氨基酸分析方法及仪器比较

氨基酸分析方法及仪器比较一、氨基酸分析方法分类氨基酸分析按其分离和检测方法的不同可分为三大类型。第一类是基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱法（IEC）。此类方法由 Stein 和 Moore 两人1958 年发明，并于 1972 年获诺贝尔奖，是当今国际标准和国家标准以及仲裁和涉外的方法。第二类是所有基于反相色谱分离、柱前衍生、荧光或紫外检测的高效液相法（HPLC）。第三类是阴离子交换分离直接安培法检测的离子色谱法 IC，严格说来，阴离子交换和阳离子交换都叫“IEC”，在此将阴离子交换分离、安培检测的方法归类为 IC，是因为这类仪器实际上就是离子色谱仪，只不过配置侧重点为氨基酸分析。本文中对三类方法多用简称。说明：1、PITC 异硫氰酸苯酯；OPA 邻苯二甲醛；FMOC 9-芴基甲氧羰酰氯；AQC 6-氨基-喹啉基-N-羟基琥贝酰亚胺-氨基甲酸酯；DABS-Cl 二甲基氨基偶氮苯磺酰氯。2、IEC 法也可使用柱后 OPA 衍生（荧光检测），可以降低检测限到 1pmol，但无法检测二级氨基酸。二、用户如何选择适合自己的方法和仪器氨基酸分析的方法和仪器多种多样，用户应该根据自己的实际应用情况和发展趋势来选择方法和仪器。选择时可参考以下几个方面：1、是否需要对分析结果负责（如对外出具报告等）IEC 仪器使用茚三酮柱后衍生法，符合国家标准和国际仲裁标准，而 IC 法和 HPLC 法虽然总体性能也比较稳定可靠，但其测量结果与茚三酮法有较大差异，且结果难以长期重复，这对于仲裁不利。目前，IC 法和 HPLC 法分析氨基酸一般仅用于不太深入的研究，而且主要是利用其灵敏度较高的特性。也有部分企业用来做内部质量控制（国家没有制定相关标准），但如果要考虑对外做样并出具结果报告，IEC 仪器是唯一选择。由于国内的氨基酸分析呈现急剧上升的势头，而很多单位经济能力有限，因此也确有不少单位购买专用氨基酸分析仪作为创收手段。2、一次进样需要出峰的数量是多还是少氨基酸种类繁多、性质接近，因此氨基酸分析是色谱界公认的难题，尽管现在有多种多样的方法，但没有任何方法能够保证所有氨基酸峰能够一次进样完全的分离。仅仅从分离程度来说，好的 HPLC 方法最多可以一次分离检测 20 种左右的氨基酸峰，IC 法最多可一次分离检测约 30 种氨基酸峰（理论上说来，IC 法可达到与 IEC 法相当的出峰数量，但金电极的基线漂移较大，保留时间太长的峰就难以定量分析），IEC 法最多一次可分离检测 50 种左右的氨基酸峰。从这个角度来说，如果您需要分析游离氨基酸样品，就应当选择 IEC 仪器。3、氨基酸分析频率高还是低 氨基酸样品分析频率如果达到每个星期至少 1 次，就可以算“频率较高”，少于每周 1 次就可以说是“较低”。频率较高时，应当仪器专用化（即便是用 HPLC 和 IC 法，也应专用于氨基酸分析），因为反复更换柱子和缓冲体系不仅麻烦、平衡时间长，难以保证分析结果的可靠性和重复性，而且容易损坏仪器。4、氨基酸样品总量是多还是少 总体的成本应考虑到做样成本，而不能只看仪器本身。HPLC 做氨基酸分析时，每根柱子只能进样 100500 针，而 IEC 仪器的柱子都超过 1000 针（sykam 柱子使用国产试剂时大于4000 针，使用进口试剂时大于 6000 针）。如果都使用国产试剂，HPLC 仪器单针成本平均 160 元人民币，IEC 仪器单针成本平均不到20 元人民币，IC 仪器单针成本平均 60 元人民币（IC 法无需衍生剂，但检测电极是消耗品）。此处计算了标样、缓冲溶液、衍生剂、柱子等消耗品价格，而仪器的维护保养费用相同（未计算）。下表是专用氨基酸分析仪 IEC、HPLC 和 IC（都配置自动进样，HPLC 加配氨基酸分析包）的总成本分析。也就是说，当分析样品量超过 1000 个（进样针数大于 2500），IEC 专用氨基酸分析仪就开始成为费用最低的仪器了。通常仪器的使用寿命超过 8 年（平均 10 年左右），只要每年的样品量大于 100 个，IEC 仪器就没有价格上的劣势。三、哪些仪器是“氨基酸分析仪” 我们已经比较了 HPLC、IC 和 IEC 这三大类氨基酸分析方法，总的说来，它们适合不同情况下的应用，虽然 IEC 茚三酮柱后衍生法适应范围更广泛，但仪器售价也明显要高。目前中国市场上号称是专用氨基酸分析仪的有很多，对于用户而言，也未必需要去分辩谁是真正的专用氨基酸分析仪，而且国家仪器名录甚至国际上都没有明确提出专用氨基酸分析仪的定义，但在中国市场，无论是使用者还是仪器厂家，一般都是把阳离子交换分离、茚三酮柱后衍生法仪器叫作“氨基酸分析仪”。这类仪器技术门槛较高，国内目前还没有厂家生产此类仪器，代表厂商有德国 sykam、日本 hitachi 等。而 IC 法仪器的代表是 Dionex 公司的 AAA-direct。四、IEC 仪器之间的比较 IEC 仪器也有几个厂家生产，用户该如何选择？第一，当然是满足分析需要的技术指标如分离度、重复性等要求，而其中的分离度又是更为重要的指标，因为，色谱理论一般以分离度达到 1.2 作为两峰基本分离的判定前提，只有峰分开了，才有意义去讨论定性和定量的重复性。第二，应考虑仪器的可靠性。如果仪器今天堵了、明天漏了，用户不仅要付出大量人力财力，分析结果的可信度也将大打折扣。第三，应考虑仪器的运行成本。例如是否可以使用国产试剂、柱子寿命（以多少次进样计算、而不以多少年计算）等。第四，应考虑仪器设计是否有利于氨基酸分析，例如是否有惰性气体保护（茚三酮极易被氧化）、是否提供在线脱气、是否提供溶液和样品的制冷控制等。第五，应考虑售后服务。分析过程中遇到困难是在所难免，厂家必须能够快速响应、尽快解决问题。另外