肠道微生态与中医药

肠道微生态与 中医药,肠道菌群调节剂：益生菌,E. Metchnikoff（1845-1961）,首先提出动物的肠道微生物系统 对维持其健康起关键作用的科学 家之一。发现保加利亚农民之所以健康长 寿与食用发酵的奶制品（Yogurt） 有关。首先发现了吞噬现象和吞噬细胞， 随之提出细胞免疫学说，认为机 体的免疫功能主要是吞噬细胞的 吞噬作用。1908年因其在免疫学方面的杰出 贡献，与P.Ehrlich（Germany） 一起获诺贝尔奖医学。,人体微生态学,人体有胃肠道、口腔、泌尿生殖道、皮肤和呼吸道五大微生态系统。 胃肠道微生态对人体最重要，研究最早、最多。肠道是体内细菌定植的主要场所，肠道定植的细菌具有数量巨大、多样化、复杂性和动态性的特点，构成了人体的肠道菌群（intestinal microflora）。肠道菌群从无到有，伴随着人的一生而变化，直至生命结束。,1.人体胃肠道正常菌群是经过长期历史进化在宿主内形成的定植微生物群落，他们对宿主是有益的和必需的，在正常状态下是无害的。2.在胃肠道中生活的细菌大约有1014个，由300500种微生物组成，相当于人体细胞的10倍，由厌氧菌、兼性厌氧菌、好氧菌组成，其中专性厌氧菌达9799 以上。,肠道菌群的王国,4.小肠是个过渡区，肠液流量大，足以将细菌在繁殖前冲洗到远端回肠和结肠。十二指肠正常菌群与胃相似；空肠细菌浓度一般小于105CFUml，主要为革兰氏阳性的需氧菌；而回肠末端细菌浓度为103 107CFUml，并且革兰氏阴性杆菌超过革兰氏阳性杆菌。5.大肠细菌的数量远远超过小肠，数量达10111012CFUm1。这主要是由于结肠内容物移动缓慢所致，且大肠内环境呈中性或弱碱性，有利于细菌大量繁殖。粪便干重的1/3为活细菌，其中厌氧菌的数量超过需氧菌的10010 000倍。,3.胃内由于胃酸的影响，细菌的种类和数目较少，通常小于103 CFUm1。在胃中仍可以分离出乳酸杆菌、酵母菌、链球菌、葡萄球菌等，但只有乳酸杆菌能被大量分离出来。,胃肠道微生态系统,定居于胃肠道的菌群 按照对宿主的作用可分为3类：,(1)共生型：为专性厌氧菌，是肠道的优势菌群，这些菌对宿主是有益无害的。主要为原籍菌（autochthony）或常驻菌(resident flora) ，包括：类杆菌属、优杆菌属、双歧杆菌属、瘤胃球菌属和梭菌属等专性厌氧菌，是对宿主发挥生理功能的菌群。,(2)条件致病菌： 在正常情况下，由于微生态环境的平衡状态，这些细菌数量少，不会致病，而且是保持微生物群落生态平衡的必要组成部分，但在病理情况下，其数量异常增多，就可致病。 主要为外籍菌（allochthony）或过路菌(transient flora),如大肠杆菌和链球菌等，流动性大，有潜在致病性。,(3)病源菌： 大多为外籍菌群，长期定植的机会少，生态平衡时这类细菌数量少，不会致病，但数量超出正常水平，就会使人体发病。,肠道菌群的生理作用,（1） 营养作用（2） 促进结肠上皮细胞的增值和分化（3）保护作用 生物屏障作用（4）免疫作用（5）抗肿瘤作用,1.营养作用,（1）物质代谢作用： 肠道菌群可以发酵没有消化的食物残渣和上皮细胞产生的粘液。 （肠道微生物区系基因的多样性提供了明显不同于宿主的酶的多样性和生化途径的多样性）。 糖类发酵是主要的能量来源：主要包括不能消化的糖(抗消化淀粉、纤维素、半纤维素、果胶和树胶)和一些没有消化的寡糖，同时也能分解部分的多肽和蛋白质。 物质代谢的终产物主要是短链脂肪酸。主要的短链脂肪酸是乙酸、丙酸、丁酸。丁酸，主要被肠上皮细胞吸收，是肠上皮细胞的主要能量来源。乙酸与丙酸，主要由门静脉转运到肝脏，由肝脏代谢。