微生物工程12生产举例

第十二章 微生物工程 生产举例,提纲,第一节 抗生素生产工艺第二节 氨基酸生产工艺第三节 柠檬酸生产工艺第四节 污水的生物处理,第一节 抗生素生产工艺,重点：抗生素的生物合成；微生物的次级代谢与初级代谢的关系；抗生素生物合成的代谢调节机制；细胞生长期到抗生素产生期的过渡；酶的诱导作用；分解代谢产物的调节控制； 难点：抗生素生物合成的代谢调节机制；分解代谢产物的调节控制。,概 述,抗生素是微生物产生的具有生物活性的物质，它不但可以抑制其他微生物的发育与代谢，有的还可以抑制癌的发育与代谢，以及具有抗血纤维蛋白溶酶作用。 抗生素是人们使用最多的药物，也是制药工业中利润最高的产品。世界各国由发酵法生产的抗生素约400种，广泛应用的仅120种，其他主要是毒性大、成本高，无商业应用价值。 抗生素生产为近代微生物技术中最大产业之一，世界产量超过35000吨，不但在经济上占有重要位置，且为人类健康作出巨大贡献。,一、抗生素的分类,按生物来源、作用、化学结构、作用机制、合成途径可分为：表22-1,二、抗生素生产工艺,生产方法： 1、生物合成法： 传统方法 “工程菌”制造法 细胞融合技术法 2、化学合成法； 3、生物合成加化学合成法。,二、抗生素生产工艺,1、生物合成法： 传统方法 大多数抗生素是由放线菌和霉菌产生的。菌种是通过从土壤中分离、筛选获得，一般采用深层通风搅拌发酵罐生产。 传统方法目前存在很多不足，因此，人们采用基因工程和细胞融合技术，对抗生素产生菌进行了改造和重新设计，不仅可以制造出许多高效低毒的新型抗生素，还可改革工艺，使抗生素产量成倍地增长。,二、抗生素生产工艺,1、生物合成法： “工程菌”制造法 第一次由“工程菌”制造的全新抗生素麦迪紫红素A，是美国报道的。他们将产放线紫红素的部分基因插入产麦迪霉素的放线菌中，构建的“工程菌”产生了全新的抗生素。 我国新构建的生产丁胺卡那霉素的“工程菌”，就是把酰化酶基因克隆到卡那霉素产生菌中获得的。采用新的“工程菌”生产，避免了现国外通用的使用有毒光气生产的办法，新抗生素毒副作用小，对耐卡那霉素、庆大霉素致病菌临床疗效显著。,二、抗生素生产工艺,1、生物合成法：细胞融合技术法 对抗生素产生菌采用细胞融合技术的成果更为突出。橄榄色无孢小单孢菌细胞融合株抗生素产率比原菌株提高100倍。 目前DNA重组技术已广泛用于红霉素、链霉素等20多种抗生素的育种工作，可以预见不久将来会有更多的由“工程菌”生产的新型抗生素问世。,二、抗生素生产工艺,2、化学合成法 根据某种抗生素的化学组成和结构，通过化学合成的方法，可生产部分抗生素。 如：氯霉素、磷霉素等。 经过化学合成方法和控制条件的不断深入研究，越来越多的抗生素可用化学合成法生产。,二、抗生素生产工艺,3、生物合成加化学合成法 许多细菌逐渐出现了抗药性，已经证实某些抗药性因子位于细菌内的质粒上，质粒可以在细菌之间转移，结果抗性菌日益增多，抗生素疗效就越来越低。 为了对付细菌的抗药性，科学家对原有的抗生素进行了“整容手术”，细菌因再无法识别改头换面的抗生素而被抑制或杀死。 现在已能使用克隆了酰化酶基因的“工程菌”（大肠杆菌）高效率的生产半合成抗生素。临床现在使用的贵重特效药物先锋霉素（头孢菌素类）、氨苄青霉素，就是这类半合成抗生素类药物。国外已有几十种这类药物在实验室研制成功。,三、青霉素生产工艺,三、青霉素生产工艺,三、青霉素生产工艺,1、菌种：产黄青霉生长发育分六个阶段：期：菌丝生长期，适宜做种子；期：青霉素分泌期；期：菌丝体自溶期。,三、青霉素生产工艺,2、培养基： 碳源：乳糖、蔗糖、葡萄糖等； 氮源：玉米浆、麸皮粉、无机氮源； 前体：苯乙酸或苯乙酰胺；（一次0.1） 无机盐：S、P、Ga、Mg、K等。 铁离子有害， 控制在30g/ml。,三、青霉素生产工艺,3、发酵条件控制补糖：残糖降至0.6（PH上升）；补氮：氨氮0.05，补硫铵、氨水或尿素； PH：6.46.6，加糖、加酸、加碱调节；温度：前期，25-26；后期， 23；通气比：1：0.8；溶氧：氧饱和溶解度的30；消沫剂：玉米油、豆油或化学合成消沫剂。