2015毛细管电泳

1 第一节 概述 电泳 （ Electrophoresis)是指溶液中带电粒子在电场的作用下向与自身带相反电荷的电极移动的现象。将电泳发展成为分离技术应归功于 Tiselius (瑞典 ,蒂塞利乌斯 )的工作。他于 1937年建立“移界电泳（ moving boundary electrophoresis)”，成功地将人血清中的蛋白质分为白蛋白、 、 、和 球蛋白，这项工作成为蛋白质化学发展的基础，因此 Tiselius本人荣获 1948年诺贝尔化学奖。 第 15章 毛细管电泳法 电泳（ C）槽和电极（ V1、 V2 ） 2 经典电泳法散热差，分离电压受到限制。 1981年， Jorgenson和 Lukacs发表了在毛细管电泳发展史上具有划时代意义的工作，他们采用 75m内径的石英毛细管做为分离室，紫外柱上检测的方法，在 30kv的分离电压下分离丹酰化氨基酸，柱效达到 40万个理论塔板。他们的工作为毛细管电泳的发展奠定了基础 。 James W. Jorgenson North Illinois University 化学系教授 3 第二节 基本原理 电泳 （ electrophoresis）是指溶液中带电粒子（离子）在电场中定 向移动的现象。 电泳淌度：单位电场强度下，带点粒子的电泳速率。 式中 电泳迁移率（电泳淌度）， 为电泳速率 一、电泳和 电泳淌度 /e p e puE epep 6qr 电泳淌度与带电粒子半径（ r）及电荷（ q）间的关系 电泳淌度的差异构成了电泳分离的基础 epu4 二、电渗和电渗淌度 电渗（ electroosmosis)是毛细管电泳分离理论中最基本的概念之一。 5 电渗 是指在电场作用下，毛细管中或固相多孔物质内，电解 质溶液朝一个方向迁移的现象。电渗速率 与固液两相界面 的双电层 Zeta电位 ，缓冲溶液的介电常数 和黏度 有关， 与电场强度成正比。 单位场强下的电渗速率 ，称为电渗淌度 eouE eoueoeouE6 三、表观淌度和迁移时间 )a p p e p e o e p e ou u u E （表观淌度 表观迁移速度 正离子 ep+eo uep+ ueo 中性分子 eo ueo 负离子 eo-ep ueo - uep 由于电渗流速度大大高于电泳速度，所以，不管正离子、负离子还是中性分子，均随电渗流移动。 /da p p e p e otLtVL 7 1)CE中电渗流的流形 电荷均匀分布，整体移动 ,电渗流的流动为平流 ,塞式流动 （谱带展宽很小）； 高效液相色谱中的溶液流动为层流 ,抛物线流型 ,管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的 2倍（引起谱带展宽较大）。 四、柱效和分离度 8 2） CE中电渗流的作用 电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的 5 7倍； 各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为： 阳离子运动方向与电渗流 一致 ； 阴离子运动方向与电渗流 相反 ； 中性粒子运动方向与电渗流一致； （ 1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离； （ 2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变 LC中的流速； （ 3）电渗流的微小变化影响结果的重现性； 在 CE中，控制电渗流非常重要 。 ()a p p e p e o ()a p p e o e p ()a p p e o中9 3)无涡流扩散项与传质阻力项 在 HPCE中，仅存在纵向扩散， H=B/u 21 / 2; 5 .5 422a p p d a p p dtV L E L tNnD L D W 扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。 影响分离度的主要因素；工作电压 V；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算： 122ep ep 21212( ) ()4tt NRWW 为两组分电泳淌度的差值 10 第三节 毛细管电泳仪和实验操作 一、毛细管电泳仪 11 1.高压电极槽和进样机构 2.填灌清洗机构 3.毛细管 4.检测器 5.铂丝电极 6.低压电极槽 7.恒温系统 8.数据记录处理系统 自动型毛细管电泳仪结构示意图 12 CE的要求： 进样机构不存在死体积，能进行精确的进样控制。 