感受态细胞制备.doc

感受态细胞制备一、 实验目的1、掌握氯化钙法制备感受态细胞的原理、方法和技术；2、掌握电转化感受态细胞的制备原理及方法；3、学习并掌握感受态细胞效价的检测方法。二、 实验原理在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因。细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时，才会处于感受态,如大肠杆菌。大肠杆菌的感受态细胞制备原理是取对数生长期的细菌处于0，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1 x 108转化子每1g DNA，甚至1 x 109转化子每1g DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70保存，因此被广泛用于外源基因的转化。物理制备法：电转法，除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109 1010转化子/g闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化总数菌落数稀释倍数转化反应原液总体积涂板菌液体积 转化率（转化子数每g质粒DNA）转化子总数质粒DNA加入量(g)理论上转化率最高为每微克地标准质粒转化的菌落数为1*1010三、实验材料实验仪器：恒温振荡仪、恒温培养箱、低温常速离心机、移液枪、锥形瓶、离心管、LB液体培养基、实验试剂：0.1M CaCl2溶液、含10%甘油的0.1M CaCl2溶液、GYT、三蒸水、10%甘油的水溶液、DH5、Top10、DE3、BL21、液氮、冰水。三、 实验步骤（一）化学感受态细胞的制备（1）菌种的活化：取-70的冰箱中感受态细胞DH5、Top10、DE3、BL21在LB的平板上进行划线分离。（2）菌种的前培养：从LB平板上挑取相应的单菌落,接种于10ml LB液体培养基中，37振荡培养过夜至对数生长中后期。（3）菌种的准备：将该四种菌悬液以1:100的比例分别接种于四个不含有抗生100mlLB液体培养基锥形瓶中,37振荡培养大约2.5小时至OD=0.40.5。（4）感受态细胞的制备：把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。把100 mL培养液均匀分成两份到50 mL离心管中，在4、3000转每分钟，离心10min。弃去上清液，加入30 mL 0.1M的CaCl2溶液，轻轻混匀，在冰水中静置30min。弃去上清液，加入30 mL 0.1M的CaCl2溶液，用巴氏管轻轻吹吸让沉淀充分混匀，在冰水中静置30min。从冰水中取出4、3000转每分钟，离心10min，弃去上清液并用移液枪轻轻地把多余的液体吸干净，加入0.5 mL含10%甘油的0.1M CaCl2溶液。用巴氏管轻轻吸起液体打到壁上使沉淀混匀并放置在冰上。把液氮倒到小的塑料盒子里，在离心管架子上摆放好0.5ml离心管，用剪过的移液枪头进行分装，每个离心管中分装40L悬浮液。迅速盖好盖子放入到液氮中，使之迅速冷冻，然后放到标有感受态细胞种类、制作者和时间的袋中，-70保存。（二）电转化的感受态细胞的制备第1、2、3步同化学转化的感受态细胞的制备过程的1、2、3三步相同。（4）制备感受态细：把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。把100 mL培养液均匀分成两份到50 mL离心管中，在4、3000转每分钟，离心10min。弃去上清液，加入30 mL 三蒸水，用巴氏管吸起液体打到离心管壁上使沉淀充分混匀，在4、3000转每分钟下离心10min，倒去上清。重复两次；再加入30 mL含10%甘油水溶液，在4、3000转每分钟下离心10min，重复一次。弃去上清液，加入0.5 mL GYT medium(含有10%Glysiron、0.125%Yeast Extraction、0.25% Trypton)，放置在冰上。（5）准备好成有液氮的塑料盒子和把0.5 mL离心管若干放到离心管架子上，将悬浮的感受态细胞分装在离心管中，每管40l，迅速盖好盖子放入到液氮中，使之迅速冷冻，然后放在标有感受态细胞种类、制作者和时间的袋中， -70保存。（三）效价检测1、化学转化：（1）取化学转化感受态细胞于冰上解冻，同时把标准质粒PUC19稀释十倍置于冰上。（2）在含有40l感受态细胞的0.5ml离心管中加入1L稀释后的标准质粒充分混匀。冰上静置30min。（3）将离心管置于42干式恒温器上90s，然后迅速放回冰上，使细胞冷却23min。（4）向离心管中加入已预热的无菌LB培养液400L，再转移到10ml离心管中，37恒温振荡培养4560min。（5）将离心管内容物混匀，分别吸取4.4L和110L菌液于含有AMP的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开，将平板置于室温下直到液体被吸收，倒置平板，在37过夜培养，然后通过菌落数计算效价。2、电转化:（1）取电转化感受态细胞于冰上解冻，,标准质粒也置于冰上，同时准备干净的电击杯于冰上预冷。（2）在含有40l感受态细胞的0.5ml离心管中加入1L稀释十倍的标准质粒，充分混匀。然后转移到电击杯中，把电击杯放在电击仪上进行电击（2500V，5ms）。（3）在电击杯中加入160L无菌LB培养液（无抗生素），然后充分混匀，吸取于10ml离心管中，置于37恒温振荡器中培养4560min.（4）分别取2L和50L涂板，涂板操作同化学转化。（5）平板放到37的恒温培养箱过夜培养。第二天早上读取两个平板的菌落数。四、实验结果1、电转化感受态细胞的效价：涂2L菌液的平板上菌落数为88个，通过计算知道，电转化感受态细胞的效价为8.8108。2、化学转化感受态细胞的效价：无菌落生成，同组的也没有出来结果。五、讨论1、感受态细胞制备及转化中的影响因素细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。密度过高或不足均会影响转化效率。质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的标准质粒即可使50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管,枪头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。2、效价检测结果分