微生物实验报告

,微生物实验报告产青霉素酶杆菌的分离、优化、诱导及酶活测定,一,二,三,四,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,目录,实验结果,实验操作,分析讨论,简介,一、简介,枯草芽孢杆菌广泛分布于土壤及腐败的有机物中，易在枯草津汁中繁殖而得名。本实验中通过从土样中获得枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.70.823微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.60.91.01.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。枯草芽孢杆菌可产生青霉素酶，并且青霉素和磷酸盐对其有诱导作用，本实验中通过青霉素对其诱导，从而进行菌种的优化。,一、简介,青霉素酶是-内酰胺酶的1种,其作用机理是水解-内酰胺类抗生素的-内酰胺环，使抗生素失去其活性，是致病菌产生耐药性的重要原因之一，因此对青霉素酶的研究在青霉素用于临床不久便全面展开了。人们在研究青霉素酶的过程中，除了发现它的有害一面外，也发现了一些有利的方面。如:在-内酰胺类抗生素药品的质量检验中，利用青霉素酶进行无菌检查是一种非常有效、简便、快捷的方法，可定量检验出青霉素类药品中污染微生物的程度。因此研究青霉素酶有了另一番意义。青霉素作诱导剂使用，细胞上特殊接受体与青霉素结合成分 ( penici l l i n 2binding component , PBC) 相似，可用青霉素结合成分与诱导剂的 “亲和力” 不同来解释青霉素酶产率的高低。PBC与诱导剂相结合是青霉素酶合成过程中很重要的影响因素之一。,二、实验过程,如图为大致的 操作过程,二、实验过程,实验日程4月8日 青霉素浓度梯度平板的制备，斜面培养基的配制，灭菌。4月9日 采集土壤样品及土壤样品的处理，将所得的实验所用菌液用平面 涂布法接种到做好的培养皿上，放入37恒温培养箱培养24h。4月15日 镜检。挑取杆菌接种到10单位的梯度培养基上。4月22-5月5日 优化菌种。增加青霉素素浓度度从10、20、50、100、500、 1000、 2000、 5000、 10000、 20000单位进行重复优化， 增加枯草芽孢杆菌的产酶能力，并将10000万单位的菌种进行 斜面保存。5月6日-13日 摇瓶发酵。对上面得到的10000单位的菌种进行发酵培养，并 对发酵液稀释后进行酶活测定。5月13日-17日 菌株诱变 5月20日 将一万单位的保存菌种放入1000、 2000、 4000、 8000、 10000单位的青霉素液体培养基中进行培养并观察菌种生长状况,二、实验过程,器材：37恒温培养箱、恒温摇床、分析天平、碱式滴定管、高压灭菌锅、接种环、三角瓶、移液枪、注射器、培养皿、三角棒、酒精灯、移液管、洗耳球、恒温水浴锅、电磁炉、电磁锅、烘箱等。材料：土壤（30教旁的草地土）160万单位/0.96g青霉素、硫代硫酸钠固体、碘固体、可用性淀粉。,二、实验过程,细菌培养基：蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 氯化钠 4g 蒸馏水 1000mL（若为固体培养基，加20g琼脂），pH7.4 斜面培养基：蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 氯化钠 4g 琼脂 20g 蒸馏水 1000mL,pH7.4,二、实验过程,发酵培养基： 蛋白胨 15g 甘油 50g 氯化钠 4g 0.1硫酸亚铁(FeSO47H2O)溶液 0.5ml 枸橼酸钠 5.88g 20硫酸镁(MgSO47H2O)溶液 1ml 磷酸氢二钾 4g 肉浸液 1000ml 对于上面的3种培养基，为了适宜枯草芽孢杆菌的生长和产酶，进行pH的调节。