需有毛细管清洗机构。 高压电源至少应能输出 200A 25kV的功率。 检测器尽量安装在接地端，优先考虑柱上紫外检测方式。 温控范围宽，以 0 为界，越宽越好，上限不应低于 50 ，最好能达到 65 70 ，至少能在 20 40 内恒温，恒温精度应小于 0.1 。 13 高压电源一般采用（ 0 30） kV连续可调的直流高压电源，一般要求电压稳定在 0.1%。电极通常由直径 0.5mm 1mm的铂丝制成。电极槽通常是带螺帽的玻璃瓶或塑料瓶（ 1ml 5ml不等），以便于密封。 仪器必须接地 ，操作过程中必须注意高压的安全保护。 一、高压电源 14 二、毛细管 1.尺寸 毛细管尺寸的选择与分离模式和样品有关。自由溶液电泳多选用 50或 75m内径的毛细管，分离的有效长度常控制在40 100cm之间。如进行大颗粒如红细胞的分离，则需要内径大于 300m的毛细管。 CGE或 CEC的有效长度一般控制在20cm左右。 2.涂层 外壁涂一层聚酰亚胺保护层 ，一般内壁不需涂层处理。大分子化合物分离时，常常需要惰性管壁，以抑制吸附。做CIEF或 CGE时，需要涂层毛细管以抑制电渗。在分离中，有时为了加 强电渗或改变其方向，也需要涂层毛细管。 15 3. 清洗 毛细管在使用过程可能被污染，从而影响分析的结果。为使测定具有良好的重现性，毛细管在使用时应经常清洗。 空管通常用 0.l 1mol/L NaOH、水和缓冲液顺序冲洗，各洗510min，或增加有机溶剂如甲醇清洗步骤，以除去管中的脂溶性吸附组分。如果怀疑管内壁吸附有蛋白质或其他有机分子，可用0.l 1mol/L的 HNO3洗 5 10min，然后再按常规清洗。 两次分析之间，可用运行缓冲液清洗、平衡。 16 三、进样系统 毛细管通道十分细小，所需样品不过数 nl，所以不能采用色谱的进样方式。通过让毛细管与样品溶液直接接触，然后由重力、电场力或其它动力来驱动样品进入管中。进样量可以通过控制驱动力的大小或时间长短来控制。进样系统必须包括动力控制、计时控制、电极槽或毛细管移位控制等机构。 进样方式 ： 1、 压力法（流体力学进样） 2、 电动法 4128 tP d tVL2()e p e otV r c tQL 17 1、压力进样 也称流动进样，它要求毛细管中的填充介 质具有流动性。当毛细管两端置于不同的 压力环境中时，管中溶液即能流动，将样 品带入。 可用三种方法产生进样动力：正压、负压 （管尾抽吸）、重力（虹吸）。 采用压缩空气（气体钢瓶）可实现正压 进样，并可与毛细管清洗系统共用，多 为商品仪器采用。 优点： 压力进样没有偏向问题， 缺点： 选择性差，样品及其背景同时被引入 管中，对后续分离可能产生影响。 4128 tp d tVL18 电动进样 当把毛细管的进样端插入样品溶液并加上电场时，组分就会因电迁移和电渗作用而进入管内。 电动进样的控制参数是电场强度 E和进样时间 t。电场强度 E取值多在 1 60kv/60cm 之间；进样时间通常在 110s 之间，有时可达 1min或更大。 优点 ：电动进样对毛细管内的填充介质没有特殊限制，属普适性方法，可实现自动化操作。 缺点 ：电动进样对离子组分存在偏向，降低分析的准确性和可靠性。 2( ) V re p e otctQL 19 四 . 检测器 在毛细管电泳中，毛细管柱内径小（通常 50m或 75m)，区带体积小，仅为 nl级，区带迁移速度快，这就对检测器提出了很高的要求。 毛细管电泳要求检测方法必须具有很高的灵敏度和很快的响应速度，且不能引起区带扩张。 常用 柱上检测法 20 紫外检测 由于紫外检测器价格便宜，通用性好，石英毛细管柱有良好的紫外透过性，易于实现柱上检测；再加上大多数有机化合物包括蛋白质等生物大分子都含有紫外发色团，所以它是目前应用最广的检测器。但是，由于受毛细管内径的限制，检测灵敏度较低。 固定波长检测器 可变波长检测器 二极管阵列检测器 21 激光诱导荧光（ LIF） 采用激光（强度高，准直性好，可聚焦成比毛细管更细的光束射入毛细管内部），激发出强的荧光。 LIF能减小因毛细管壁的散射所引起的背景噪声。 1.激光器 2.高压电源 3.毛细管 4.单色器 5.光电倍增管 6.记录仪 8.激发光光纤 9.荧光收集光纤 22 其他检测器 电化学检测器 化学发光检测器 质谱检测器 23 第四节 定性和定量分析方法 一、定性分析方法 以相对迁移时间与对照品对比定性；与质谱联用定性。 