菠萝蛋白酶测定实验报告.doc

14食安（5）班 刘嘉盈 201430520513 刘紫滢 01430520514 罗志锋 201430520515马俊宇 201430520516阮顺敏 201330130122菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定14食安（5）班 马俊宇201430520516摘要：本次实验通过对菠萝皮中存在的菠萝蛋白酶进行粗提取、盐析和透析从而纯化和分离；并采用考马斯亮蓝法测定提取液中蛋白质的含量，利用菠萝蛋白酶水解酪蛋白后的水解产物酪氨酸，在280nm处吸光值的高低，判断酶活性的大小。从实验结果看出，纯化程度越高，提取液中蛋白质的含量先降低，后升高。同时，实验测得菠萝蛋白酶的比活力、回收率随纯化程度的提高而先升高后降低。关键词：菠萝蛋白酶 纯化 酶活性 蛋白质含量 前 言菠萝蛋白酶主要分布于菠萝的茎和果实中，能分解蛋白质、肽、脂和酰胺，具有较高的生物活性，在各个生产领域中得到广泛的应用1。在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能2。菠萝萝蛋白酶 p H 在 4.05.5处于较稳定的状态，在中性环境中酶活保持最高，在偏酸环境下酶活下降较快，碱性环境能延缓失活3。本实验研究粗提取、盐析和透析所得到的菠萝蛋白酶提取液中的蛋白质含量、酶活性高低、回收率和纯化倍数等，对酶的纯化情况进行研究。1 实验材料与仪器11 实验材料与试剂新鲜菠萝（3个），盐析粗提液（PBS），酪蛋白试剂，激活剂，三氯乙酸(TCA)，透析袋，牛血清蛋白，考马斯亮蓝，乙醇12 实验仪器电子天平，台式天平，恒温水浴锅，冰箱，高速离心机，分光光度计，研钵，烧杯，量筒，容量瓶，移液管，漏斗，漏斗架，滤纸，试管，试管架，滴管，玻璃棒，纱布，洗耳球，标签纸，橡皮筋DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2 实验方法21 菠萝蛋白酶的粗酶提取 称取菠萝皮材料20g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高 速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH 7.8 PBS，持续搅拌1015min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4C 3000rpm离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。22 盐析 根据附录的“硫酸铵饱和度计算表”，按30%硫酸铵饱和度计算在上述酶提取液中需添加的固体硫酸铵量，称取固体硫酸铵于研钵中，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱和度为30%，放置于冰水混合物（4）30min 后，酶蛋白沉淀析出，4C 4000rpm离心10min，收集沉淀， 加入0.1mo1/L pH 7.8 PBS约15mL至完全溶解，测定其体积、蛋白质含量和酶活性。23透析 将溶解液装入2.5 cm8cm透析袋（预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30min）中，于 500mL 烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析，15min换水一次，换水34次后，检查SO42-是否已被除净（检查的方法是：取2mLBaCl2溶液放入一支试管，滴加23滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示SO42- 未除净，若无沉淀出现，表示透析完全）。若透析液有沉淀，将透析液用滤纸过滤，测定过滤液的体积、蛋白质含量和酶活性。24 酶活力测定方法 取2支试管，设置一支为实验对照，三支为平行样品。