,三、青霉素生产工艺,4、青霉素的分离纯化过滤：板框、真空转鼓；萃取：醋酸丁脂，2-3次；脱色：活性碳，150-200g/10亿单位；结晶：浓缩结晶或直接结晶；洗涤干燥,第二节 氨基酸生产工艺,一、氨基酸生产工艺控制二、氨基酸生产工艺三、异亮氨酸、亮氨酸生产工艺,概 述,氨基酸可用作食品、饲料添加剂和药物。过去都采用动植物蛋白提取和化学合成法生产，现18种氨基酸均可采用发酵法和酶法生产，不仅成本下降、污染减少，还可组织大量生产，世界产量每年递增510。 在氨基酸产生菌选育中，过去多采用诱变育种方法，诱变结果不易控制，现采用基因工程和细胞融合技术，产量可成倍、甚至几十倍增加，生产成本大大下降。 如用基因重组构建的苏氨酸、色氨酸“工程菌”，比原始菌株提高产量几十倍（产酸达5060克/升），色氨酸成本从每公斤50美元降到23美元。用细胞融合构建的精氨酸融合株，精氨酸产量达108克/升，比其他生产菌株高2倍多。,工业上重要氨基酸简介,一、氨基酸生产工艺控制,1、菌种：细菌，野生型或营养缺陷型、结 构类似物突变菌种；2、培养基： 碳源：淀粉水解糖、糖蜜等； 氮源：铵盐、氨水或尿素，豆饼、麸皮粉； 无机盐：S、P、Ga、Mg、K等； 生物素：影响细胞膜透性，对氨基酸分泌影 响很大，来源：玉米浆、麸皮、糖蜜。,一、氨基酸生产工艺控制,3、发酵条件控制PH：通过流加氨水或尿素来控制；温度：菌体生长和产物形成最适温度 不同，并随菌种不同而异；溶氧：不同氨基酸发酵有不同要求；消沫剂：玉米油、豆油或化学合成消沫剂。,一、氨基酸生产工艺控制,4、氨基酸分离纯化过滤：板框；提取：等电点沉淀；脱色：活性碳，（过滤除活性碳）；精制：离子交换或重结晶法。,二、氨基酸（赖氨酸）生产工艺,重点： 赖氨酸生物合成途径及代谢调节机制； 酵母和霉菌的赖氨酸生物合成途径和调节机制； 赖氨酸生产菌的育种途径。 难点：天冬氨酸族氨基酸生物合成的代谢调 节机制。,二、氨基酸生产工艺,氨基酸本身的合成在不同生物体中，有较大的差异，然而许多氨基酸的合成途径在不同生物体中也有共同之处。 按照起始物可将氨基酸的合成分成几个家族： 谷氨酸族（-酮戊二酸族） 包括：谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸和脯氨酸； 丙酮酸族 包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸； 天冬氨酸族（早酰乙酸族） 包括：天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸； 磷酸甘油酸族 包括：甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸； 芳香族 包括：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸； 另外，组氨酸的合成为单独的一条途径。,氨基酸的生物合成,1、天冬氨酸族生物合成途径,天冬氨酸族氨基酸合成可以以草酰乙酸或天冬氨酸为原料，合成苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸。天冬酰氨 甲硫氨酸 琥珀酰高丝氨酸 合成酶草酰乙酸天冬氨酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸-半醛高丝氨酸苏氨酸 异亮氨酸 DDP合成酶 二氨基庚二酸赖氨酸,2、天冬氨酸族生物合成的代谢调节机制,在细菌中，虽然天冬氨酸族氨基酸生物合成途径是相同的，但是其代谢调节机制是多种多样的。