,（2） 合成作用： 肠道厌氧菌可以合成多种维生素如B1、B2、B12、A、E、K等，且可产生多种微量元素与矿质离子，参与钙、镁、铁等离子的吸收。矿质离子的吸收有利于糖等物质代谢顺利地进行。,2 促进结肠上皮细胞的增值和分化,经研究发现同定植有正常微生物的小鼠相比，无菌小鼠中隐窝上皮细胞的更新率降低，隐窝细胞的数目较少。 这说明胃肠道的微生物影响细胞的增值。上皮细胞的分化与定植的微生物有关。微生物代谢产生的短链脂肪酸促进上皮细胞的分化和繁殖。,3. 保护作用 生物屏障作用,定居于肠道内的正常菌群构成了机体一道十分重要的屏障，能阻止潜在的致病菌的入侵或外袭菌在粘膜上的定植。 通过实验发现，无菌动物对条件致病菌有较高的敏感性，定植抗性也限制了条件致病菌在胃肠道的生长。 肠道厌氧菌对于维持正常的肠蠕动起着重要的作用，而正常的肠蠕动是阻止致病菌在肠道定植的一个重要手段，而且厌氧菌产生的短链脂肪酸使肠腔内呈酸性，氧化还原电位低，不利于致病菌的繁殖。,4. 免疫作用,正常菌群促进免疫器官的发育成熟在无菌动物的胃肠粘膜上，淋巴细胞较少，并且血液中免疫球蛋白的浓度较低；但把无菌动物暴露于普通条件下，淋巴细胞的数目迅速增长，血清中免疫球蛋白的浓度上升。 实验也发现：双歧杆菌能激活机体的吞噬活性，促进特异性和非特异性抗体的产生。乳酸杆菌促进辅助性T细胞的发育，诱导产生多种细胞因子预防Ig E介导的过敏反应。,5.抗肿瘤作用机制,益生菌通过抑制将前致癌物转化为活性致癌物的细菌的生长，直接抑制肿瘤细胞的生长；或与活性致癌物结合而抑制其吸收等方式抑制肿瘤的发生。 双歧杆菌还可通过促进单核巨噬细胞的活性，增强肿瘤局部的免疫反应，改善肿瘤患者T 淋巴细胞亚群的分布，提高机体细胞免疫功能等作用而发挥抗肿瘤作用。 微生物代谢产生的短链脂肪酸，丁酸在体外抑制肿瘤细胞的繁殖，促进细胞的分化，即丁酸促进肿瘤细胞向非肿瘤细胞的转化。,人体胃肠道菌群的生理性演替,人的一生中经历两次大的生理演替。 第1次肠道菌群的变化。婴儿刚出生时肠道是无菌的，出生几小时，肠道内即出现大量的需氧菌和兼性厌氧菌。但23 d后，上述需氧菌和兼性厌氧菌大幅度下降，代之以严格厌氧菌增加(主要是双歧杆菌)。出生后的57 d，双歧杆菌的增长达到高峰，然后趋于稳定，成为婴幼儿期的肠道菌群特征。 这一过程中，分娩方式(自然出生和剖腹产等)和饮食类型(母乳喂养和代乳品喂养)以及其它环境因子也影响菌种的定植。在发达国家和发展中国家以及不同医院出生的婴儿定植菌的类型有所不同。,第2次菌种变化发生在幼儿的离乳期，儿童由混合喂养转向成人饮食，这时类杆菌、厌氧链球菌等厌氧菌逐步增多，双歧杆菌逐步减少到总菌数的10左右，而且双歧杆菌的类型也由婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌转变为成人型长双歧杆菌和青春型双歧杆菌。 就健康成年人而言，整个成年期稳定于这一菌种结构，进入老年期，双歧杆菌进一步减少，有的个体甚至完全不能检测出。,微生态平衡,正常肠腔内的菌群通过宿主与自身的调节机制达到在宿主内相对稳定的状态主要通过以下几方面达到平衡状态：（一） 宿主因素1. 在胃酸的作用下，大部分细菌被杀死；2. 肠道蠕动使得大部分细菌排向肠腔下端移动排除；3. 肠道分泌物如胆酸、溶菌酶等可抑制细菌生长,（二）微生物因素 1、微生物之间的相互作用，包括兼性厌氧菌可利用氧进行繁殖，有利于专性厌氧菌的生长，以及许多细菌产生的细菌素可抑制异种菌的生长，使菌群保持稳定状态。 2、一些细菌产生的有机酸使肠腔内pH值下降，有利于厌氧菌的大量生长。 3、非致病菌在肠上皮细胞黏附位点的占据抑制了致病菌的入侵，同时在生态位点对营养的争夺也限制了菌的过度繁殖。