血清Alb、γG测定实验报告.doc

生物化学实验报告姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别： 生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称血清清蛋白、-球蛋白分离、纯化与纯度鉴定实验日期2014-11-20实验地点第4实验室合作者指导老师评分教师签名批改日期一、 实验目的1. 掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2. 掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法3. 掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4. 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法5. 了解柱层析技术二、实验原理蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。清蛋白A球蛋白a1a2bg等电点相对分子量（104）含量（）4.886.957675.0620255.0630495.129156.2126.857.315.6301220（一） 粗提（盐析法）盐析法是在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度,或达饱和状态,可使蛋白质在水中溶解度降低,从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。所以调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。（二） 脱盐盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。脱盐有多种方法，本实验采用凝胶层析法。凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分离的技术。（三） 纯化（离子交换层析）离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离（四） 纯度鉴定血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白5条区带。三、材料与方法：（一）材料1.器材葡聚糖凝胶层析柱（内经1.0cm，高7cm，砂芯滤板）1支DEAE纤维素阴离子交换层析柱（内经1.0cm，高6cm，砂芯滤板）1支烧杯1个吸管（1ml、10ml）10个试管6个离心管2个黑色反应板1个固定铁架1个螺旋夹2个离心机1台2.药品大牛血清0.3mol/LpH6.5醋酸铵缓冲溶液0.06mol/LpH6.5醋酸铵缓冲溶液0.02mol/LpH6.5醋酸铵缓冲溶液0.92mol/L（20%）磺基水杨酸0.05mol/L（1%）BaCl2溶液饱和硫酸铵溶液1.5mol/L NaCl0.3mol/L NH4AC溶液0.9%氯化钠溶液pH8.6巴比妥缓冲溶液（二）实验方法与步骤实验步骤注意事项1.离心要注意三点：（1）配平（对角线重量一致；（2）对称放置（沿对角线）；（3）听到异常声音立即断电。2.分离上清液与沉淀时：（1）试管倾斜，以防飞溅；（2）加样枪头不可触碰沉淀。3.加球蛋白溶液前，在胶床不暴露在空气的前提下，尽量使残余液体少。4.用离心管接1ml流出液。5.检测蛋白质时 用黑色反应板逐滴检测，直到明显白色沉淀出现，开始收集。5.检测阴离子时 用黑色反应板逐滴检测，直到完全无沉淀。6.加球蛋白溶液前，在胶床不暴露在空气的前提下，尽量使残余液体少。7.用离心管接1ml流出液。8.检测蛋白质时 用黑色反应板逐滴检测，直到明显白色沉淀出现，开始收集。9.检测阴离子时 用黑色反应板逐滴检测，直到完全无沉淀。10.此处蛋白质检测有一点反应就可以收集了11.筛选浓度高低，也用磺基水杨酸鉴定12. DEAE-纤维素柱不用再生，可直接用于纯化清蛋白13.以下几步必须注意不同浓度的选取，区分0.06mol/l和 0.3mol/l溶液的使用14.反应过程中，请注意仍然不要让胶床暴露在空气中。15.反应过程比较慢，可以用吸耳球适当加压。16. “醋酸纤维素薄膜电泳法”步骤如下：（1）准备 时间原因，老师替我们准备好薄膜及电泳槽；（2）点样 点在粗面上，轻触点样线一次不可反复点样；（3）电泳 点样面朝下，点样线置阴极，电泳50min；（4）染色 5min；（5）漂洗 34次至无色；（6）透明（7）定量 因实验目的，未进行这两步操作。16.最后一定要记得再生平衡，方便后续实验者使用。17.做标记是用深颜色的笔做标记，否则容易消失。四、实验记录（一）粗提1.混合后离心前，成乳白、乳黄色浑浊液（如图1）；图12.离心后，明显分层；3.分离后，球蛋白经稀释后，两溶液均呈现均一无色透明状液体。（二）脱盐1.鉴定蛋白质过程中，白色沉淀由不显著变为明显（如图2）； 图22.整体流速偏慢；3.硫酸根离子检测有明显白色沉淀变为无色，即为阴性时，进行再生平衡。（三）纯化1. 鉴定蛋白质过程中，白色沉淀不显著（如图3）。图3（四）纯度鉴定1.电泳条带呈现（如图4）。图4五、结果与讨论：1.定性鉴定结果如图5“血清清蛋白、-球蛋白纯度鉴定的电泳图谱” 图5 血清清蛋白、-球蛋白纯度鉴定的电泳图谱2.讨论分析(1) 清蛋白第1管点样不好，有较大弯折；(2) 清蛋白第1管比清蛋白第2管分离效果要好，可能由于接收时操作造成；(3) -球蛋白分离效果较好。3.讨论问题（1）硫酸铵盐析一步,为什么是0.8ml血清加0.8ml饱和硫酸铵?答：因为清蛋白和球蛋白的盐析浓度不一样，使用半饱和硫酸铵溶液可以使球蛋白沉淀而清蛋白不沉淀，0.8ml血清和0.8ml饱和硫酸铵混合可以形成半饱和硫酸铵溶液从而达到分离的目的。（2）为什么实验中DEAE纤维素柱分离-球蛋白后不用再生,可直接用于纯化清蛋白?答：因为DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，带正电荷，而-球蛋白带正电荷，不与DEAE结合能够不被吸附而从层析柱中首先洗脱流出，而且带负电荷的清蛋白能够与DEAE纤维素进行阴离子交换而结合，只要提高醋酸铵缓冲液的浓度就能够洗脱出清蛋白，所以可直接用于纯化清蛋白。（3）用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和-球蛋白的纯度,根据什么来确定它是清蛋白还是-球蛋白?判定它们纯度的依据是什么?答：根据醋酸纤维素薄膜上