分子遗传学病毒

第 八 章 病 毒,李 大 伟（中国农业大学农业生物技术国家重点实验室）,病毒的定义 病毒的形态结构与分类病毒基因组的复制与表达,主要参考书籍Alan J. Cann, Principles of Molecular Virology(1, 2, 3 ed.), Academic Press.阎隆飞 张玉麟，1997，分子生物学，中国农业大学出版社.,病毒的定义,第一节,公元前14世纪古埃及长老石刻象显示了小儿麻痹后遗症，这可能是病毒感染的第一个史载记录,脊髓灰质炎病毒(Poliovirus) 与 小儿麻痹症(Paralytic Poliomyelitis),Viruses are probably as old as life on earth.,Rabies (狂犬病) Endemic in Europe by AD 16-17,关于植物病毒病害的记载 荷兰郁金香杂色病(1576) 欧洲马铃薯退化病(1775),Dubos(1958)曾描述了当时流行的“郁金香热”: 一株受侵染的球根可以换到数头公牛、猪或者绵羊，几吨谷物，成千磅干酪，甚至一个磨房。一个年青的姑娘以拥有一只杂色花作为她的嫁妆而感到无比的幸福。,牛痘接种防治天花-古代接种术(1796),对病毒的早期认识-利用疫苗对病毒病的防治,Martinus Beijerinick (1851-1931) 证明在经过可吸附细菌的琼脂扩散后, 这种侵染物仍可导致烟草花叶病。他将此侵染物称为“侵染性活液”, 并也采用了“Virus”一词。,对于病毒本质的认识,John Enders(1897-1985) 1949年在体外培养的细胞中获得脊髓灰质炎病毒, 1954年获得诺贝尔奖。Aaron Klug(1926-) 1962年提出了烟草花叶病毒病毒的柱状结构, 1982年获得诺贝尔奖。David Baltimore (1938-) 1970年在提纯的罗斯肉瘤病毒粒子中发现了逆转录酶，证明遗传信息可以由RNA反向产生DNA。-生物学中心法则。1975年获得诺贝尔奖。,现代病毒学的发展历程,Michael J. Bishop(1936-） 1976年发现正常细胞中存在罗斯肉瘤病毒致瘤基因的对应基因, 1989年获诺贝尔奖。Phillip A. Sharp (1944 -), 1977年发现腺病毒基因组中存在基因剪切现象(gene splicing),1993年获诺贝尔奖。Fred Sanger(1918-) 1977年建立了DNA序列分析方法, 并对X174噬菌体的单链DNA序列进行了测定。因此获得诺贝尔奖。,Gallo & Montagnier 1983年分离到一种与爱滋病(AIDS, Acquired Immunodeficiency Syndrome)有关的逆转录病毒。R. Beachy 1986年利用烟草花叶病毒外壳蛋白基因转化植物, 获得抗TMV侵染的基因工程植株。这一研究为抗病毒动植物基因工程奠定了基础。(Chen)Stanley B Prusiner(1942-)发现朊病毒(Prions)，1997年获诺贝尔奖。,病毒与其它生物的比较,1. 类病毒 (Viroids) 为目前已知最小的独立侵染核酸分子, 由Diener在1971年首次发现(PSTVd), 主要存在于植物寄主中。 单链环状RNA分子, 无外壳蛋白, 核苷酸长度为246-375nt, 富含G+C (53-60%) 环状分子高度碱基配对, 形成双股螺旋结构, 外形呈杆状 在寄主植物中可自我复制,2. 朊病毒 (Prions) 一类仅含有蛋白质的侵染性病原物, 导致动物或人类中枢神经系统的慢性病变, 并可以“遗传”。如：疯牛病 (mad cow )、羊骚痒病 、人G-S综合症 、老年痴呆(C-J病) 、人振颤病(海绵状脑硬化)等。 疯牛病是由一种Prion侵染引起的，它也可以感染人而引起神经系统疾病。在正常机体中，Prion是正常神经活动所需要的蛋白质，而致病Prion与正常Prion的一级结构完全相同，只是空间结构(折叠状态)不同。,严格的寄生性离开寄主细胞便不能进行繁殖并会失活。必须有寄主的遗传信息、能量及酶系统的参与方能进行核酸复制、蛋白质合成并装配产生子代病毒。侵染性、致病性和寄主范围a.病毒只侵染活的寄主细胞,并存在病毒基因与寄主细胞间的相互识别机制。b.