储炬---氮源在工业发酵中的重要调控作用

储 炬华东理工大学国家生化工程技术研究中心(上海）2016.4.17， 湖北宜昌,氮源在工业发酵中的重要调控作用,2016年工业生物过程优化与控制研讨会,Outline,工业发酵的重要性N源在工业发酵中的调控作用基于碳氮磷利用速率动态调控的红霉素基因工程菌发酵过程优化基于N源调控的其他发酵产品案例用于考察N源的专用设备及多尺度参数分析结论与展望,一、工业发酵在国民经济中的重要地位,工业生物技术在国民经济发展中的作用,发酵工程,医药、轻工食品、农业、环保、能源、,社会可持续发展生物技术发展,需求,医药、食品领域的重要工作内容和关键技术,新型食品添加剂、防腐剂、功能食品,食品,微生物药物,新药、抗体疫苗、酶,生物能源,纤维素乙醇、生物柴油,环境保护,生物治理、生物预报,农业,农产品深加工、生物农药与肥料,数千年历史技术持续发展,工业生物技术基础 社会经济发展必须,动物细胞大规模培养,抗生素、维生素、基因产品,生物基化学品,可降解塑料、生物乙烯、1、3丙二醇,以多参数检测相关性分析为基础的生物过程控制优化理念,二 、N源在工业发酵中的调控作用,氮是活细胞生存所必须的营养大分子， 氮的吸收是微生物代谢的关键步骤。为了满足生物对氮的需求，即使在氮限制的情况下，仍能确保充足的氮供应，因为微生物已经进化了针对不同氮源复杂的摄取和吸收机理。,培养基成分,培养基成分,水,培养基成分氮源,N源主要用于构建菌体细胞物质（氨基酸、蛋白质和核酸等）和含氮代谢物，主要可分为有机氮源和无机氮源常用的有机氮源有花生饼粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、酵母膏、鱼粉、尿素等 在蛋白酶作用下，水解为氨基酸被吸收分解代谢 含有丰富的蛋白质、多肽和游离氨基酸外，还含有少量糖类、脂肪、无机盐、维生素及某些生长因素，因此微生物在此环境下能够生长旺盛，菌浓增长迅速,源在工业发酵调控中的作用,促进生长，调节初级代谢及次级代谢的通量控制合适水平，启动次级代谢产物形成控制生长速率，影响菌型形成，从而影响发酵液流变特性影响供氧水平，增加功率消耗,氮源在发酵过程中的作用,菌体生长,产物代谢产物、生物转化、酶、生物量,氮源,碳源：CO2,无机氮源：硫酸铵、硝酸铵、氨水、,有机碳源：玉米浆、黄豆饼粉、尿素、酵母粉、,促进生长，调节初级代谢及次级代谢的通量,N源的选择与筛选,不同菌种对不同N源的利用度、利用速率不同黄豆饼粉：红霉素 酵母粉： 阿维菌素、肌苷/鸟苷、基因工程菌鱼粉：螺旋霉素 玉米浆：青霉素无机氮源与有机氮源的组合不同有机氮源的组合、搭配碳、氮源的搭配,在线监控考察N源的质量、可利用度和替代效果,背景,N源调控分子机制的理解，有助于发酵过程工艺的改进,Maltose,优先利用,受抑制,S.erythraea,Carbon Catabolite Repression(CCR):菌体优先利用PTS转运的碳源，ABC系统转运的碳源利用受抑制,发酵过程中增加ABC转运系统碳源能有效降低发酵成本。,培养基糖成本不断上升,背景,N源调控分子机制的理解，有助于发酵过程工艺的改进,研究发现，N源全局调控子GlnR能够激活ABC型转运基因，促进麦芽糖、甘露糖等CCR碳源的利用,降低发酵成本,Proc Natl Acad Sci, 2015,10.1073; Biochem Biophys Res Commun.2016.02.044,背景,N源调控分子机制的理解，有助于发酵过程工艺的改进,N源全局调控子GlnR和P源代谢双组分系统PhoP存在相互调控关系，并使N调控和P调控存在交叉。,培养基豆饼粉过多，使发酵后期N、P源释放增多，PhoP会促进GlnR表达，抑制红霉素合成,eryAI,解释发酵现象,培养基优化,Appl Environ Microbiol, 82(1), 409-420于晓光，储炬. 磷氮调控对红霉素重组工程菌ZL1004发酵过程的影响,三、基于碳氮磷利用速率动态调控的红霉素基因工程菌发酵过程优化,问题：玉米浆质量不稳定引起红霉素产量波动大,1 红霉素基因工程菌发酵培养基氮源优化与中试放大,解决方案：采用质量稳定的酵母浸粉和酵母粉作为速效有机 氮源,黄豆饼粉33g/L、面包酵母浸粉6.0g/L， 发酵水平比对照提高了6.3%。