临床常见病原体检查

第九章 临床病原体检测,提 纲,第一节：标本的采集运送、实验室评价和检查方法第二节：病原体耐药性检测第三节：临床感染常见病原体检测第四节：病毒性肝炎检测第五节：性传播疾病病原体检测第六节：医院感染常见病原体检测,教学目的与要求：,了解掌握临床病原体检查的主要内容（标本采集、标本验收、药敏检查、耐药性检测、临床常见病原体、病毒性肝炎、性传播疾病、医院感染）、检测原理以及临床实际应用的重要意义。,重点与难点,标本采集的原则及各种检查方法的适用范围及其优缺点药物敏感的常用试验方法及其特点耐药菌检测试验各种类型临床常见病原体的检查甲、乙、丙型肝炎的检测方法各种性传播疾病病原体的检测方法、筛选试验、确诊试验及金标准院内感染定义,提 纲,第一节：标本的采集运送、实验室评价和检查方法第二节：病原体耐药性检测第三节：临床感染常见病原体检测第四节：病毒性肝炎检测第五节：性传播疾病病原体检测第六节：医院感染常见病原体检测,临床细菌学检验的特殊性,依赖于细菌生长采集时间 （发烧？）运送方式 （密闭与否，保温与否？）感染的细菌种类及生长特征 （苛养菌）病人是否使用抗生素 （抗生素的影响）其他：消毒剂，白细胞吞噬等容易受环境中的细菌污染采集方法 （无菌操作，避免污染）放置时间 （及时运送，避免细菌死亡）,基本原则1：正确的标本类型和采集部位以反映有效病程2：采集和运送应无菌操作，避免污染3：尽快送检4：视所有标本为传染品，高度污染标本要有明显标识5：注意生物安全，标本用后要做消毒处理,一、标本采集和运送,（一）血液标本的采集,适应症：疑似菌血症、败血症或脓毒血症的病人酒精棉球消毒，防止污染。静脉采血后，将血液注入培养瓶内 。采集时间：一般在抗生素使用前，于发热初期或高峰期采血。采集频率：24小时内采血23次可提高阳性率，且在不同部位。采血量：血液与培养基的比例为1：5-10，一般成人血量510ml，婴儿1-5ml。,（二）尿液标本的采集,首次晨尿，无菌采集中段尿10-20ml。排尿困难者考虑导尿采集标本。如考虑厌氧菌感染，采取膀胱穿刺法采集标本。,（三）粪便标本采集,自然排便者：挑取脓、血或粘液部分于清洁容器中送检。排便困难者：采用直肠拭子采集。怀疑霍乱弧菌感染引起的腹泻，立即接种或将标本置于碱性蛋白胨水或卡-布运送培养液送检。传染性腹泻应连续送检3次。,（四）呼吸道标本采集,类型：鼻咽拭、痰和经气管采集的标本。采集时间：晨痰，且在取痰前用清水反复漱口。方法：（1）自然咳痰法：（2）气管镜下采集法；（3）气管穿刺法。WBC 25/lp,上皮10/lp。上呼吸道存在正常菌群，在采集标本与结果分析时应予考虑。,（五）脑脊液与其它无菌体液采集,临床医生采用腰椎穿刺，抽取2-3ml，置于无菌容器中立即送检，不得保存于冰箱中。脑膜炎的主要病原体：脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌。,（六）眼、耳标本采集,（七）泌尿生殖道标本采集,性传播性疾病取尿道口分泌物、外阴糜烂面病灶边缘分泌物、阴道宫颈口分泌物和前列腺液等。 生殖道疱疹常穿刺抽取疱疹液。盆腔脓肿患者则于直肠子宫凹陷处穿刺取脓液。所有标本收集后于4保存直至培养,（八）创伤、组织和脓肿标本,损伤范畴较大的创伤，从不同部位采集多份标本 . 清除污物，以碘酒、酒精消毒皮肤.开放性脓肿：无菌棉拭子采集脓液及病灶深部分泌物。封闭性脓肿：无菌干燥注射器抽取。疑为厌氧菌感染，取脓液后立即排净注射器内空气，针头插入无菌橡皮塞送检。,标本送检,标本要求尽快送检，否则影响阳性率。烈性传染病标本需专人护送。,二、标本的实验室质量评估标准,1标本必须注明姓名、年龄、性别、采集日期、临床诊断、检验项目等基本信自。 2仔细核对标本采集日期和送检日期。延误的标本，一般情况下不接收。通常用于细菌学检验的标本的存放不要超过24h。而病毒检测的标本可于4存放23天。 3检查送检容器是否完整，有无破损或渗漏等情况，若有则不予接收。 4标本储存、运送方式不当，不予接收。 5明显被污染的标本不予接收。6标本量明显不足的标本，不予接收。 7同一天申请做同一实验的重复送检标本(血培养除外)，不予接收。 8对于烈性传染病标本的采集和运送应严格执行相关规定，要有完善的防护措施，按规定包裹及冷藏，附有详细的采样及送检纪录，由专人护送。,标本是否合格，以保证检测结果的准确性！,三、检查方法,（一）直接显微镜检查（二）病原体特异性抗原检查（三）病原体核酸检查（四）病原体的分离培养和鉴定（五）血清学试验,（一）直接显微镜检查不染色标本,不染色标本：适用于检查生活状态下病原体的动力及运动状况。方法：压滴法、悬滴法。