病毒在复制过程中扰乱了寄主的正常代谢,最终造成寄主发病。c.病毒核酸中存在特定的基因,可导致寄主感病。抗原性在哺乳动物体内可激发产生抗体,What is a virus?一类亚显微细胞内寄生物颗粒由预先合成的组份装配而成, 不能够生长或分裂含有蛋白质、核酸，在某些病毒中含有脂类不具备能量代谢或蛋白质合成所必需的酶系统和核糖体，需依赖寄主方能进行复制 -A. J. Cann, 2001, Principle of Molecular Virology(3rd Ed.),第 二 节病毒的形态结构与分类,What does a virus look like?,An axis of five-fold rotational symmetry through the centre of each corner (vertex).,An axis of two-fold rotational symmetry through the centre of each edge.,An axis of three-fold rotational symmetry through the centre of each face.,Lamda phage/ T7 phage (head),PhiX174 phage,FMDV,Cucmber mosaic virus,ss(-) RNA, = 80 nm, length = 80 nm,D.复杂的病毒结构- 弹状病毒, 狂犬病病毒,核酸: 1-30%, 分为RNA或DNA, 分子量在 3.5kb-280kb之间，携带基因数量在3100个之间.蛋白质: 5-80%, 部分病毒仅有一种结构蛋白(capsid), 存在于病毒颗粒表面(如多数植物病毒),而另一部分则具有两种或更多种类的结构蛋白(capsid,glycoprotein等), 构成病毒粒子的不同结构或功能区域。脂类: 0-20%, 存在于包膜病毒, 来源于寄主细胞碳水化合物: 0-3%, 多结合形成包膜病毒的糖蛋白 水： 50%, 以结合态存在于病毒粒子中,3. How are viruses classified?,The International Committee on Taxonomy of Viruses,Virus Taxonomy, VIIth report of the ICTV. The Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. M.H.V. van Regenmortel, et. al. (2000).,形态学 -大小, 形状, 有无包膜理化性质-分子量, 热稳定性, 离子稳定性基因组-RNA, DNA , 分段(segmented )等大分子成分和复制类型,The DNA virus The ssDNA virus The dsDNA virus The RNA virus The dsRNA virus The negative-stranded ssRNA virus The positive-stranded ssRNA virus The DNA & RNA reverse transcribing virus,病毒基因组的复制与表达,第三节,病毒的复制过程,ATTACHMENT,PENETRATION,HOSTFUNCTIONS,ASSEMBLY(MATURATION),Transcription,REPLICATION,RELEASE,UNCOATING,Translation,MULTIPLICATION,1. 多样性基本形式的多样性复制、表达中间形式的多样性内部结构的多样性（寄主依赖性）2. 最小化趋势基因(ORF)重叠同一序列的多重功能单链RNA3. 高度变异性基因突变基因重组/重配选择压力,病毒基因组的特点,The DNA virus The dsDNA virus The ssDNA virusThe RNA virus The dsRNA virus The positive -stranded ssRNA virus The negative -stranded ssRNA virus The DNA & RNA reverse transcribing virus,1. ds DNA Virus,多为动物病毒和噬菌体。