,菌群失调,肠道微生物通过以上因素达到动态的、相对稳定的、协调的微生态平衡是机体健康的保证和象征。一旦打破这种平衡状态，就易引起菌群失调。 抗生素是引起菌群失调的常见原因。抗生素，特别是广谱抗生素的使用，在杀死敏感菌的同时引起大量非敏感菌的繁殖或外籍菌的入侵与繁殖，例如抗生素常引起艰难梭菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等的增多，从而导致抗生素相关性腹泻，严重时出现伪膜性结肠炎。抗生素还易引起耐药菌株的扩散，导致微生态失调。,肠道菌群失调相关疾病,1.腹泻、便秘2.肠易激综合征3.炎症性肠病4.结直肠黑变病、癌变5.肝病6.消化道外科手术后,流行病学调查发现，结直肠癌高发区与低发区人群肠道菌群组成方面有很大差异，不同饮食习惯的人群，肠道菌群构成截然不同，同样地，患结直肠癌的危险性也不同，提示肠道菌群的变化与结直肠癌的发生、发展密切相关。 肠道菌群失调是诱发结肠癌的关键因素。无菌动物结肠炎和结肠癌的发生率明显降低甚至不发生，但是一旦将失调的肠道菌群移植到无菌动物体内，这些动物免疫功能就会降低，结肠炎和结肠癌的发病率也会随之明显上升。,肠道微生态系统与结直肠癌的联系,肠道菌群紊乱导致结直肠癌发生的原因,一方面，在结肠部位肠道菌群分布密度最高，肠道菌群稳态一旦失衡，对于结肠疾病的发生具有非常重要的诱导作用。另一方面，肠道菌群失调引起肠道胆汁酸代谢紊乱、短链脂肪酸含量减少、肠黏膜免疫功能失调，促进结肠上皮增生和对致癌物的易感性增加。,丁酸盐与结肠组织健康的关系,随着二代测序技术的发展，肠道微生物与人体健康越来越受到人们的重视。2014年Louis P发表在“Nat Rev Microbiol”一文中指出，肠道菌群的稳态对于多种疾病的预防具有重要的意义，益生菌中所含的双歧杆菌可以抑制结肠上皮细胞的K-Ras-p21表达，发挥抗肿瘤的作用；肠道中的某些菌群能代谢碳水化合物生成结肠组织所必须的短链脂肪酸（SCFAs），吸收到粘膜上皮细胞中的SCFAs构成大肠细胞的主要能量来源，而其中丁酸是最重要的SCFAs之一。 丁酸是产丁酸菌群梭菌属的合成产物，它可以为结肠上皮细胞直接提供能量来源，保护结肠上皮细胞的正常生长，通过刺激粘液分泌和紧密连接来保护粘膜完整性，并且充当抗炎剂，抑制结肠干细胞的异常增殖，发挥抗结肠癌作用，而当肠道菌群在外界环境或药物的作用下导致失调后，致病菌的某些代谢能力发生改变，使代谢产物如硫化氢、活性氧族ROS、次级胆汁酸等致癌性物质与正常稳态相比显著增多，引起结肠细胞凋亡，诱发DNA损伤并加速结肠癌的发生发展。越来越多的研究显示，肠道产丁酸菌与结肠组织健康密切相关。,中药与肠道微生态系的相互影响,中药在治疗胃肠道疾病时具有化药无法取代的优势，世界卫生组织（WHO）呼吁利用传统医药来预防和治疗腹泻等相关疾病。随着微生态学的发展，微生态学理论、方法开始被引入中草药药学的研究，人们逐渐认识到肠道内的微生态系对口服中草药药理作用的发挥有着重要作用，同时中草药又有助于维持生物微生态系的平衡，二者间不仅在理论上有共通性，而且在治疗疾病的过程中亦相互作用，相互影响。,中药来源于天然植物，成分众多，除含有具有直接医疗价值的有效成分外，还含有蛋白质、多糖、脂类、微量元素、维生素等营养成分，这使中草药，尤其中药复方具有多种药理效应。 中药经口服进入胃肠道后，首先同位于胃肠道的常在菌群接触，影响常在菌群的状态。大量研究表明，中药能够有效地调节患病动物胃肠道的微生态失调状态。,一、中药对肠道菌群的调理作用,1.中药对肠道菌群种类和数量的影响。 采用自制中药多糖合剂治疗林可霉素引起的小鼠肠道菌群失调性腹泻，结果该多糖合剂可有效扶植小鼠肠道中的双歧杆菌生长，控制腹泻症状。 