意义：在不染色状态下借助暗视野显微镜或相差显微镜观察病原菌的动力、活动方式。部分病原体可借此初步诊断，如梅毒螺旋体。,（一）直接显微镜检查染色标本,染色标本目的：了解细菌的形态、染色性或观察宿主细胞内包涵体。方法：革兰染色、墨汁染色、抗酸染色、荧光染色,革兰染色,细菌的形态、染色性的特征,革兰染色,墨汁染色,荚膜抗吞噬30%-50%的患者伴有免疫功能低下等疾病， 8%左右的AIDS患者伴有隐球菌性脑膜炎，预后极差。中枢神经系统存活与脑脊液中缺乏抗体和补体激活系统有关抗真菌治疗:两性霉素B,氟康唑,抗酸染色,荧光显微镜用于标本经荧光染色后直接检出某些病原微生物，用形态学和免疫学相结合的可特异地家侧某些病原微生物的存在。,荧光显微镜用于标本经荧光染色后直接检出某些病原微生物,荧光染色,SARS（severe acute respiratory syndrome ）病原体的确定。,直接显微镜检查电镜检查,电镜检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值,电子显微镜发现为某种冠状病毒,电镜检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值,意义无菌体液的直接镜检对病原体诊断具有一定意义。对正常菌群寄居腔道的分泌物图片镜检可提示进一步检查的步骤、采取的方法和确定分离鉴定病原体所需的培养基。,意义,3.由于临床标本中常含有一定的抗菌物质，以致分离培养可为阴性，此时的镜检往往可能在诊断是起作用。4.荧光显微镜用于标本经荧光染色后直接检出某些病原微生物5.电镜检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值。,(二)病原体特异性抗原检查,利用抗原抗体之间的特异性反应，用已知抗体检测患者血清及其他体液中的待测抗原，借助免疫荧光技术、酶联免疫技术、化学发光技术、胶乳凝集试验、对流免疫电泳等技术检测标本中未知的病原体抗原，其诊断价值常以标本不同而各异。 标本中如果存在多种正常寄居微生物，可因交叉抗原存在而不能肯定诊断。检测细菌不同的抗原构造，还可分析细菌的菌群和血清型，如沙门菌属、志贺菌属和霍乱菌属等,细菌的血清分型：O1群霍乱弧菌的菌体抗原由A、B、C三个抗原成份组成,利用抗原抗体之间的特异性反应，用已知抗体检测患者血清及其他体液中的待测抗原,检测细菌不同的抗原构造，还可分析细菌的菌群和血清型，如沙门菌属、志贺菌属和霍乱菌属,（三）病原体核酸的检测,常用试验方法有：PCR。polymerase chain reaction聚合酶链式反应，简称PCR技术。核酸探针杂交技术Realtime PCR基因芯片等,PCR技术简史,DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明,基因组DNA,获取特定DNA片段,扩增特定DNA片段,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,PCR扩增产物电泳,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,PCR技术的特点,1 ）高度的灵敏性,30轮循环,扩增量达230个拷贝（109拷贝）,PCR产物每轮循环增加一倍,皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌,2 ）特异性,引物,引物,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,PCR的类型和应用,研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他,（三）病原体核酸的检测PCR,PCR：一种体外基因扩增技术，对目的基因组DNA的信号进行放大。,（三）病原体核酸的检测Realtime PCR,实时荧光定量PCR：通过起始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现核酸定量的一种技术。广泛应用于结核和麻风分枝杆菌、乙型肝炎病毒、丙型和戊型肝炎病毒、HIV、巨细胞病毒的检查,（三）病原体核酸的检测Realtime PCR,将大量核酸片段(寡核苷酸、PNA、cDNA、基因组DNA)以预先设计的方式固定在载玻片、尼龙膜和纤维素膜等载体上组成密集分子阵列，与荧光素或其他方式标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的有无和数量。