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四 新型生物药物的筛选 由于必须从随机的经典式筛选转向理性筛选 应依据抗生素的作用机制 细菌的耐药机制等设计筛选模型 四 新型生物药物的筛选 一 常规筛选技术琼脂扩散法 又称杯碟法 在接有试验菌的琼脂平板上放上玻璃或不锈钢的无底小杯 常称牛津杯 向杯内滴入待检的接抗菌发酵液 保温培养 抗生素由小杯渗透到周围的琼脂中 抑制细菌生长 因此在小杯周围形成一个透明圈 圈的直径决定于抗生素的浓度 四 新型生物药物的筛选 一 常规筛选技术此法常用来测定抗生素的效价 即是用抗菌效力表示的抗生素有效含量 四 新型生物药物的筛选 一 常规筛选技术测定方法 将制备好的培养基倾注20ml于双碟中 直径90mm 高15mm 水平放置使其凝固 作为底层 然后将冷却至约50 的培养基与适量质控菌株的菌悬液混合 迅速摇匀 倾注4ml覆盖底层培养基 使其分布均匀 作为菌层 放置水平位置充分凝固后 在菌层培养基上等距离放置4 6个牛津杯 加入制备好的抗生素溶液 培养后观察结果 移去牛津杯测量抑菌圈直径 四 新型生物药物的筛选 一 常规筛选技术效价计算 按照上述计算实验方法测定得到的标准品稀释液和样品溶液所致的抑菌圈直径的平均值 绘制标准曲线 再从标准曲线查得样品稀释液的效价 四 新型生物药物的筛选 二 定靶筛选从临床有效的抗生素的作用机理和细菌的耐药机理来设计筛选模型 有目的地筛选具有某种作用机理的抗生素 试图获得抗菌作用强 对耐药菌有效 毒性小的新抗生素 四 新型生物药物的筛选 二 定靶筛选1 以作用机理为依据的筛选方法 各类抗生素的受体 抑制细菌细胞壁的合成蛋白质合成抑制剂细菌DNA回旋酶抑制剂改变细胞膜通透性作用于细胞外膜的药物筛选作用于细菌外排泵的药物的筛选氨基糖类抗生素的筛选 四 新型生物药物的筛选 二 定靶筛选1 以作用机理为依据的筛选方法 各类抗生素的受体 抑制细菌细胞壁合成的抗生素 青霉素 头孢菌素蛋白质合成抑制剂 四环素改变细胞膜功能 多烯类抗生素抑制核酸合成的抗生素 丝裂霉素C抑制生物能作用的抗生素 抗霉素 四 新型生物药物的筛选 二 定靶筛选2 抗生素的耐药机制细菌的耐药性又称抗药性 一般是指细菌与药物多次接触后 对药物的敏感性下降甚至消失 致使药物对耐药菌的疗效降低或无效 四 新型生物药物的筛选 二 定靶筛选2 抗生素的耐药机制耐药性产生的机理主要有以下几种 产生降解抗生素 如 内酰胺类 的酶或钝化酶改变抗生素的结构 如氨基糖苷类 抗生素作用靶点由于发生突变或被细菌的某些酶修饰而使抗菌药物无法发挥作用 以及抗生素使用的靶酶的结构发生改变使之与抗生素的亲和力下降 四 新型生物药物的筛选 二 定靶筛选2 抗生素的耐药机制细菌具有一种信赖于能量的主动转运机制 即它能够把进入胞内的药物泵入胞外 降低细胞壁的通透性 使抗生素不能进入细菌 从下列方式获得耐药基因 从祖先细菌获得 自发获得或使原存在的耐药基因表达加强 从其他细菌经接合转移获得耐药基因 从病毒的其它细菌的质或染色体获得 从环境中经质粒或染色体介绍获得耐药基因 五 新型生物的生物合成 一 微生物的代谢微生物在代谢过程中产生的代谢产物在体内的不同作用 可将代谢分为初级代谢和次级代谢 五 新型生物的生物合成 一 微生物的代谢初级代谢是指能使营养物质转变成机体的结构物质和对机体有生理活性作用的物质 或是为机体生长提供能量的一类代谢 初级代谢的产物称为初级代谢产物 这类物质包括供机体进行生物合成的各种小分子前体 单体和多聚体物质 以及在能量代谢中起调节作用的各种物质 如多糖 蛋白质 脂肪和核酸等 五 新型生物的生物合成 一 微生物的代谢次级代谢是指微生物生长到一定阶段才产生化学结构复杂 对该生物无明显生理功能 或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质 如抗生素 毒素 激素 色素等 不同种类的微生物所产生的次级代谢产物不相同 它们可能积累在细胞内 也可能排到外环境中 五 新型生物的生物合成 二 微生物药物合成的基本途径次级代谢产物中的构建单位称之为生源 一般次级代谢产物的生源都是直接或间接地来自于微生物代谢过程中产物的一些中间产物或是初级代谢产物 这些物质有的直接作为次级代谢产物的前提 有的经过修饰后作为特殊前体用于合成次级代谢产物 虽然次级代谢产物的化学结构类型繁多 而且结构也比较复杂 但是它们的构建单位只有几种 五 新型生物的生物合成 二 微生物药物合成的基本途径1 生源聚酮体即含有多个羰基的聚合物 和次级代谢产物脂肪酸合成的前提相似 许多次级代谢产物的前体是由聚酮体构成 聚酮体的形成以起始单位为基础 与链的延伸单位不断缩合和脱羧 最终形成 多酮次甲基链 合成的 多酮次甲基链经过不完全的还原或者在不同位点还原 可以形成种类极多的聚酮体 