1）大肠杆菌K12天冬氨酸激酶天冬氨酸-半醛脱氢酶 DDP合成酶（赖氨酸分支的第一个酶）高丝氨酸合成酶（HD）（通向苏氨酸、蛋氨酸分支的第一个酶）,2、天冬氨酸族生物合成的代谢调节机制,2）黄色短杆菌 其赖氨酸生物合成调节机制比大肠杆菌简单，其天冬氨酸激酶只有一种，该酶具有两个变构部位，可以与终产物结合，当两种终产物同时过量时，该酶活性受到抑制。3）乳糖发酵短杆菌赖氨酸合成调节,3、酵母和霉菌的赖氨酸生物合成途径,就赖氨酸合成途径来讲，不同种类的微生物途径不同，可以归纳为两条途径： 1）为经过二氨基庚二酸的生物合成途 径，如细菌、DPA； 2）是AAA，酵母菌、霉菌经过-氨基己 二酸AAA途径合成赖氨酸。,4、氨基酸生物合成的调节机制,反馈抑制与优先合成 氨基酸生物合成的基本调节机制有反馈抑制与在合成途径分支点处的优先合成。 反馈抑制：ABCD E D 优先合成：ABC F G,5、其他特殊的控制机制,1）终产物控制 催化分支合成途径共同部分的初始酶，在仅一种氨基酸终产物过剩时，完全不受或微弱或部分地反馈抑制（或阻遏），只是在多数终产物共存下才强烈地控制。有以下几种情况： 协同（或多价）反馈抑制 合作（或增效）反馈抑制 同功酶控制 积累反馈抑制,5、其他特殊的控制机制,2）顺序控制： E D ABC F GA B C D,6、赖氨酸生产菌的育种途径,出发菌株的选择：要求代谢比较简单的细菌（如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆菌等）1）优先合成的转换：渗漏缺陷型的选育。2）切断支路代谢：营养缺陷型的选育。3）抗结构类似物突变株的选育（代谢调节突变）。4）代谢互锁 解除代谢互锁的方法： 选育亮氨酸缺陷型菌株，或者以抗AEC的赖氨酸的生产菌为出发菌株，经诱变得到抗AEC兼抗亮氨酸缺陷型菌株。 选育抗亮氨酸结构类似物的突变株，从遗传上解除亮氨酸对DDP合成酶的阻遏。 选育对苯醌或喹啉衍生物敏感菌株，这是一种寻找亮氨酸渗漏缺陷型菌株的有效方法。,6、赖氨酸生产菌的育种途径,5）增加前体物的生物合成和阻塞产物的生成： 方法： 选育丙氨酸缺陷型； 选育抗天冬氨酸结构类似物突变株； 选育适宜的活性比突变株；6）改变细胞膜的透过性7）选育温度敏感突变株8）应用细胞工程和遗传工程育种9）防止高产菌株回复突变,7、赖氨酸生物合成途径,大肠杆菌的赖氨酸生物合成途径：图23-2,8、赖氨酸发酵条件控制,溶氧：特别重要，不足，会使赖氨酸 生产受到不可逆抑制；PH：通过补加氨水来控制；温度：32；前体：甘氨酸或丝氨酸。（短小假单胞菌）,三、异亮氨酸、亮氨酸生产工艺,1、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的生物合成途径： 图23-4,2、异亮氨酸发酵,两种方法：添加前体发酵法和直接发酵法添加前体发酵法： 苏氨酸脱水酶受异亮氨酸的反馈抑制； 添加前体物质D-苏氨酸、-酮基异戊酸； 绕过异亮氨酸对苏氨酸脱水酶的反馈抑制。直接发酵法： 抗反馈调节突变株，解除对苏氨酸脱水酶的反馈抑制。,3、亮氨酸发酵,亮氨酸高产菌株的选育：1）选育-酮基异丁酸抗性突变株，解除对异亮氨 酸、亮氨酸和缬氨酸生物合成酶系的阻遏作用；2）选育异亮氨酸缺陷型回复突变株， 其-异丙基苹果酸合成酶不再受亮氨酸的反馈抑制；3）-噻唑抗性兼蛋氨酸、异亮氨酸双重缺陷型突变株，用于亮氨酸的发酵生产。,第三节 柠檬酸生产工艺,重点：柠檬酸生物合成途径；柠檬酸生物合成的代谢调节；三羧酸循环的调节。 难点：柠檬酸生物合成的代谢调节；糖酵解及丙酮酸代谢的调节。,一、柠檬酸发酵生产工艺,（一）柠檬酸合成途径柠檬酸又名枸橼酸，学名-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。 