该技术具有高通量、自动化程度高、快速、样品用量少、灵敏度高、特异性强、污染少等特点。病原微生物的16S rDNA及23S rDNA序列近几年被作为一个较理想的基因分类靶序列，其在进化压力下保持了高度的保守性，同时又具有一定的变异性，基因芯片技术通常利用病原微生物的这一分子生物学特性，实现多样本多病原微生物的同时检测。,（三）病原体核酸的检测基因芯片,意义,灵敏度高，是检测病原体微生物最灵敏的方法，但具有一定的假阳性与假阴性。特异性强，阳性只表明存在某种病原体的核酸，是否正被感染应结合临床具体分析。特别适用于目前尚不能分离培养或很难分离培养的微生物。适用于核酸变异的病原微生物，如病毒,（四）病原体的分离培养和鉴定,明确感染病原体提供体外抗微生物药物敏感试验结果,1.细菌感染性疾病病原体的分离培养分离培养是微生物学检验中确诊的关键步骤 根据临床症状、体征和镜下检查特征做出病原学初步诊断，选择最合适的培养方法，主要是选择适当的培养基、接种前的标本处理和确定孵育条件，然后根据菌落性状(大小、色泽、气味、边缘、光滑度、色素、溶血情况等)和细菌的形态、染色性，检测细菌生化反应结果和血清学实验、动物接种实验(白喉杆菌)，对分离菌作出鉴定，也可借助于微量鉴定系统快速简便鉴定分离菌,（四）病原体的分离培养和鉴定,细菌分离培养与鉴定的结果评价：正常人群的无菌体液中检测到细菌，应考虑细菌为感染的病原体。存在正常菌群的标本检测到细菌，应结合细菌的量考虑是否为致病菌。如临床表现支持感染，但培养阴性，应考虑为标本不合格、培养不恰当等因素。直接镜检找到病原体，而培养阴性，应考虑有L细菌、厌氧菌或苛氧菌感染。,2.不能人工培养的病原体感染性疾病将标本接种易感动物、鸡胚或行细胞培养,（四）病原体的分离培养和鉴定,病毒分离培养与鉴定的结果评价：从组织、血液以及脑脊液中分离到病毒可明确诊断。从呼吸道、肠道等分离到病毒，如该病毒人体不能长期携带，有诊断价值，如麻疹病毒、流感病毒等。反之需相应的临床表现，才有病原学意义，如巨细胞病毒，肠道病毒等。阴性不能排除病毒感染。必须结合流行病学资料、临床表现、标本来源及病毒种类加以分析。,（五）血清学试验,用已知病原体的抗原检测患者血清中相应抗体以诊断感染性疾病。,人体感染病原体后经过一定时间产生特异性抗体，在体内可维持数月或更长时间。,双份血清检查：病程早期和晚期分别采血清2-3份检查，双份血清的滴度呈4倍或4倍以上升高，考虑病原体感染单份血清检查：特异性 IgM可作为感染性疾病的早期诊断指标，且可区分原发与复发感染。方法有：凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、间接免疫荧光、放射免疫、酶联免疫吸附试验。,适用范围,血清学诊断可用于现症诊断，还可以用于疾病追溯调查。血清学诊断对于某些病原体不能培养或难以培养的疾病，可以提供诊断的依据，,血清学诊断肥达反应,抗原结构,O抗原：化学成分为脂多糖；耐热；是沙门菌分群依据；相应抗体为IgM抗体；与相应抗体结合出现颗粒状凝集；。,H抗原：化学成分为蛋白质；不耐热；有双相鞭毛；沙门菌分型依据；与相应抗体结合出现絮状凝集；相应抗体为IgG抗体。,Vi抗原：不耐热；能阻止O抗原与相应抗体结合,血清学诊断肥达反应,原理：用已知伤寒沙门菌O、H抗原和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌H抗原与病人血清作半定量凝集试验，以测定受检血清中有无相应抗体及其效价。意义：协助诊断肠热症（伤寒与副伤寒）,几种沙门菌抗原构造,肠热症病人血清抗体出现情况,肥达反应正常值,O凝集效价1：80H凝集效价1：160副伤寒H凝集效价1：80,大于正常值具有诊断意义,O与H抗体的诊断意义：,O、H效价均升高：已感染伤寒O、H效价均低于正常值：未感染沙门菌或免疫力低下,生理盐水, 待检血清,诊断抗原,1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640,伤寒O效价 1:320伤寒H效价 1:640甲型副伤寒H效价 1:20肖沙门菌H效价 1:20,诊断意义：感染伤寒沙门菌,伤寒带菌者的检测,从标本中分离出病原菌血清中检出Vi抗体，效价1：10,第二节：病原体耐药性检测,1922年他发现了一种叫“溶菌酶”的物质，发表了皮肤组织和分泌物中所发现的奇特细菌的报告。 但他自己无法发明一种提纯青霉素的技术，致使此药十几年一直未得以使用 。1939年，瓦尔特弗洛和鲍利斯钱恩，重复了弗莱明的工作，证实了他的结果，然后提纯了青霉素 1945年，弗莱明、弗洛里和钱恩共获诺贝尔生理学及医学奖。