取0.1mL酶液，加入0.9mL激活剂，加入37预热的1%酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，加入10%三氯乙酸3mL反应终止酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。离心（3000r/min，5min）或过滤，清液于280nm波长下测定光吸收值。酶活单位定义：在上述条件下 ，每10min增加0.001个光吸收值为1个酶单位（U）。实验步骤按照表格1中完成。试剂(ml)对照组平行样品1平行样品2平行样品3TCA3酶液0.10.10.10.1激活剂0.90.90.90.9酪蛋白111137C准确反应10minTCA333A280nm OD值表格13实验结果与分析根据上述实验步骤，测得粗提取、盐析、透析得到的酶制剂在280nm处的吸光值如下表2示A280nm对照组平行样品1平行样品2平行样品3粗提取00.5230.5010.433盐析00.5340.4490.469透析00.4930.4500.535表231 蛋白质含量计算1233.13.1.1 标准曲线的绘制0-1000ug/ml标准曲线的绘制如表3管号1234 5 6 1000g/mL牛血清白蛋白（mL）蒸馏水（mL）蛋白质浓度（g/mL）01.000. 20. 82000. 40. 64000. 6 0. 8 1.00. 4 0. 2 0 600 800 1000表3 另取6支试管编号，按表中加入试剂。得到从1到6号管的牛血清白蛋白溶液浓度分别为0、200、400、600、800、1000g/mL，准确吸取各管溶液0.lmL，加入5ml考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置2min，测定595nm吸光值，绘制0-1000g/mL标准曲线。测得不同蛋白质浓度在595nm处的吸光度如下表4所示蛋白质浓度g/ml02004006008001000A595nm00.1200.3390.4760.5990.720 表4绘制蛋白质标准曲线如下图1示3.1.2 样品的测定 准确吸取样品溶液0.1mL放入具塞刻度试管中，与步骤（1） 操作相同，测得样品的光吸收值A595nm。测得样品吸光值如下表5示。样品粗提取蛋白质盐析蛋白质透析蛋白质吸光度1.0361.2231.2631.0421.1891.3091.0271.2161.274平均值1.0351.2091.282表53.1.3 结果计算 由标准曲线可查出相应的蛋白浓度（g/mL），可按如下公 式计算出样品中蛋白含量。 查出的蛋白提取液浓度（g/mL）定容体积(mL)样品蛋白含量(g g鲜重) 样品重量(g)实验所用样品质量为20g，根据标准曲线计算样品中蛋白质含量如下表6示粗提取盐析透析定容体积/ml5915.517.8蛋白质提取液浓度g/ml1469.91718.41822.7样品蛋白质含量g g鲜重 4381.591344.111635.95样品总蛋白质含量mg86.7226.6432.44表632酶活力计算0.0010.1A280nm酶液活力（U/mL）= 稀释倍数样品酶活力计算如下表7示粗提取盐析透析A280nm平均值0.6061.0250.738蛋白质提取液酶活力U/mL6060102507380总活力U357540158875131364表733酶比活的计算 酶比活（U/mg 蛋白）=酶活力/酶蛋白质含量酶比活的计算结果如下表8示粗提取盐析透析酶比活U/mg蛋白4122.95963.84049.4表834酶纯化过程中回收率计算 回收率（%）=（纯化酶总活力/ 粗酶液总活力）100= （纯化酶活力纯化酶液体积）/（粗酶活力粗酶体积）10035酶纯化倍数的计算纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力36实验结果 将测定的数据整理计算分别填入下表9示，并将菠萝蛋白酶的分离纯化效果进行分析和讨论。