柠檬酸合成途径： 丙 乙酰COA葡萄糖 酮 柠檬酸 酸 草酰乙酸,氧化脱羧,羧化,EMP,（二 ）柠檬酸生物合成的代谢调节,1、糖酵解及丙酮酸代谢的调节1）在正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑制作用，而ATP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。2）比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成（合成）代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。3）丙酮酸激酶是EMP途径的第2个调节点，在某些真菌得到证实，但黑曲霉未被证实。,（二 ）柠檬酸生物合成的代谢调节,2、柠檬酸生物合成代谢调节的特点：1）TCA环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA环的第一个特点。2）第二个特点：黑曲霉菌体内-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（TCA环被阻断）。3）氧和pH值对柠檬酸发酵的影响很大。,（二 ）柠檬酸生物合成的代谢调节,3、柠檬酸积累的原因：Mn2+缺乏抑制蛋白合成NH4 有一条呼吸活动强的不产生ATP的侧呼吸链；由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡： 柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7 同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬 酸积累。随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。,（三）柠檬酸发酵生产工艺,（三）柠檬酸发酵生产工艺,1、菌种： 黑曲霉。2、一级种子培养： 麦芽汁琼脂斜面，351，培育5天； 麸皮三角瓶， 351，培育10天； 转种子罐。,（三）柠檬酸发酵生产工艺,3、种子罐培养：培养基：玉米淀粉水解糖+淀粉水解滤渣；空消：种子罐、分过滤器，130，30分；实消：列管加热至80，直接进蒸汽至 125，15-20分；接种：冷却至351，接麸曲种1；培养： 351，罐压：0.1Mpa，风量： 1：0.1- 0.16，时间16-30小时。,（三）柠檬酸发酵生产工艺,4、发酵：培养基：玉米淀粉水解糖；空消：发酵罐、分过滤器，130，30分；实消：列管加热至80，直接进蒸汽至 125，15-20分；接种：冷却至351，接种子罐菌种10；培养： 351，罐压：0.1Mpa，风量： 1：0.1- 0.15，时间50-60小时。,二、柠檬酸提取生产工艺,1、发酵液过滤：带式过滤机2、中和：滤液中除含柠檬酸外，还含可溶性的残 糖以及蛋白质、金属离子等杂质。利用 柠檬酸钙难溶于水的特点，与杂质分离 的过程。3、酸解：中和所得钙盐经过滤、洗涤，与硫酸反 应生成柠檬酸和硫酸钙沉淀，过滤，滤 液含较纯的柠檬酸。,三、柠檬酸精制生产工艺,1、离子交换： 阳离子交换：主要除钙离子、铁离子； 阴离子交换：主要除硫酸根、氯离子；2、蒸发浓缩：外循环减压蒸发，65；3、结晶分离：高温连续或分批冷却结晶；4、干燥包装：离心、沸腾干燥、质检、装 袋、封口。,第四节 污水的生物处理,污水包括：1、水体的污染富营养化；2、传染性病源体的污染；3、有毒化合物的污染；4、高分子难降解化合物的污染；5、重金属如铬、镉、铅、汞、硒等的污染；6、放射性物质的污染。,污水生物处理的主要方向,污水的处理有生物、化学和物理方法。 目前，污水生物处理的主要方向是富营养化、有毒及高分子难降解化合物的污染。 水的富营养化是危害最广、最大的污染。 微生物处理法是最常用、最有效、最关键的处理方法，目前已在生活污水、生产污水的处理上得到广泛应用。 通过构建具有多种特殊功能高效降解力的“工程菌”，过去一直公认难被生物降解的100多种有毒