,第二节：病原体耐药性检测,抗菌药物是目前临床使用最为广泛的药物，它的发现、研制和临床应用是现代医学史上的重要里程碑，使绝大多数微生物感染，尤其是细菌感染成为可治性疾病,抗生素压力,体外抗菌药物敏感试验的目的,临床分离菌株，如不能对抗生素敏感性进行预测，必须常规进行药敏试验。临床治疗效果差而考虑调整抗菌药物时。了解细菌耐药的流行病学情况。评价新抗菌药物的抗菌谱和抗菌活性等。,抗微生物药物敏感试验(antimicrobial susceptibility test, AST)对敏感性不能预测的临床分离株进行药敏试验，以指导临床选择治疗药物。,体外抗菌药物敏感试验的方法,常用的检查细菌是否对药物耐药的方法有定性测定的纸片扩散法、定量测定的稀释法和E试验法。对某些特定耐药菌株的检测除药物敏感试验外还要附加特殊的酶检测试验、基因检测等方法。常用方法有:纸片扩散法（Kirby-Bauer test）稀释法（dilution test）E试验法（E test） 耐药筛选试验折点敏感试验,原理：含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。,KB纸片琼脂扩散法,试验程序,按敏感(susceptible，S)、中度敏感(intermediate，I)、耐药(resistant，R)报告。S：测试菌能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭。I：测试菌能被测定药物大剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制，或在测定药物浓集部位的体液(如尿)中被抑制。R：测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制。,细菌药敏试验-液体稀释法,Minimal inhibitory concentration (MIC)，最低抑菌浓度：能够抑制检测菌肉眼可见生长的最低药物浓度称为最低抑菌浓度。,抗菌药物对倍稀释,先以水解酪蛋白液体培养基将抗生素作不同浓度稀释，再种入待检菌，,培养,置35温箱，培养24h。,结果判读,结果判读：肉眼观察，以不出现肉眼可见生长（混浊现象）的最低药物浓度为该药对测试菌的MIC。,细菌药敏试验- E-test法,1.结合稀释法和扩散法原理和特点而设计的一种操作简便(如同扩散法)、精确测定MIC(如同稀释法)的一种方法。2.在涂布有待测试菌的平板上放置1条内含干化、稳定、浓度由高到低呈指数梯度分布的商品化抗菌药物塑料试条。35孵育1618h。3.抑菌圈和试条横向相交处的读数刻度即是待测菌的MIC，参照CLSI标准判断,细菌药敏试验- E-test法,青霉素的MIC 解释标准S 2R8,结论：MIC:1.0该肺炎链球菌对青霉素敏感,缺点,Etest试条价格昂贵，目前尚未广泛使用,药敏试验结果的解释（1）,敏感（susceptible）：表示测试菌能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭。耐药（resistant）：表示测试菌不能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭，治疗无效。,药敏试验结果的解释（2）,中介 (intermediate) : 测试菌能被测定药物大剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制，或在测定药物浓集部位的体液(如尿)中被抑制该范围作为敏感与耐药之间的缓冲区，避免由于微小技术误差影响实验结果。,（二）特殊的耐药菌监测的特殊试验,由于细菌存在一种或几种耐药机制，造成了细菌的多重耐药性。单一的药敏试验已不能完全表示细菌的耐药性，必须进行一些特殊的耐药性监测试验。1.耐甲氧西林葡萄球菌的筛选测定2.氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌的筛选测定3.耐青霉素肺炎链球菌的筛选测定4.-内酰胺酶的检测5.超广谱-内酰胺酶的检测,1.耐甲氧西林葡萄球菌的筛选测定（methecillin resistance staphylococcus，MRS）,包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌是目前导致医院感染的重要病原菌。此类葡萄球菌具有多重耐药性，即对全部一内酰胺类抗菌药物，包括青霉素族和头孢菌素族以及临床常用的其他多种抗菌药物均耐药。因此，此类葡萄球菌的早期检出和确定具有重要临床意义,1.