中药扶正口服液(主要成分为人参、当归、猪苓、甘草等)能够扶植肠道正常菌群生长，调整菌群失调，认为其机制与正常菌群代谢产物挥发性脂肪酸增多有关。 用四君子汤纠正大黄灌胃制造的小鼠肠道菌群失调模型，发现该药对双歧杆菌和乳酸杆菌具有明显的增菌作用。,2.中草药对肠道菌群定位的影响。 对急性坏死性胰腺炎，清胰汤不但能显著抑制大肠杆菌和条件性致病类杆菌的增殖，保护双歧杆菌等有益菌，还能降低肠黏膜通透性，减少肠道细菌总位移率，具有和双歧杆菌合剂类似的效果。,近年来，国内在利用传统中草药调整肠道菌群方面取得一些进展。这些研究多集中在中草药对肠道菌群生长的影响上。根据国内外现有文献资料，中草药对肠道菌群的调整作用机制如下：,二、中草药对肠道菌群的调整作用机制,1.中药中的某些成分直接对肠道菌群的生长具有抑制作用。 部分苦寒中药如黄连解毒汤，在体外具有直接抑菌、杀菌作用，而相关的体内实验也证明，灌胃高剂量组的黄连汤可以导致双歧杆菌和乳酸菌数量的下降。,2.中药中的多糖类物质对益生微生物和致病微生物均具有扶植效应，但对益生微生物的扶植效果明显优于致病微生物。 因此，长势良好的益生微生物所产的代谢产物，又间接抑制了致病微生物的生长。而现有文献也表明一些中药在体外不具有抑菌效果，但是在体内可明显抑制致病菌的生长，间接验证了该假设的成立。,3.某些中药既可以扶植益生微生物的生长，又可以抑制致病菌的生长。 如金银花中所含的双歧因子可以促进双歧杆菌和乳酸杆菌的生长，而其含有的绿原酸、异绿原酸、木樨草素等抑菌成分，对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌则具有良好的抑制效果。,VS,随着对中药药效学、动力学研究的逐渐深入，人们认识到中药在机体内药效作用的发挥中，肠道菌群有着重要作用。 现代分子药理学研究认为，中药临床效应的分子基础是中药活性分子群。有别于中药活性成分，中药活性分子群主要是指中药口服后经消化道进入血液，发挥直接药理作用的分子群；而中药活性成分则多指在实验过程中能对某种药理指标产生作用的成分。两者之间既有联系又有区别：有时活性成分即是活性分子群，可直接进入血液发挥药理效应；更多的时候活性成分是活性分子群的前体，需要经过消化道菌群（主要是胃肠道菌群）的作用，转化而成活性分子群。,三、肠道菌群对中草药的代谢作用,肠内菌群对药物的代谢途径主要是分解反应，使药物的相对分子量减小，极性减弱，脂溶性增强，药效或毒效增强。 临床某些西药（ 乳果糖、吡啶等）也只有经过肠内细菌的代谢活化，使其从无活性或活性较低的前体转变为活性更高的有效成分后方能发挥药物的药理价值。,肠内菌对成分复杂的中药的代谢作用更为重要。例如： 对番泻苷的转化从80年代起日本学者对中药有效成分的肠菌群转化过程做了系统的研究工作。小桥恭一等 从人粪便中分离出多种番泻苷的代谢菌，其中Bifid obacteriumspSEN可以将番泻苷转化为番泻苷元，其代谢物中大黄酸蒽酮的致泻作用最强。,中药芦荟中可以分离出大量的芦荟大黄素苷，一种属于蒽酮骨架的葡萄糖苷，其本身也没有泻下作用，在人体肠道菌群的作用下，可以代谢为芦荟大黄酸蒽酮。,大黄与肠道微生态,大黄被称为中药“四大金刚”之一，具有泻下、利胆、保肝、降血脂等多方面的药理作用。大黄及含大黄的中药制剂在临床上运用广泛，使用频率极高。通过临床中药调查统计发现8000多种中药制剂中约有800多种含有大黄。尤以具有减肥功效的保健品中大黄及其蒽醌类成分的使用频率极高。