,黄豆饼粉33g/L、啤酒酵母浸粉6.0g/L， 发酵水平比对照提高了20.6%。,黄豆饼粉33g/L、酵母粉10g/L， 发酵水平略高于对照。,面包酵母浸粉啤酒酵母浸粉,对照培养基1培养基2培养基3培养基4培养基5,酵母粉培养基1酵母粉培养基2酵母粉培养基3,不同速效氮源下的淀粉酶和蛋白酶活比较,1 红霉素基因工程菌发酵培养基氮源优化与中试放大,采用新型速效有机氮源后，胞外淀粉酶和蛋白酶活力大大提高，表明新型氮源下，菌体利用淀粉和黄豆饼粉的能力增强。,玉米浆面包酵母浸粉啤酒酵母浸粉,玉米浆面包酵母浸粉啤酒酵母浸粉,酵母粉培养基1酵母粉培养基2酵母粉培养基3,酵母粉培养基1酵母粉培养基2酵母粉培养基3,红霉素效价提高15.9%,15L罐二级种子比较,50L罐发酵水平比较,玉米浆种子酵母粉种子,1 红霉素基因工程菌发酵培养基氮源优化与中试放大,25m3罐发酵水平比较,酵母粉种子培养基优化及25吨罐放大,采用酵母粉后的发酵水平比对照组提高了21.7%，红霉素A提高了13.0%。,50L罐发酵水平比较,1 红霉素基因工程菌发酵培养基氮源优化与中试放大,酵母粉替代玉米浆对工业生产菌发酵的影响,采用酵母粉后的发酵水平和A组分比对照组提高了分别提高了15.3%和14.4%。,工业生产菌,采用新型速效有机氮源替代工业培养基中的玉米浆成分，并对种子培养基和发酵培养基进行优化，成功实现了25吨罐规模下红霉素产量的大幅提升（21.7%）。采用新型氮源速效有机氮源，实现了工业生产菌红霉素效价的大幅提升（15.4%）。新型速效氮源解决了玉米浆质量不稳定引起红霉素产量波动大的问题,1 小结,问题：发酵液粘度过高,解决方案：调节培养基成份,Kanda M, Yamamoto E, Hayashi A, et al. Scale-up fermentation of echinocandin type antibiotic FR901379. Bioscience and Bioengineering. 2010,109(2): 138-144,采用无机铵盐结合添加营养因子而非传统有机氮源已经成功地使棘白霉素类抗生素发酵液粘度降低了50%。,发酵液中残留的黄豆饼粉是影响菌体分离提取过程的重要因素,Davies JL, Baganz F, Ison AP, et al. Studies on the interaction of fermentation and microfiltration operations: erythromycin recovery from Saccharopolyspora erythraea fermentation broths. Willey and Sons Inc. 2000,64(4): 429-439,指导思想：分析有机氮源、无机氮源对粘度的贡献， 尽量降低黄豆饼粉的浓度,2.无机氮磷调控降低发酵液粘度和葡萄糖消耗,发酵液平均粘度降低18.6%。发酵过程补糖总量降低61.6%。红霉素A产量为7926U/ml，相当于对照（8069U/ml）。,A.氮源与粘度关系考察及多尺度相关性分析,硫酸铵敏感参数,培养基设计表,铵离子抑制蛋白酶活性，使菌体利用无机铵而非黄豆饼粉。铵离子的利用导致补糖速率降低。黄豆饼粉中有机磷的释放限制了菌体OUR水平。磷限制了铵离子的利用，避免了高浓度铵离子的阻遏作用。,初始培养基高酵母粉培养基高硫酸铵培养基,初始培养基高酵母粉培养基高硫酸铵培养基,初始培养基高酵母粉培养基高硫酸铵培养基,初始培养基高酵母粉培养基高硫酸铵培养基,A.氮源与粘度关系考察及多参数相关性分析,高硫酸铵培养基,Strategy 1,Strategy 2,Strategy 3,添加0.2g/L磷酸二氢钾,降低豆粉浓度30g/L20g/L,降低硫酸铵8g/L6g/L,降低粘度、降低糖耗,B.氮磷调节实现低粘度低糖耗的红霉素发酵新工艺及代谢机理考察,论文发表：Chen Y. et al. Bioresource Technology (2013),红霉素A:策略1提高5.9%，策略2提高10.6%,策略3提高9.6%。策略1、2、3下的葡萄糖消耗速率大幅降低。策略1的粘度略有增加，策略2粘度降低至2084cp，策略3下的粘度为1598cp。,培养基调整后的红霉素A、葡萄糖消耗、粘度比较,B.