耐甲氧西林葡萄球菌的筛选测定（methecillin resistance staphylococcus，MRS）,1g苯唑西林纸片的抑菌圈直径10mm，或MIC4g/ml的金黄色葡萄球菌, 1g苯唑西林纸片的抑菌圈直径17mm，或MIC0.5g/ml的凝固酶阴性葡萄球菌称耐甲氧西林葡萄球菌。,临床意义,对所有-内酰胺类药物均无效，并对氨基糖甙类、大环内脂类、克林霉素和四环素等抗生素多重耐药。治疗首选药物为万古霉素。,2.氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌的筛选测定,对多种抗菌药物包括氨基糖苷类呈固有耐药是肠球菌的特点，故单用氨基糖苷类治疗肠球菌感染无效。但如与一种作用于细胞壁的抗菌药物如青霉素类合用，则可发生协同作用而增强杀菌效力。如果肠球菌对氨基糖苷类产生了高耐药性，这种联合应用就会无效。所以及时筛选出肠球菌中氨基糖苷类高耐药株，有助于临床调整和重新确定治疗方案。,2.氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌的筛选测定,定义: 对30g万古霉素纸片抑菌圈直径19mm， 或MIC32g/ml应视为耐万古霉素肠球菌（vancomycin resistant enteroccoccus，VRE）。,临床意义,耐万古霉素肠球菌目前尚无有效的治疗方法，但是对青霉素敏感的VRE可用青霉素和庆大霉素联合治疗，若对青霉素耐药而不是高水平耐氨基糖苷类可用壁霉素和庆大霉素。另外氯霉素、红霉素、四环素（或多西环素、或米诺环素）及利福平可用于VRE株。,3.耐青霉素肺炎链球菌的筛选测定,定义：1g苯唑西林纸片的抑菌圈直径2g/ml应视为耐青霉素肺炎链球菌。,临床意义,耐青霉素的肺炎链球菌对氨苄西林、 氨苄西林/舒巴坦、 头孢克肟、 头孢唑啉的临床治疗疗效很差，治疗时参考药敏结果选择药物，经验治疗重症感染时，可用头孢曲松或头孢噻肟联合万古霉素用药。,4.-内酰胺酶的检测青霉素族和头孢菌素族抗生素的基本结构一内酰胺环,一内酰胺酶能裂解青霉素族和头孢菌素族抗生素的基本结构一内酰胺环，从而使其丧失抗菌活性。,快速检测-内酰胺酶,-内酰胺酶检测的意义,-内酰胺酶：可水解-内酰胺类抗生素。临床意义：（1）流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌以及卡拉莫拉汉菌等阳性，表示对青霉素、氨卞西林以及阿莫西林耐药。（2）葡萄球菌属以及肠球菌属等，阳性表示对青霉素、氨基组青霉素、羧基组青霉素以及脲基组青霉素耐药,5.超广谱-内酰胺酶(extend spectum -lactamase, ESBL)的检测,超广谱-内酰胺酶是由质粒介导的基因所编码，可水解青霉素类、头孢菌素和氨曲南，主要见于大肠埃希菌、肺炎克雷伯克、产酸雷伯菌及奇异变形杆菌。筛选方法：双纸片扩散法、三相试验和E试验双纸片协同试验操作简便、结果可靠、成本不高，是临床上较常开展的项目。,双纸片扩散法,药物：头孢他啶30 ug头孢他啶/克拉维酸 30/10 ug以及头孢噻肟30 ug头孢噻肟/克拉维酸30/10 ug结果判读：对两组中任何一个药物，在加克拉维酸后，抑菌圈与不加克拉维酸的相比，增加值 5mm 时，判定为产ESBL（如，头孢他啶的抑菌圈直径16；头孢他啶/克拉维酸的抑菌圈22 ）。,临床意义,产ESBL细菌,不论体外药物敏感试验结果如何, 对青霉素类、1-3代头孢菌素类和氨曲南治疗均无效，药敏也全部修改成耐药。,提 纲,第一节：标本的采集运送、实验室评价和检查方法第二节：病原体耐药性检测第三节：临床感染常见病原体检测第四节：病毒性肝炎检测第五节：性传播疾病病原体检测第六节：医院感染常见病原体检测,临床常见病原体为：细菌、病毒、真菌、寄生虫、支原体、衣原体以及立克次体等。,（一）细菌感染检查项目的选择,细菌感染性疾病一般均需进行细菌学诊断以明确病因。三个方面着手：检测细菌或其抗原-主要包括直接涂片显微镜检查、培养、抗原检测与分析。检测抗体。检测细菌遗传物质-主要包括基因探针技术和PCR技术。 难培养或培养要求高的细菌：综合运用免疫学或分子生物学检测，如结核分枝杆菌感染以及幽门螺杆菌感染等。细菌培养是最重要的确诊方法。,（二）病毒感染检查项目的选择,在易感细胞内以复制方式进行增殖的非细胞型微生物病毒感染的实验室检查包括病毒分离与鉴定、病毒核酸与抗原的直接检出，以及特异性抗体的检测。 病毒分离与鉴定：细胞培养。早期诊断手段：多检测病毒抗原、特异性抗体或核酸。,（三）真菌感染检查项目的选择与应用评价,真菌是以腐生或寄生方式摄取养料的真核细胞型微生物。