,大黄在临床广泛使用,10% 含大黄中药制剂,8000多种中药制剂,大黄的安全性问题,但2001年美国国立卫生院在National Toxicology Program technical report series上报道了长期服用大黄素及蒽醌类化合物具有潜在的致癌风险，这使得使用大黄等蒽醌类中药的安全问题备受关注。随后国家科技部“十五”重点公关项目“中医药疗效及安全性基本问题”也对大黄毒性问题进行了系统研究，研究表明大黄中的游离型蒽醌化合物具有致突变作用。早在1986年，日本学者Mori等曾报道大黄中主要化学成分的母核1,8-二羟蒽醌结构具有致结肠及盲肠腺瘤样过度增生作用，此后研究者对大黄及其他含有蒽醌成分的药物（如：芦荟、番泻叶、鼠李皮等）进行了大量的致结肠癌作用的研究。1993年Siegers等在Gut杂志上发表了一项针对1095例患者的前瞻性研究结果显示，通过计算得出滥用蒽醌类轻泻剂者结直肠癌的相对危险性为3.04，明显高于未服该类药人群，并且发现与大黄含有相似蒽醌类成分的番泻叶被证明出有微弱的致结肠癌作用。,大黄产生结肠黑变病及致癌风险,Rohan M. Modi, Hisham Hussan. Melanosis Coli After Long-Term Ingestion of Cape Aloe, ACG Case Rep J2016;3(4):e157.,临床案例与动物研究表明长期服用大黄等蒽醌类制剂引起结肠组织色素沉积，产生致癌风险。,长期服用大黄等蒽醌类泻剂为什么会引起结肠黑变病？,文献检索,XIAO-AN LI, YAN ZHOU, SHU-XIAN ZHOU, HAI-RONG LIU, JIN-MEI XU,LONG GAO, XIAN-JING YU and XIAO-HUI LI Histopathology of melanosis coli and determination of its associated genes by comparative analysis of expression microarraysJ. MOLECULAR MEDICINE REPORTS 12: 5807-5815, 2015,进一步思考,长期服用大黄等蒽醌类泻剂为什么会引起结肠上皮细胞凋亡？是否由于大黄泻下成分直接诱导结肠上皮细胞凋亡？,文献调研：大黄主要化学成分,鞣质,土大黄苷,番泻苷A,番泻苷B,大黄素甲醚,大黄酸,大黄素,芦荟大黄素,大黄素-8-O-d-葡萄糖苷,大黄酚,泻下作用最强,进一步文献调研发现：番泻苷A泻下作用发挥依赖于肠道菌群,1 番泻苷A是大黄中的主要泻下成分,2 番泻苷A经双歧杆菌酶解后发挥泻下作用,Kento Takayama,* Norihiko Tabuchi, Masahito Fukunaga, and Nobuyuki Okamura，Rhein 8-O-D-Glucopyranoside Elicited the Purgative Action of Daiokanzoto (Da-Huang-Gan-Cao-Tang), Despite Dysbiosis by AmpicillinJ Biol. Pharm. Bull. 39, 378383 (2016),glc,glc,-葡萄糖苷酶,A,B,初步实验探索,番泻苷A体外对正常结肠上皮细胞系NCM-460增殖无显著影响,大黄的泻下成分在体外对正常人结肠上皮细胞无显著影响，因此大黄泻下成分引起的结肠黑变病可能由其他因素影响？,大量研究表明肠道菌群与结肠组织关系密切,Stephen J. D. OKeefe, Diet, microorganisms and their metabolites, and colon cancerJ.Nature Review, 2016,13(12):691-706.,肠道致病菌释放毒性代谢物诱导结肠细胞基因突变，诱发结肠癌。