氮磷调节实现低粘度低糖耗的红霉素发酵新工艺及代谢机理考察,添加磷酸盐后，氨基氮消耗速率增加，减豆粉后氨基氮消耗速率更低，表明磷酸盐和减豆粉增加了铵离子的消耗。氨基氮与葡萄糖消耗速率间的关系表明，铵离子降至低水平时，由铵离子引起的pH降低的效果减弱，同时较多的黄豆饼粉被利用使pH升高。葡萄糖不是发酵液粘度高的直接原因。,高硫酸铵培养基策略1策略2策略3,B.氮磷调节实现低粘度低糖耗的红霉素发酵新工艺及代谢机理考察,添加无机磷后增加了发酵后期黄豆饼粉的水解速率，特别是铵离子降低到较低水平阶段。氨基酸脱氨基后生成红霉素合成前体，因而氨基酸浓度影响红霉素的合成。发酵后期充足的红霉素前体氨基酸库是红霉素产量提高的重要因素,发酵液中氨基酸浓度表,氨基酸代谢与红霉素合成,B.氮磷调节实现低粘度低糖耗的红霉素发酵新工艺及代谢机理考察,丙酸浓度的增加可理解为较低补糖速率下正丙醇利用速率增加，正丙醇通过甲基丙二酰-CoA和琥珀酰-CoA生成了琥珀酸或通过甲基柠檬酸途径生成琥珀酸。可以适当控制葡萄糖补加速率来降低乙酸的生成。,发酵液中有机酸浓度比较,丙酸、琥珀酸和乙酸的关系,B.氮磷调节实现低粘度低糖耗的红霉素发酵新工艺及代谢机理考察,综合调节无机铵盐、无机磷、有机氮源的浓度，成功实现了降低发酵液粘度和葡萄糖消耗速率，同时提升了红霉素A的水平。,葡萄糖不是红霉素合成的直接限制因素。葡萄糖补加速率低的原因：铵离子抑制了黄豆饼粉的利用和铵离子消耗伴随氢离子的生成。磷限制条件下，黄豆饼粉中有机磷的逐渐释放使铵离子利用速率较低，避免硫酸铵阻遏作用。,发酵后期充足的前体氨基酸库有利于维持较高的红霉素合成速率。,2 小节,问题：黄豆饼粉中有机磷的释放使发酵后期溶磷较高，引起 粘度高,解决方案：寻找低磷含量有机氮源，替换高磷含量有机氮源， 控制发酵中后期的溶磷水平。 在发酵初期补加无机磷，增加发酵前期的菌体生长,关于磷酸盐对红霉素发酵的影响的报道多为化学合成培养基，且表明较高的无机磷阻遏红霉素的合成。,L.M.Reeve, S.Baumberg. Physiological controls of erythromycin production by Saccharopolyspora erythraea are exerted at least in part at the level of transcriptionJ. Biotechnology Letters, 1998, 20(6):585-589.,由于工业复合培养基中，复合有机氮源中含有一定量的磷，所以很少有人研究有机氮源磷含量对发酵过程的影响。,指导思想：保证总氮大体不变的条件下，降低发酵后期溶 磷的释放 通过流加无机磷，增加发酵初期磷的利用速率,3.不同磷含量氮源组合及无机磷补加调控发酵过程磷水平,玉米蛋白粉的磷含量为黄豆饼粉的53%酵母粉中的磷含量高达0.87%。有机氮源较高的磷含量使发酵后期的溶磷水平较高。,不同氮源的磷含量测定结果,A 不同氮源的磷含量测定结果,粘度降低、溶磷降低、效价相当。,采用玉米蛋白粉替代黄豆饼粉,B 降低有机氮源磷含量控制发酵后期溶磷水平,培养基调整后的发酵过程参数比较,对照培养基1培养基2,对照培养基1培养基2,对照培养基1培养基2,对照培养基1培养基2,采用玉米蛋白粉替代酵母粉,培养基2红霉素效价11513 U/ml红霉素、A组分为8697U/ml。,培养基调整后的发酵过程参数比较,降低有机氮源磷含量控制发酵后期溶磷水平,对照培养基红霉素效价10974U/ml，A组分8312U/ml。,培养基1下的红霉素效价为9691 U/ml、A组分为7676 U/ml。,无机磷替代速效氮源酵母粉,6g/L酵母粉时，流加磷酸盐红霉素效价高达13273 U/ml，比初始对照提高了20.9%,B. 降低速效氮源酵母粉结合无机磷流加,培养基调整后的发酵过程参数比较,采用玉米蛋白粉和黄豆饼粉组合后，粘度峰降低、溶氧增加，转速由630r/min降至498r/min。红霉素效价A组分提高9.4%，杂质组分降低。降低原因为传质的改善。,C. 低磷含量有机氮源在生产菌发酵的应用,发酵液中红霉素组份浓度比较,采用高、低磷含量氮源组合及流加无机磷的策略，提升了红霉素的产量，降低了发酵液的粘度。,采用高、低磷含量氮源组合降低了生产菌发酵液的粘度，同时维持与对照相当的红霉素效价。