真菌的微生物学诊断手段主要包括直接检查、培养检查、免疫学试验和动物试验,直接显微镜检查：初步明确真菌感染,分离培养：明确何种真菌感染,大多数真菌营养要求不高，常用沙保氏培养基 （SDA）培养。浅部病原性真菌的最适温度为2228，生长缓慢，大多于14周出现典型菌落。深部病原性真菌培养在37中生长最好，生长较快，经3-4天即长出菌落。,真菌感染检查项目的选择与应用评价,真菌抗原检测：只适合于血清与脑脊液中隐球菌、念珠菌以及荚膜组织胞浆菌等。真菌抗体检测：深部真菌的检测。,（四）寄生虫感染检查项目的选择与应用评价,直接显微镜检查：观察寄生虫生活史的各阶段，是寄生虫感染的主要诊断依据。寄生虫抗体检测：辅助诊断。,支原体感染检查项目的选择与评价,支原体是一群介于细菌与病毒之间，可通过滤菌器、无细胞壁，能在无生命培养基中生长繁殖的最小原核微生物。 与人类疾病有关的是肺炎支原体、唾液支原体、口腔支原体、人型支原体、发酵支原体和微小株支原体。,支原体感染检查项目的选择与评价,直接显微镜检查：无价值。分离培养：阳性可明确诊断。目前临床多检测支原体抗原与核酸，用于早期快速诊断。,螺旋体感染检查项目的选择与评价,暗视野显微镜检查：是诊断早期梅毒唯一快速、可靠的方法，尤其对已出现硬下疳而梅毒血清反应仍呈阴性者意义更大,梅毒血清学试验（1）过筛试验：RPR、VDRL、TRUST（2）确诊试验：FTA-ABS、MHA-TP、TPPA,螺旋体感染检查项目的选择与评价,TPHA试验,螺旋体感染检查项目的选择与评价,脑脊液检查：VDRL试验阳性等有诊断价值。脑脊液PCR检测，可以快速准确的诊断神经性梅毒。TP-PCR：TPPCR检测梅毒螺旋体DNA，特异性很强，敏感性很高，是目前诊断梅毒螺旋体的先进方法。PCR检测梅毒螺旋体的DNA，其敏感性、特异性均优于血清学方法,Howard Taylor Ricketts,立克次体检测,斑疹伤寒群,立克次体目,立克次体属,东方体属,埃立克体属,巴通体属,柯克斯体属,恙虫病群,斑点热群,犬埃立克体群,腺热埃立克体群,嗜吞噬细胞埃立克体群,立克次体目的类别,柯克斯体,培养特性,专性细胞内生长的原核细胞性微生物对多种抗生素敏感引起自然疫源性疾病，且为人畜共患,病原体 所致疾病立克次体属 斑疹伤寒（流行性斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒、 加拿大斑疹伤寒） 斑点热（洛矶山斑点热、纽扣热、昆士兰热、 立克次体痘、北亚蜱传斑疹伤寒）柯克斯体属 Q热东方体属 恙虫病群（恙虫病）埃立克体属 犬埃立克体群（人单核细胞埃立克体病） 腺热埃立克体群（腺热埃立克体） 嗜吞噬细胞埃立克体群（人粒细胞埃立克体病）巴通体属 战壕热、猫抓病、Oroya热、秘鲁疣、杆菌性血管瘤、 心内膜炎,外斐试验为非特异性血清学诊断试验，用于斑疹伤寒、斑点热和恙虫病的确诊特异性血清学试验有免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验和补体结合试验等,衣原体,衣原体是一类严格在细胞内寄生，有独特发育周期，能通过细菌滤器的原核细胞型微生物。衣原体属分为四个种沙眼衣原体肺炎衣原体鹦鹉热衣原体兽类衣原体,衣原体感染检查项目的选择与评价,直接显微镜检查：检查衣原体包涵体可提供早期初步诊断。分离培养：阳性可明确诊断。目前临床多检测衣原体抗原与核酸，用于早期快速诊断。,第一节：标本的采集运送、实验室评价和检查方法第二节：病原体耐药性检测第三节：临床感染常见病原体检测第四节：病毒性肝炎检测第五节：性传播疾病病原体检测第六节：医院感染常见病原体检测,甲型肝炎病毒标志物检测乙型肝炎病毒标志物检测丙型肝炎病毒标志物检测,病毒性肝炎主要有7型，即甲型(HA)、乙型(HB)、丙型(HC)、丁型(HD)、戊型(HE)、庚型(HG)、输血传播病毒肝炎它们分别由肝炎病毒甲型(HAV)、乙型(HBV)、丙型(HCV)、丁型(HDV)和戊型(HEV)、庚型(HGV)、输血传播病毒(TTV)所引起。,一、甲型肝炎病毒标志物检测,甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus、HAV）属微小RNA病毒科，无包膜，核心为单股正链RNA。,0 1 2 3 4 5 6 7 8 26 52,粪中HAV,ALT,Anti-HAV, IgG,Anti-HAV, IgM,Weeks,HAV infection,HAV为甲型病毒性肝炎的病原体，主要通过粪口途径传播。,临床表现为急性黄疸肝炎。