),2CpG OND免疫刺激作用具有物种和细胞特异性,CpGODN的体内效应与应用1对天然免疫系统的刺激活性 （1）抗感染 ：单核李斯特杆菌、利什曼原虫、 疟原虫、单纯疱疹病毒 （2）抗肿瘤活性 ：黑色素瘤 2. 对特异性免疫反应的调节作用疫苗佐剂 （1）CpG ODN对蛋白质抗原的作用 能够增强许多抗原诱导的Thl型反应HbsAg、牛疱疹病毒I型糖蛋白 D、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、疟疾的多肽、麻疹病毒、放线杆菌 胸膜肺炎、流感病毒疫苗、猫疱疹病毒、猫细小病毒和猫白血病病毒 （2）CpG ONG对DNA疫苗的作用3过敏性疾病治疗,霍乱毒素（CT） 大肠杆菌不耐热毒素（LT） 破伤风类毒素（TT）,基因工程减毒素,（一）霍乱毒素（CT） 良好的粘膜免疫佐剂 由A和B两个区构成的蛋白 B区具有主要免疫学作用，内含5种独立的非共价连接的B亚单 位（CTB），无毒性，可与细胞结合。 A区是CT的生物学活性部分，具有酶活性。 仙台病毒CT；CTB流感病毒HA；链球菌表面蛋白CTB； CT毒素A和B两个亚单位的表达质粒DNA作为佐剂与DNA疫苗联和应用，还可诱导机体产生很强的Th1细胞因子反应（如IFN-）和Th2细胞因子反应（如IL-4），具有很强的佐剂作用。,（二）大肠杆菌不耐热毒素（LT） 大肠杆菌LT毒素有A和B两个亚单位，有一定抗原性 A亚单位基因工程点突变体LT(R192G) 无毒性作用，但仍保留了其佐剂效应 可诱导机体产生局部粘膜免疫反应。利用基因突变技术，构建的A和B两个亚单位的表达质粒DNA联合应用，也可诱导机体产生很强的Th1细胞因子反应（IFN-）和Th2细胞因子反应（IL-4）。而且，LT毒素表达质粒作为佐剂，可协助DNA疫苗诱导机体产生更强的细胞免疫反应，有望成为一种新型免疫增强剂。,免疫刺激复合物（ immunostimulating complex， ISCOM） ISCOM由抗原物质与由皂树皮提取的一种糖苷Quil A和胆固醇按1:1:1混合后自发形成的一种具有较高免疫活性的脂质小泡。 ISCOM直径40nm，每个ISCOM约含1012分子的蛋白质。 ISCOM应用于多种细菌、病毒和寄生虫病的疫苗，具有产生“全面”免疫应答的效力，可长期增强特异性抗体应答。 ISCOM能有效地通过粘膜给药，从而可以用于抗呼吸道感染。 目前，兽用ISCOM疫苗已在国外投放市场。,2、佐剂作用机理： 机理非常复杂，但可概括三个方面。（不同书有不同写法） 抗原储存库延长抗原储存时间，延长抗原释放