,肠道致病菌降解肠道黏连蛋白破坏肠道屏障功能，引起结肠炎症。,肠道菌群合成短链脂肪酸保护结肠组织，抑制结肠上皮细胞凋亡。,肠道菌群合成结肠组织生长所必须的营养物质，如：维生素，保护结肠组织。,进一步文献挖掘表明长期服用大黄引起肠道菌群紊乱,Audrey M. Neyrinck1, Usune Etxeberria1,2, Bernard Taminiau3, Georges Daube3, Matthias Van Hul1,4, Amandine Everard1,4, Patrice D. Cani1,4, Laure B. Bindels1 and Nathalie M. Delzenne, Rhubarb extract prevents hepatic inflammation induced by acute alcohol intake, an effect related to the modulation of the gut microbiotaJ Mol. Nutr. Food Res. 2016, 00, 112,进一步文献挖掘表明长期服用大黄引起肠道菌群紊乱,glc,-葡萄糖苷酶,glc,紊乱,肠道菌群,番泻苷A,代谢,紊乱,大黄引起结肠黑变病是否与肠道菌群有关？若有，其具体机制是什么？,科学假说,大黄影响肠道菌群稳态产生结肠黑变病风险,Gut microbiota,ApoptosisIntestinal mucosal damageMelanosis coli,Gut microbiota,实验方案,H&E staining,Immunofluorescence,q-PCR,High-throughput sequencing,GC/MS,番泻苷A配置为100mg/kg的母液，灌胃给予实验组小鼠，每组0.2ml母液，对照组小鼠灌胃给予0.2ml生理盐水，每天灌胃一次，持续12周。,番泻苷A对小鼠体重与结肠组织影响,番泻苷A抑制小鼠体重增长,番泻苷A引起结肠组织结构损伤,番泻苷A引起小鼠结肠组织色素沉积,番泻苷A诱导结肠组织脂褐素沉积,番泻苷A诱导结肠组织黑色素沉积,番泻苷A诱导结肠上皮细胞凋亡及隐窝细胞增殖,番泻苷A诱导结肠上皮细胞凋亡,番泻苷A诱导结肠隐窝细胞增殖,番泻苷A引起肠道炎症水平升高,番泻苷A诱导结肠组织炎症水平升高,小结,番泻苷A抑制小鼠体重增长。番泻苷A可能诱导脂褐素与黑色素在小鼠结肠组织部位沉积。番泻苷A诱导小鼠结肠上皮细胞凋亡与结肠隐窝细胞增殖水平升高。番泻苷A诱导小鼠结肠组织炎性因子表达轻度升高。番泻苷A体外对正常结肠上皮细胞系NCM-460增殖无显著影响。番泻苷A是否通过影响小鼠肠道菌群结构引起结肠黑变病？,番泻苷A对小鼠肠道菌群影响,番泻苷A引起小鼠肠道菌群结构改变,番泻苷A引起小鼠疣微菌门相对丰度升高,番泻苷A对小鼠肠道菌群影响,番泻苷A抑制小鼠肠道梭菌属相对丰度,番泻苷A对小鼠肠道菌群作用,番泻苷A抑制小鼠肠道梭菌属相对丰度,番泻苷A抑制肠道丁酸浓度,乙酸 CH3COOH,丙酸 CH3CH2COOH,丁酸 CH3CH2CH2COOH,番泻苷A抑制小鼠肠道丁酸浓度,小结,番泻苷A引起小鼠部分肠道菌群相对丰度与种类发生变化。番泻苷A抑制肠道梭菌属，而肠道梭菌属主要合成肠道短链脂肪酸丁酸。番泻苷A抑制小鼠肠道丁酸浓度。外源性给予丁酸或粪便移植法能否逆转番泻苷A对结肠组织的不良作用？,丁酸或粪便移植对服用番泻苷A小鼠结肠组织影响实验方案,H&E staining,Immunofluorescence,q-PCR,High-throughput sequencing,GC/MS,同时灌肠