,0 1 2 3 4 5 6 7 8 26 52,粪中HAV,ALT,Anti-HAV, IgG,Anti-HAV, IgM,Weeks,HAV infection,Graph showing the course of Hepatitis-A virus infection,标志物名称 检测方法 参考值抗HAV-IgM ELISA 阴性抗HAV-IgG ELISA 阴性抗HAV-IgA ELISA 阴性HAVAg ELISA 阴性HAV-RNA RT- PCR 阴性,检测方法与参考值,临床意义,抗HAV IgM，说明机体正在感染HAV，在HAV感染后1-2周内出现，是早期诊断甲肝的特异指标。抗HAV IgG，出现于恢复期并长期存在，是获得免疫力的标志。阳性表示既往感染或者注射过疫苗。HAVAg是HAV感染直接的证据，于发病前2周可从粪中排出，粪便中HAV或HAV抗原颗粒的检测可作为急性感染的证据。HAV-RNA是HAV感染直接的证据，对诊断，特别对早期诊断具有特异性。检测粪便排泄物、污染的水源和食物，有利于及时监测与预防甲型肝炎。可作基因分型研究。,二、乙型肝炎病毒标志物检测,乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）为嗜肝DNA病毒，属于包膜病毒。在电镜下可见大球形颗粒、小球形颗粒和管型颗粒,大球形颗粒,小球形颗粒,管形颗粒,大球形颗粒，又称 Dane颗粒，为完整的HBV颗粒。,分为包膜与核心两部分，包膜含有HBsAg，核心部分是病毒复制的主体，含有环状双股DNA、DNA聚合酶、HBcAg和HBeAg等。,乙肝抗原：1963年美国肿瘤研究所B.S.BIumberg在澳大利亚首先发现，称为“澳抗”又称肝炎相关抗原。乙肝病毒：1970年英国Dane在电镜下首先观察到乙肝病毒颗粒，是直径42nm的双层外壳的病毒颗粒，称为Dane氏颗粒，后来又有人发现26nm的核心颗粒。e抗原：1972年瑞典人Magnius发现与乙肝有关的第三种抗原。e抗原为一种可溶性抗原。在HBV核心的表层,HBV为乙型病毒性肝炎的病原体，血液为其主要的传播途径。,机体感染HBV后产生相应的免疫反应，形成多种不同的抗原抗体系统表面抗原抗体系统 (HBsAg，抗HBs)核心抗原抗体系统 (HBcAg，抗HBc)e 抗原抗体系统 (HBeAg，抗HBe),检测方法与参考值,临床意义（1）,HBsAg： HBsAg是HBV的外壳，不含DNA，故HBsAg本身不具传染性；但因其常与HBV同时存在，常被用来作为传染性标志之一。阳性常见于急性、慢性乙型肝炎，慢活肝。肝硬化、肝癌患者中有相当百分比的病人阳性，此现象说明肝硬化、肝癌患者有传染乙肝的危险，还说明了乙肝，肝硬化，肝癌发展演变的内在联系。乙肝是病因之一。乙型肝炎帶原者得到肝癌的機會是一般人的150倍。乙肝携带者：乙肝病毒的携带者约有1.2亿，没有临床症状,体检肝功能正常或有轻微损害，有时ALT升高，具有一定的传染性不应作为供血者。可持续数周、数年，将来可能发生慢性活动性肝炎、迁延性肝炎、肝硬化和肝癌，因此值得注意。,抗-HBs,抗-HBs是种保护性抗体，可阻止HBV穿过细胞膜进入新的肝细胞，阳性提示机体对乙肝病毒有一定程度的免疫力 。抗-HBs阳性表示：既往曾感染过HBV，现已恢复；接种乙肝疫苗后；被动性获得抗-HBs抗体。,HBeAg阳性表明: 患有乙型肝炎，是病毒复制活跃，传染性强的指标，且HBeAg持续阳性的乙型肝炎，表明肝细胞受损较重，且易转变为慢性肝炎，肝硬化。 HBeAg (+) ,HBsAg(+)的孕妇所生的新生儿，母婴垂直传播的机会很高，达90%值得重视。,HBeAg：,抗-HBe,抗-HBe阳性意味着大部分HBV被清除，复制减少，传染性降低，但并非无传染性。乙肝急性期即出现抗-HBe阳性，易发展为慢性乙型肝炎。慢性活动性肝炎出现抗-HBe阳性，易发展为肝硬化。e抗体和e抗原一般不同时存在，e抗原消失，e抗体产生。,可分为IgM、IgG和IgA三型，目前常用的方法是检测抗一HBc总抗体，抗-HBc总抗体主要反映的是抗-HBc IgG 。也可分别检测抗一HBc的IgM、IgG或IgA。抗HBc检出率比HBsAg更敏感，可作为HBsAg阴性的HBV感染的敏感指标。 抗-HBc IgG ：对机体无保护作用，其阳性可持续数十年甚至终身。,抗-HBc,乙型肝炎病毒血清标志物的综合评价,(1) (2) (3) (4) (5) 急性或慢性乙型肝炎，高传染性 急性、慢性乙型肝炎或慢性HBsAg携带者 急性乙肝趋向恢复或慢性乙肝，弱传染性 急性HBV感染康复期或有既往感染史，有免疫力 乙肝恢复期，弱传染性 急性HBV感染“窗口期”， 或既往曾感染过乙肝 接种HBV疫苗或HBV感染后康复 急性乙肝康复期，开始产生免疫力 无HBV感染,(二)乙型肝炎病毒表面抗原蛋白前S1和前S1抗体测定,乙型肝炎病毒表面抗原蛋白前S1抗原位于病毒颗粒的表面，是乙肝病毒识别肝细胞表面特异性受体的主要成分，是乙肝病毒复制和活动的标志物。 