研究较多的如 SV40、腺病毒、噬菌体和T4 噬菌体等。它们均采用与寄主相同的半保留方式进行复制, 但复制的场所及具体过程有所不同。,疱疹病毒,腺病毒,T4 噬菌体,复 制 类 型1. 真核寄主病毒仅限于寄主细胞核内进行复制, 对细胞因子的依赖程度较高(无DdRp)。如乳多空病毒科(C)、疱疹病毒科(L)、腺病毒(L)。在细胞质内进行复制, 自身含有转录及复制的绝大部分因子, 对于细胞因子的依赖程度较低。如痘病毒(L)等。2.原核寄主病毒 ( 噬菌体) 在溶原侵染和溶菌侵染中存在着不同的DNA复制方式。,基因组一般较小(3.0-6.0kb), 多数对于寄主细胞的依赖程度极高, 如细小病毒科、微小噬菌体科(X174)、联体病毒科。复制在细胞核内进行, 通过合成一条负链做为模板进行正链合成。,2. ssDNA Virus,细小病毒(Parvovirus) 无包膜,基因组约5kb, 线状, 含有一定比例的正意链(positive)，但大部分区域为负意链(negative)。复制过程中基因组5和3末端的回文序列(约100-200 base)可形成“发卡”/“Y”型结构。,rep cap,3,5,Coliphage X174基因组约5.4kb, 环状, 编码10-12种蛋白，其中三个为重叠基因(B/A、K/A+C、E/D)。共有三个启动子, 结构与E. coli的启动子相似。复制过程中单链DNA形成双链中间形式 (RF: 超螺旋ds环状和松弛ds环状), 有“复制叉()”和“滚环 () ”两种过程。,ss(-) ds(+ and-) 蛋白质 mRNA,ss(+),M13-phage, circular, 6.4 kb.,双生病毒（联体病毒，Geminivirus）circular, one or two segments (A & B), 2.5-3.0 kb, or 4.8-5.6 kb.,以呼肠孤病毒(Reovirus)为代表，球形粒子，双层衣壳。基因组16-30kbp，分为10-12个节段，长度不等(呼肠孤病毒10-12个片段; 囊状噬菌体 3个片段)，多为单顺反子，5、3末端序列保守。正链RNA 5端为“帽子”结构, 3末端为polyA尾序, 负链RNA无此类结构。病毒颗粒核心含有RNA聚合酶, 在酸化作用下病毒部分脱壳, 形成亚颗粒(ParticleSubviral particleViral coreRNA+内衣壳)。在亚颗粒中，以负链为模板产生单顺反子RNA(mRNA), 并表达各种蛋白。在侵染过程后期方以正意链(mRNA)为模板合成负链，并形成双链基因组片段-以全保留方式在寄主细胞质中进行复制。,3. ds RNA Virus,呼肠孤病毒 10 segments, linear, total 23.7kbp,轮状病毒(Rotavirus) -11 segments, linear, total genome length from 16.5-21 kb,斐济病毒属(Fijivirus)RBSDV 10 segments, linear, total genome length c. 29 kb,植物呼肠孤病毒属(Phytoerovirus) -RDV 12 segments, linear, total length c. 25 kb,囊状噬菌体 (Cystovirus), 6 phage3 segments, Linear, L 6374 bp, M 4057 bp S 2948 bp.,4. ss(+) RNA Virus,包含病毒种类最多, 约占病毒总数的70%以上。基因组RNA可做为mRNA, 在侵入寄主细胞后可立即翻译产生蛋白质。具体复制、表达策略因病毒基因组结构不同而存在极大的差异。在这些表达策略中许多是RNA病毒所特有的，与它们的寄主细胞以及DNA病毒差别极大。,真核生物: DdRp在细胞核内转录产生mRNA, 多为单顺反子。存在转录后加工过程, 对5及3末端分别加“帽子”结构和PolyA尾序, 并切割去除内含子后, 方能产生具有活性的mRNA, 在细胞质内进行翻译。原核生物: 以DdRp转录产生多顺反子mRNA; 聚合酶在DNA模板上以35方向移动, 首先产生mRNA的5末端, 转录与翻译同时进行。RNA病毒: 在细胞质内，以RdRp转录产生mRNA，基本上不存在转录后的剪切加工。