,红霉素产量高达13273 U/ml，比未补加磷酸盐时的效价提高了20.9%。并在500L规模罐成功放大。,揭示了无机磷和有机氮源中的磷在红霉素发酵过程的重要作用。,3. 小节,总结,采用多尺度多参数相关性分析获得的碳氮磷利用规律为进一步红霉素工艺改进提供指导作用，同时为其它相关抗生素发酵提供参考。这些实验结果为进一步在分子、酶学等水平深入研究代谢机理提供了新的切入点。,辅酶Q10氮源限制与合成代谢之间关系上的应用,基于N源调控的其他发酵产品案例,氮源-代谢,不同稀释倍数氮源浓度对发酵影响,辅酶Q10氮源限制与合成代谢之间关系上的应用,调整氮源补加量,辅酶Q10氮源限制与合成代谢之间关系上的应用,不同氮源的合理搭配利用速效氮源：氨基态氮和玉米浆，促进菌体生长，但对部分产物，特别是次级产物合成有抑制作用。缓慢氮源：延长产物合成期。,工业糖化酶发酵补料培养基优化,棉籽蛋白和糖蜜对酶活差值的交互作用的响应面图和等高线图,工业糖化酶发酵补料培养基优化,糖蜜和硫酸铜对酶活差值的交互作用的响应面图和等高线图,工业糖化酶发酵补料培养基优化,棉籽蛋白和硫酸铜对酶活差值的交互作用的响应面图和等高线图,工业糖化酶发酵补料培养基优化,优化后的补料培养基配方：新型有机氮源4.19g/L，糖蜜9.01g/L，硫酸铜0.015g/L。最终，优化补料罐的酶活达到18327.5 AGI/mL，比对照罐（16460 AGI/mL）增加了11.35 %。,氮源利用与产品质量控制,1. 大肠杆菌表达海藻糖合成酶,表1. 培养基组成,对照组为OXOID 氮源，实验组为安琪酵母浸粉（FM405、FM802、FM803、FM808、FM888、FM906，共六种）和蛋白胨（FP103、FP318、FP803，共3种），进行完全替代,不同氮源情况下的菌浓,不同氮源情况下的酶转化率,2. 莫西菌素发酵,表1. 氮源等量替换,不同氮源情况下的总效价和PMV,表2. 氮源含量（LM902）优化实验,不同LM902含量下的的总效价和PMV,表3. 安琪酵母膏与国药酵母膏成本分析（单罐）,3. 头孢菌素C发酵,不同氮源对头C发酵的影响,4. 土霉素发酵,不同氮源对土霉素发酵的影响,土霉素发酵前期补2-3次酵母粉，放罐单位比对照高1500u/ml。青霉素发酵47小时开始加尿素，每6小时补加一次，结合补加乳糖，发酵单位可达40000u/ml以上。赤霉素生产补加的氮源是花生粉，配16的花生粉液体，当菌生长到粘度大于15秒时，说明氮源被消耗很多，就开始补加花生粉。对于含氮产物的生产特别需要补氮。,四、用于考察N源的专用设备及应用,用于考察N源的专用设备及应用,Scale up,Scale down,微型化,高通量,标准化,多尺度菌种表型研究,在线显微仪研制,申请PCT专利（美国PCT/CN2008/071348 ）,HEK293细胞,微载体细胞,用于考察N源的专用设备及应用,在线显微镜在放线菌和酵母培养过程中形态变化的采集,活细胞传感器与在线参数采集整合,活细胞传感仪测定分析,总体目标,利用高通量技术培养，建立红曲霉的微型化培养及批量检测方法,高通量培养和筛选技术,改良菌种,改善发酵条件,液态发酵,用于考察N源的专用设备及应用,高通量培养技术,装液量：500 2000 ul,24孔,48孔,96孔,固体培养和菌种保藏,用于考察N源的专用设备及应用,可灭菌、重复使用寿命长、成本低、易清洗、能统一标准、防交叉污染、透气性好、防止水分蒸发,孔板盖,用于考察N源的专用设备及应用,微孔板固定架,板数：882128,孔数：128243072 128486144 1289612288,用于考察N源的专用设备及应用,84h,50 L,Shake flaskfor 48h,Experimental design,Oxygen supply,Shear force,Preliminary exploration in shake flask,用于平行研究用的八联罐系统,Shear force,400rpm,500rpm,600rpm,700rpm,26,27,29,30,Primary cultivation in 50L bioreactor for 80h,Transfer,Continued cultivation in 8 joint fermenters fo