【参考值】 Elisa法。PreS1为阴性；抗PreS1为阴性。,临床意义,前S1抗原可识别肝细胞表面特异性的病毒受体，是非常重要的传染性指标。同时血清前S1抗原的存在与病毒复制的关系密切。作为病毒复制指标较HBeAg敏感，可以反映HBeAg阴性乙肝患者体内的病毒活动状况，避免由于HBeAg阴性造成的误诊和漏检，对“二对半”检测起重要的补充作用。前s1抗原转阴越早、前s1抗体转阳越早，患者病程越短、预后越好。,HBV DNA：是HBV感染最直接，最灵敏和最特异的检测指标，且血清中HBV DNA的水平可作为治疗方案与疗效观察的指标。,HBV DNA定量检测,循环数. 扩增子数 (靶序列拷贝数)122438416532664201,048,576301,073,741,824(10亿),目的基因扩增,三、丙型肝炎病毒标志物,丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）为黄病毒属、单链正股RNA病毒，由核心和包膜组成。血液为其主要传播途径。病情虽较乙型肝炎轻，但更易转为慢性。,安徽霍山“丙肝事件”,丙型病毒性肝炎是由丙肝病毒（HCV）所引起，是通过输血或血制品、血透析、肾移植、静脉注射毒品、性传播、母婴传播等传染引起的。与乙型肝炎相比，更容易演变为慢性、肝硬化和肝癌,检测方法与参考值,标志物 检测方法 参考值 HCV-RNA RT-PCR 阴性 抗-HCV IgM ELISA 阴性 抗-HCV IgG ELISA 阴性,临床意义,HCV-RNA ： 有助于HCV感染的早期诊断。阳性提示 HCV复制活跃，传染性强。HCVRNA转阴提示HCV复制受抑，预后较好。连续观察HCVRNA，结合抗一HCV的动态变化，可作为丙肝的预后判断和干扰素等药物疗效的评价指标,临床意义,抗-HCV IgM： 是丙型肝炎活动和具有传染性的指标，常见于急性HCV感染。持续阳性可作为转为慢性肝炎的指标，或提示病毒持续存在并有复制抗-HCV IgG： 阳性表明体内已有HCV感染，但不能作为感染的早期指标。,提 纲,第一节：标本的采集运送、实验室评价和检查方法第二节：病原体耐药性检测第三节：临床感染常见病原体检测第四节：病毒性肝炎检测第五节：性传播疾病病原体检测第六节：医院感染常见病原体检测,1.性传播性疾病（sexually transmitted disease,STD）：是指通过各种性接触而传播的侵犯皮肤、性器官及全身多脏器的疾病，简称性病（venereal disease）2.分类：（1）经典（传统）STD：梅毒、淋病、软下疳和性病性淋巴肉芽肿。（2）目前：全球发现的STD有30余种，常见为17种；（3）我国法定为8种： 梅毒、淋病、尖锐湿疣、软下疳、性病性淋巴肉牙肿、非淋病性尿道炎、生殖器疱疹及艾滋病。,（一）流行病学,城市牛皮藓,正规医疗机构是性病患者的正确选择,（二）常见临床类型,性病 病原体艾滋病 人类免疫缺陷病毒梅毒 梅毒螺旋体淋病 淋球菌非淋球菌尿道炎 溶脲支原体、沙眼衣原体等生殖器疱疹 单纯疱疹病毒尖锐湿疣 人乳头瘤病毒软下疳 杜克雷嗜血杆菌,重要的性病及病原体,中国爱滋病村里的病人,爱滋病家庭遗孤,（一）艾滋病病原体测定,直接显微镜检查与分离培养：病毒培养是检测HIV感染最精确的方法，一般采取培养外周血单个核细胞的方法进行HIV的诊断。临床较少采用。ELISA等为过筛实验，此法敏感性高，但容易出现假阳性结果，故阳性者需用其他试剂盒重复1次 。HIV-RNA检测：通常是通过检测HIV RNA水平来反映病毒载量，直接反映病情进展，病毒核酸检测方法可用于HIV的早期诊断。排除假阳性可确诊。Western blot：通常作为检测抗HIV一1和抗HIV一2的确诊实验，该法敏感性和特异性皆好 。,（二）梅毒螺旋体感染检查项目的选择与评价,直接显微镜检查：有初步诊断价值。非特异性抗体的检测：过筛试验。特异性抗体的检测：确诊试验。,（三）淋病病原体的检测方法选择与评价,涂片检查：多形核白细胞内见革兰氏阴性双球菌，男性泌尿生殖道标本可明确诊断，而女性需结合培养结果分析。,分离培养；为诊断淋病的金标准，广泛采用，阳性即可确诊。,PCR：可用于早期快速诊断，但假阳性率高。特异性抗原与抗体检测：方法尚不成熟。,（四）非淋球菌性尿道炎病原体测定,是由淋菌以外的其他病原体，主要是沙眼衣原体、解脲支原体等通过性接触所引起的尿道炎症