多采取一种以上的复合策略对不同的基因进行表达, 这种表达不仅要与寄主的转录、翻译系统相一致, 而且体现了对遗传信息最大程度的“节约”。,(FMDV),Genomic RNA is infectious - Characteristics of (+)sense RNA virus ! There is a long (600-1200 nt) 5 UTR (IRES) and a shorter 3 UTR (50-100 nt). The genome encodes a single polyprotein. Both ends of the genome are modified, the 5 VPg (basic protein, 23 AAs), and 3 Poly(A)n.,病毒RNA的末端结构5末端-原核生物病毒多为焦磷酸或三磷酸核甘残基; 真核生物病毒多含有7-甲基化的鸟嘌呤核苷“帽子” ; 一种被称为Vpg (Viral Genome Associated Protein)的小分子蛋白(2.520 kDa), 经常存在于以多肽蛋白为最初翻译产物的基因组RNA中。3末端-多数RNA病毒具有高度有序的3末端二级结构, 如一些真核生物病毒中的tRNA结构及一些病毒中的PolyA尾序。,1.多肽蛋白(Polyprotein)方式-小RNA病毒科、马铃薯Y病毒科,2. 亚基因组RNA(subgenomic RNA)方式-TMV,4. 分离基因组(Divided genome)方式-BMV,3. 通读蛋白(read-through)方式-CarMoV,6. 框架重叠(Overlapping reading frame)方式-TBSV,5. 移码(Frameshifting)方式-red clover necrotic mottle,5. ss(-) RNA Virus,基因组主要特征负链RNA基因组病毒RNA转录产生正链mRNA裸露的 RNA不具有侵染性基因组分离或否，均具有包膜，粒子中多含有RdRp（RNA-dependent RNA polymerase) 表达策略 以病毒粒子携带的RdRp起始转录过程, 产生单顺反子mRNA。,弹状病毒 (Rhabdovirus) 既可感染动物，又可感染植物。如水泡性口膜炎病毒、狂犬病毒、莴苣坏死黄化病毒。基因组不分段,线形, 11-15 kb，通常为负意。含有5个以上基因,每个基因都有独立的转录起始序列和终止序列 。转录终止序列末端为PolyA加尾信号(TAATAAAA), 3末端的Leader区与5末端的Trailer区互补程度较高，可形成“锅柄”状结构。,L与T区域的互补(负意链序列)RV 3 UGCGAAUUGUUGUUUUGGUCUCUUCUUUUU 5 ACGCUUAACAAAUAAACAACAAAAAUGAGALNYV 3 AAUGCCUGUUAUUAUCUUCUUUUUUUAGUUCA 5 ACGGACGAUAAUAAAAUCAAAAAGUCCAAU,3 HO-UCG(C/U)UUUCGUCC-/-AAAAAA-GGAACAAAGAUGAppp 5,流感病毒的基因组由7-8个单链负意RNA片段构成。所有片段的5和3末端都具有基因组复制所必需的相同核酸序列。这些序列之间是互补的。在病毒颗粒内，基因组片段的末端以碱基配对结合到一起，形成一种被认为是与复制有关的“锅柄”状结构。,球型病毒，直径70-120nm。根据核心抗原(RNP core)和表面抗原(M)的不同，分为 A、B、C三个类型。不同病毒株系的双重侵染可导致病毒基因组分重组(Pseudorecombination),并因基因组自发的点突变而发生抗原漂移 (antigenic shift)。这种多样性重组可能是新株系产生并流行的原因之一 !,流感病毒,6. RNA/DNA genome with reverse transcription processing -在病毒基因组的复制过程中存在逆转录机制,线形 ss(+) RNA,二倍体, 单倍体长 7-11 kb以基因组二倍体RNA为模板逆转录产生双链DNA, 两条RNA模板均参与双链DNA原病毒(Provirus)的复制。逆转录酶(RTase)是一种具有多重功能的多肽复合体; LTR(Long Terminal Repe