菠萝蛋白酶分离纯化表步骤总体积（mL）总蛋白质含量（mg）总活力（U）比活力（U/mg 蛋白）回收率（%）纯化倍数粗提取5986.723575404122.91001.00盐析15.526.641588755963.844.41.45透析17.832.441313644049.436.70.98表9根据表9得出以下结论，在粗提取、盐析和透析得到的提取液中：蛋白质含量先下降，后上升；蛋白酶总活力逐渐下降；蛋白质提取液的比活力先上升，后下降；酶纯化过程的回收率分别为100%、44.4%和36.7%；纯化倍数分别为1.00、1.45和0.98。4实验结论与讨论4.1数据分析a) 本实验中利用粗提取盐析透析的方法分离提纯菠萝皮中所含的菠萝蛋白酶。菠萝蛋白酶盐析后的蛋白质提取液浓度最高，粗提取次之，透析最低。随着盐析和透析的进行，菠萝蛋白酶的蛋白质含量和酶活力依次降低。菠萝蛋白酶盐析后的酶比活最高，粗提取略次之，透析最低。b) 提取液中总蛋白的含量下降，这是由于对菠萝皮提取液进行了纯化和分离，提取液中除了菠萝蛋白酶外的其他物质被除去，酶蛋白纯度提高。但提取液中总蛋白含量下降。c) 透析后比活力下降，理论上比活力应该升高，下降的原因可能是，实验采用的是先进行粗提取，再进行盐析，后进行透析，随着反应时间的延长酶逐渐失活，导致最终测得的酶比活力下降。也可能是实验环境中的温度、pH、金属离子等因素影响了酶分子的活性。d) 酶的回收率随酶的纯化程度的增强而降低。酶的回收率表示酶的稳定性。从实验结果看出，酶的回收率下降，可能的原因是反应时间的延长、环境温度、pH、金属离子等因素影响了酶的稳定性，使酶的回收率下降。菠萝蛋白酶因含有一个不稳定的游离巯基，所以在实验过程中极易被氧化而使其酶活下降4。e) 盐析纯化倍数大于1，透析纯化倍数小于1。盐析由于反应时间较短，纯化效果较好，纯化倍数是大于1的。而由于ii、iii中提到的因素对菠萝蛋白酶活性的影响，导致纯化后的酶对比于粗提取的酶，活性更低。所以透析得到的纯化倍数为小数。4.2防止酶失活变性的措施由于菠萝蛋白酶是一种巯基蛋白酶，极易被氧化而使其酶活下降。凡是能使蛋白质变性的因素都可能使它失去活性，比如物理因素温度、时间、压力、光、磁场；化学因素氧化、还原、溶剂、金属离子、离子强度、pH和生物因素酶修饰和酶降解5。所以分离纯化的时候要注意不能用不洁净的仪器（盛装过 PBS）来盛装酶液，不能靠近万用炉，不能用自来水作为透析液。在新型吸附沉淀法提取菠萝蛋白酶中，可以利用乙二胺四乙酸，它是一种螯合物，可有效地螯合原料中某些重金属离子，以避免其与酶结合而使酶失去活性，抗坏血酸则具有还原性，分子上的活泼羟基氢可使酶活性中心保持还原状态，从而有效地保持酶活性，其中以EDTA和L-半胱氨酸组合，效果最佳5。维生素C，也可以增强菠萝蛋白酶的稳定性，使菠萝蛋白酶的活性也有所提高，使用维生素C也比较经济6。4.3常见的酶活性表示方法a) U/mL酶液：1mL液体酶，1min水解酪蛋白产生1微克酪氨酸为一个酶活力单位。用于表示液体酶中的酶活大小；b) U/mg蛋白质：1g酶制剂，1min水解酪蛋白产生1微克酪氨酸为一个活力单位。用于表示酶制剂中酶活的大小；c) U/g干重或鲜重：1g样品，1min水解酪蛋白产生1微克酪氨酸为一个活力单位。表示材料中酶活的大小。4.3硫酸铵盐析选择0%30%饱和度的原因实验中硫酸铵盐析选择30%饱和度，是因为随着硫酸铵浓度的逐渐增大，盐析得到的菠萝蛋白酶的酶活回收率逐渐增大，当硫酸铵的饱和度达到40%的时侯菠萝蛋白酶的酶活回收率最大，为83.6%，往后开始逐渐减小，当硫酸铵的饱和度越大时，菠萝皮浸提液的盐析效果越好6，所以取30%左右的最好。参考文献1欧英杰.萝蛋白酶酶活力影响因素及测定酶活力方法的研究进展J.广东化工.2010（37）：40-512 章佩芬，郭勇，罗焕敏等. 菠萝蛋白酶的研究与应用进展J.华西药学杂志，2002，17(2):128-129.3董瑞兰.菠萝蛋白酶的分离纯化及部分应用性质的研究. D.福建：福建农林大学，20104 朱明英，林文