五 新型生物的生物合成 二 微生物药物合成的基本途径糖类次级代谢产物中的糖类主要有氨基酸 糖胺 环多醇和氨基环多醇以及其他糖类等 五 新型生物的生物合成 二 微生物药物合成的基本途径不常见的氨基酸正常氨基酸是指微生物能够利用并用于蛋白质合成的 L 氨基酸 而在次级代谢产物中存在200多种非蛋白质氨基酸 如D 氨基酸 N 甲基氨基酸 氨基酸以及稀有的二氨基酸等 称为不常见的氨基酸 五 新型生物的生物合成 二 微生物药物合成的基本途径非核酸的嘌呤碱和嘧啶碱非核酸的嘌呤碱和嘧啶碱不同于正常核酸上的碱基 而是以正常碱基经过化学修饰形成的 与菌体内核苷酸的合成途径不同 可以直接利用培养基中的各种嘌呤碱基核苷酸 五 新型生物的生物合成 二 微生物药物合成的基本途径吩恶嗪酮吩恶嗪酮是一些次级代谢产物的一个基本结构 其生物合成前提是色氨酸和一些代谢物 它们先形成4 甲基 3 羟基 邻氨基苯酸在吩恶嗪酮合成酶的催化下被氧化脱水形成吩恶嗪酮 五 新型生物的生物合成 二 微生物药物合成的基本途径莽草酸莽草酸是许多芳香氨基酸化合物 包括芳香氨基酸 肉桂酸和某些多酚类化合物的前提 莽草酸源自葡萄糖 是合成许多抗生素的前提 五 新型生物的生物合成 二 微生物药物合成的基本途径甲羟戊酸在许多次级代谢产物中 甲羟戊酸是其重要的构建单位 如甲羟戊酸被磷酸化后形成甲羟戊酸 5 焦磷酸 继续经脱羧和脱水作用就可以形成活化形式的异戊二烯焦磷酸 这种活化的五碳单位几乎可以和任何数量的单元结合 形成各种各样的异戊二烯类或萜类次级代谢产物 五 新型生物的生物合成 二 微生物药物合成的基本途径2 次级代谢产物生物合成的基本途径前体聚合 次级代谢产物的生源合成后 可通过综合反应形成聚酮体 寡肽 聚乙烯等 修饰 次级代谢产物和各种单体聚合在一起 建立起基本骨架后 其中的某些基团往往还必须通过酶促反应进行修饰 才会形成具有生理活性的物质 这些酶促反应包括糖基化 酰基化 羟基化和氨基化反应以及氧化还原等 五 新型生物的生物合成 二 微生物药物合成的基本途径2 次级代谢产物生物合成的基本途径不同组分的装配 次级代谢产物的必需的几个部分合成后 需要按照一定的顺序在特异酶的催化下组装在一起才会形成具有生理活性的次级代谢产物 例如 新生霉素是由新生酶糖部分 香豆素部分 异戊烯部分和对羟基苯甲酸部分组合而成 其中新生霉素部分来自于葡萄糖 香豆素部分是由酪氨酸衍生 异戊烯部分来自于甲羟戊酸 而对羟基苯甲酸部分是由莽甲酸衍生而来 几个组分形成后装配在一起得到具有生理活性的新生霉素 五 新型生物的生物合成 二 微生物药物合成的基本途径3 次级代谢产物的主要代谢调节机制A 初级代谢对次级代谢的调节当初级代谢和次级代谢具有共同的合成途径时 初级代谢的终产物过量 往往会抑制次级代谢的合成 这主要是因为初级代谢终产物抑制了在次级代谢产物合成中重要的分叉中间体的合成 五 新型生物的生物合成 二 微生物药物合成的基本途径3 次级代谢产物的主要代谢调节机制B 碳代谢物的调节一般情况下 凡能被微生物快速利用 促进产生菌生长速度的碳源 对次级代谢产物生物合成都表现出抑制作用 五 新型生物的生物合成 二 微生物药物合成的基本途径3 次级代谢产物的主要代谢调节机制C 氮代谢物的调节在不同氮源的研究中发现 以蛋白质作氮源 可以促进次级代谢产物的合成 而以无机氮或简单有机氮等容易利用的氮作为氮源 胺盐 硝酸盐 某些氨基酸 能促进菌体的生长 但却抑制次级代谢产物的合成 五 新型生物的生物合成 二 微生物药物合成的基本途径3 次级代谢产物的主要代谢调节机制D 磷酸盐的调节过量的磷酸盐也像葡萄糖一样抑制次级代谢产物的合成 这种抑制作用称为磷酸盐调节 磷酸盐对次级代谢产物合成的影响表现在以下几个方面 1 促进初级代谢 抑制次级代谢 2 抑制次级代谢产物前体的形成 3 阻遏次级代谢产物合成中某些关键酶的合成 五 新型生物的生物合成 二 微生物药物合成的基本途径3 次级代谢产物的主要代谢调节机制D 磷酸盐的调节 4 抑制次级代谢产物合成中某些关键酶的活性 5 增加菌体能荷状态以及促进初级代谢 五 新型生物的生物合成 二 微生物药物合成的基本途径3 次级代谢产物的主要代谢调节机制E ATP调节 磷酸烯醇式丙酮酸 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 羧基转移酶 草酰乙酸 丙酮酸 乙酰CoA 乙酰CoA羧化酶 丙二酰CoA ATP 五 新型生物的生物合成 二 微生物药物合成的基本途径3 次级代谢产物的主要代谢调节机制F 诱导调节和产物的反馈调节诱导调节 在次级代谢过程中 有些酶为诱导酶 需要有诱导物才能形成 产物的反馈调节 在次级代谢诶产物合成中 产物的过量积累 也存在着像初级代谢中相似的反馈调节现象 五 新型生物的生物合成 二 微生物药物合成的基本途径3 次级代谢产物