二、定量分析方法 1、内标法 2、叠加对比法 iiAm/iRi R i RAAii A A A Amm 24 第五节 毛细管电泳的主要分离模式 毛细管区带电泳（ capillary zone electrophoresis， CZE） 胶束电动色谱（ micellar electrokinetic chromatography, MEKC) 毛细管凝胶电泳（ capillary gel electrophoresis, CGE) 毛细管等速电泳（ capillary isotachophoresis, CITP) 毛细管等电聚焦（ capillary isoelectric focus, CIF) 毛细管电色谱（ capillary electrochromatography, CEC) 25 一、毛细管区带电泳法（ CZE） 毛细管电泳最基本的分离模式。背景电解质是缓冲液，分离是基于样品中各个组分间质荷比的差异。有时需在缓冲液中加入一定的添加剂，用以提高分离选择性，改变电渗流的大小、方向或抑制毛细管壁的吸附等。 在 CZE中，影响分离的操作条件为： 分离电压 背景电解质种类、浓度和 pH 添加剂种类和浓度 26 分离效率与电压间存在极大值。极大电压通常也是最佳工作电压。 在实际分离中，如果所用的毛细管很细或缓冲液的电导很低，极大电压可能会超出仪器范围，此时没有最佳电压，可选择仪器允许的最大输出电压。 当毛细管较粗或缓冲液电导较高时，极大电压可能很小，若此时分离度很高，也可选择大于极大值的电压进行分离。 1. 分离电压 27 毛细管的温度不仅影响分离的重视性，而且影响分离效率。温度选择应考虑热效应、分析重现性、分离效率和分离介质对温度的限制等因素。 温度的确定也应通过实验，多数情况下，在 20 30 之间进行电泳，能获得良好的分离效果。可根据初步分离结果调整温度。 不少糖类样品需要高于室温的分离环境，一些样品如蛋白等则可能需要低于室温的分离条件。 2.分离温度 28 对背景电解质的 要求 ： 在所选择的 pH范围内有足够大的缓冲容量。 在检测波长处的吸收低。 自身的淌度低，即分子大而荷电小，以减少电流的产生。 应使被测组分带合适的电荷量，以实现有效进样和有合适的电泳淌度。 尽可能采用酸性缓冲溶液，在低 pH下，吸附和电渗流值都很小。 与毛细管种类匹配，涂层毛细管只能在一定 pH范围内使用。 3. 背景电解质 29 在 CZE中， 常用于毛细管电泳的缓冲溶液有硼砂、磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和醋酸盐等。 缓冲体系的 pH值要求与样品的性质有关，通常酸性组分的分离选择在碱性条件下进行，而碱性组分则选择酸性介质分离，蛋白质、多肽、氨基酸等两性物质，可选酸性 (pH2)也可选碱性 (pH9)分离介质。糖类样品通常在 pH911之间能获得最佳分离，羧酸或其它样品多在 pH59之间选择分离条件 。 30 二、胶束电动色谱法（ MEKC） 在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂（如 SDS），当表面活性剂浓度超过其临界胶束浓度时，则形成胶束，胶束具有疏水内核 , 外层带负电荷。溶质分子则在极性缓冲液与胶束中心的非极性相（ 假固定相 ）之间有一定的分配。 中性分子因其本身疏水性 不同，在两相中分配存在差异。 在电渗流作用下，胶束携带溶 质一起前行，疏水性强的溶质 和胶束结合得较牢，流出慢。溶 质分子由于表观淌度及其在两相 中的分配系数的差异是 MEKC分离 的基础。 31 常用的阴离子表面活性剂有十二烷基硫酸钠（ SDS）、 N-月桂酰 -N-甲基牛磺酸钠（ LMT）、牛磺脱氧胆酸钠（ STDC）等。 阳离子表面活性剂最常用的是季铵盐，如十二烷基三甲基溴化铵（ DTAB）、十六烷基三甲基溴化铵（ CTAB）等。 非离子型表面活性剂有 3-3-(氯化酰胺基丙基 )二甲基胺基 -1-丙基磺酸酯（ CHAPS）等。 另外，还有手性表面活性剂，如胆酸、毛地黄皂苷、十二烷基 -N-L-缬氨酸钠等。 32 表面活性剂选择时应考虑以下因素： （ 1）经济易得 （ 2）水溶性好 （ 3）紫外吸收背景越低越好 （ 4）不与样品发生破坏性作用 （ 5）所形成的胶束足够稳定 33 三、环糊精修饰毛细管电泳法 将适量环糊精及其衍生物加入缓冲溶液作为添加剂而进行的毛细管电泳。 分离手型异构 体常用的方法。 环糊精，吡喃葡萄糖单元构成锥筒形结构。待分离组分的分子大小，相对极性，与 CD环镶嵌关系决定手性分子的表观淌度。 34 四、毛细管电色谱（ CEC） 以微填充柱作为分离柱，以电渗流（电渗 +液压）驱动流动相完成色谱分离过程。 基于组分的分配系数和电泳淌度及的差异实现组分的分离