灭菌后pH7.07.2（由于灭菌后不好调pH，因而灭菌前调pH7.27.4，查资料知灭菌后pH降0.2左右）,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,二、实验过程 从土壤中分离菌种并接种培养,涂布培养,青霉素浓度梯度平板的制备,青霉素溶液的制备,处理土样，获得菌液,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,二、实验过程菌种的筛选,镜检,水洗,干燥,染色,固定,涂片,菌种筛选,二、实验过程,细菌培养基：蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 氯化钠 4g 蒸馏水 1000mL（若为固体培养基，加20g琼脂），pH7.4 斜面培养基：蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 氯化钠 4g 琼脂 20g 蒸馏水 1000mL,pH7.4,二、实验过程,菌种优化,10单位,保存菌种（1万单位）,500、 1000 单位（固液）,20、 50、 100单位,1万、 2万单位,斜面培养基的配制：配制150ml斜面培养基（配方见实验材料）、倒入试管中（约占试管1/3体积），121高压灭菌30min。待培养基冷却到45左右后，摆成斜面后备用。,二、实验过程,摇瓶发酵1、配制100ml液体发酵培养基3个，121灭菌30min，配方如上面实验材料，然后加入加入上述配得的10万单位的青霉素溶液10ml，得到1万单位的青霉素液体发酵培养基。2、将保种的1万单位的青霉素接种到发酵培养基上，放入恒温摇床培养24h。3、观察个培养基的浑浊成度。9、对发酵液处理，进行下面的酶活力测定。,二、实验过程,青霉素酶活力测定准备工作：1、青霉素酶溶液制备 2、磷酸盐缓冲液(pH7.0)的制备 3、醋酸钠缓冲液(pH4.5) 4、碘滴定液的制备 5、硫代硫酸钠滴定液的配制 6、青霉素溶液的配制,二、实验过程,测定：实验组：精密量取青霉素溶液50ml,置100ml量瓶中，预热至37后，精密加入已预热的青霉素酶稀释液25ml，迅速混匀，在37准确放置1小时，精密量取3ml，立即加至已精密量取的碘滴定液(0.01mol/L)精密量取碘滴定液(0.1mol/L)10ml，置100ml量瓶中，用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释至刻度25ml中,在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L) 滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失。 空白组：取已预热的青霉素溶液2ml，在37放置1小时，精密加入上述碘滴定液(0.01mol/L)25ml，然后精密加青霉素酶稀释液1ml，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定。,二、实验过程,计算方法： E(BA)MFD100 E为青霉素酶活力，单位(ml.小时)； B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml； A为样品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml； M为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol/L； F为在相同条件下，每1ml的上述碘滴定液(0.01mol/L)相当于 青霉素的效价单位； D为青霉素酶溶液的稀释倍数。,紫外诱变,繁殖体的获得,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,二、实验过程,倒、涂平板,菌株诱变,25培养,二、实验过程,再摇瓶培养由于诱变未得到想要的菌种，为证明获得了耐1万单位/ml的菌种，对保存的1万单位的菌种进行摇瓶培养观察结果。1.配制5管5ml的液体培养基，灭菌冷却。2.分别加入0.5ml、0.4ml、 0.2ml、 0.1ml、0.05ml,10万单位的青霉素溶液，得到10000、 8000、 4000、2000、 1000单位的青霉素培养液。3.挑去保存的10000单位的菌种接种后，37，摇瓶培养24h观察菌种生长状况。,三、实验结果,筛选结果,三、实验结果,菌种优化结果,三、实验结果,酶活力测定结果三个发酵培养菌液进行测酶活，对比后酶活最大的一个。发酵培养基酶活力：结果数据记录：稀释1000倍 D=1000 B-A=0.2ml硫代硫酸钠滴定B液浓度0.01mol/L（经硫代硫酸钠直接滴定碘准确测出的浓度）碘滴定液浓度 0.01mol/L计算：E=(BA)MFD100 =0.20.017421000100 =148400单位(ml.小时) =14.84万,三、实验结果,最终摇瓶结果,青霉素单位从左到右依次为1000、 20