噬菌体筛选中文说明书.doc

Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit 应用噬菌体表面展示肽库 快速筛选肽配体 使 用 手 册 含tet选择性F因子的新大肠杆菌宿主菌： 不再需要minimal平板 目录号：#E8110SC 贮存于：-20 版本：2.71/9/02Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit 应用噬菌体表面展示肽库快速筛选肽配体 目 录： 简介 2 培养基和溶液 5 常规M13方法 .6 淘选程序（固定靶分子）.8 结合克隆的特征.12 其他淘选方法（液相结合法）.15 其他抗原表位作图方法（Protein A/G捕获法）.16 附录：优化肽结合相互作用.19 文库的氨基酸分布.21 试剂盒组成： （如无特殊说明，试剂盒中所有成分均需-20保存）： 随机十二肽噬菌体展示文库 100 l, 1.51013 pfu/ml。贮存于含50%甘油的TBS溶液中。复杂度 2.7109个转化子。 -28 gIII测序引物 5-HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3, 100 pmol, 1 pmol/l -96 gIII测序引物 5-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3, 100 pmol/l, 1 pmol/l E.coli ER2738宿主菌 F lacIq (lacZ)M15 proA+B+ zzf:Tn 10 (TetR)/fhuA2 supE thi (lac-proAB) (hsdMS-mcrB)5 (rk m k McrBC)。该菌株以含50%甘油的菌体培养物形式提供，非感受态细胞。贮存于-70。 链霉亲和素Streptavidin, 冻干粉 1.5 mg 生物素，10 mM 100 l Ph.D.TM是New England Biolabs, Inc. 的注册商标。 该产品仅售为研究用，不得以任何形式进行商业再销售。用该类产品发现的序列的商业化可能需要来自Dyax公司的美国专利5,223,409、5,403,484和/或5,571,698及其相关专利权的授权。有关授权信息请与Dyax Corp. 的企业发展部主管联系： Director of Corporate Development, Dyax Corp., Bldg. 600, Cambridge, MA 02139, fax 617-225-2501。 概述： 噬菌体展示是一项选择技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快速鉴定。最简单的淘选程序，是将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板（或磁珠）共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体（见图1）。被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。经3-4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。 展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面(3)，包括绘制抗原表位图谱(4-6)、研究蛋白质-蛋白质相互作用（7）和鉴定非肽配体的肽模拟型（8-11。）生物活性肽分子的鉴定可以通过对固定在平板上的纯化受体进行淘选（12）也可以在完整细胞上进行淘选（13-15）。蛋白酶底物的鉴定可通过在随机肽区域的上游加一段亲和tag，然后选用特异性的介质来区分切割和未切割的噬菌体（16）。另外，大的蛋白质分子如：抗体（17）、激素（18）、蛋白酶抑制剂（19）、酶（20）和结合蛋白（21）也可展示在噬菌体上，通过对随机突变文库的筛选，分离出各种具有亲和力或特异性改变的变异株。 Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒将随机十二肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上，因而是一个组合文库。所展示的十二肽表达在pIII的N末端，即：成熟蛋白的第一个氨基酸就是随机十二肽的第一个氨基酸, 十二肽后面是一段短小的间隔多肽，由Gly-Gly-Gly-Ser组成，然后是野生型pIII蛋白。该文库含有2.7109个电转化序列，用10 l本品提供的噬菌体进行扩增，每个序列一次可产生55个拷贝，对原始文库进行大量测序（见附录）表明该文库序列具有广泛的多样性，无明显的残基位置偏嗜。建议不要扩增原始文库来进行另外的淘选试验，因为一旦再扩增便会出现序列偏嗜现象。 NEB应用本品分别鉴定出了与链霉亲和素和单克隆抗体相结合的共有结合肽序列（见图2）。大量实验证明，任何情况下该文库的复杂度都足以产生多个可编码相同肽基序的DNA序列。 图1 用噬菌体展示肽库进行淘选 图2 用Ph.D.-12肽库测定抗原决定簇。用抗-内啡肽单克隆抗体对Ph.D.-12展示肽文库进行液相淘选，然后用Protein A-琼脂糖（第1和第3轮淘选）或Protein G-琼脂糖(第2轮淘选)亲和捕获抗体-噬菌体复合物。每轮淘选所选到的结合序列与-内啡肽的前12个氨基酸残基序列比较列于上图内，共有序列元件用方框示出。结果清楚地显示该抗体的抗原决定簇序列落在-内啡肽的前四个氨基酸残基（YGGF）处，在第三位有一定的可变性。第三轮筛有一个筛选到的克隆无插入子。 培养基和溶液： LB培养基： 每升含：10 g Bacto-Tryptone，5 g yeast extract, 5 g NaCl。高压灭菌，室温贮存。 LB/IPTG/Xgal平板： LB培养基 + 15 g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70时，加入1 ml IPTG/Xgal*，混匀倒平板。平板4避光贮存。 顶层琼脂： 每升含：10 g Bacto-Tryptone，5 g yeast extract, 5 g NaCl, 1 g MgCl26H2O, 7 g琼脂粉。高压灭菌，分成50 ml等份。固体培养基室温贮存，用时微波炉融化。 四环素贮液：以20 mg/ml的浓度溶于乙醇中。-20避光贮存。用前摇匀。 LB-Tet平板：LB培养基 + 15 g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70时，加入1 ml四环素贮液，混匀倒平板。平板4避光贮存，如果平板显棕色或黑色请勿用。 封阻缓冲液：0.1 M NaHCO3 (pH 8.6), 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN3。过滤除菌，4贮存。 TBS: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl。高压灭菌，室温贮存。 PEG/NaCl: 20% (w/v) PEG-8000, 2.5 M NaCl。高压灭菌，室温贮存。 碘化物缓冲液： 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 4 M NaI。室温避光贮存。 链霉亲和素贮液： 将1.5 mg链霉亲和素冻干粉（本试剂盒提供）溶于1 ml 10 mM磷酸钠(pH7.2)、100 mM NaCl、0.02% NaN3溶液中。4或-20贮存，避免反复冻融。 *IPTG/Xgal配方：将1.25 g IPTG (isopropyl D-thiogalactoside)和1 g Xgal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside)溶于25 ml二甲基甲酰胺中。溶液-20避光贮存。 常规M13方法： M13不是一个裂解性噬菌体，噬菌斑的形成不是由于菌体裂解而是由于细胞生长力减弱所致，因此其噬菌斑是浑浊的而不是清亮的。 菌株保存 1. 本试剂盒提供的宿主菌是一个强F+菌株，生长迅速，特别适合于M13噬菌体的增殖。尽管ER2738是一个recA+菌株，但我们在使用M13或噬菌粒载体的过程中从未发现有体内重组现象发生。其他F+的商品菌株如：DH5F和XL1-Blue或许可以代替ER2738应用,但未曾用本系统检验过。 2. 由于M13是一个雄性特异性大肠杆菌噬菌体，建议用于M13增殖的所有菌液都是从F因子正向选择培养基上挑菌接种的，而不是直接从本试剂盒提供的甘油菌接种培养的。ER2738的F因子上含有一个小转座子，赋予该细胞四环素抗性，因此可以在含四环素的平板上铺板筛选含F因子的细胞。 3. 从随产品提供的ER2738甘油菌划线接种LB-Tet平板，倒置平板37培养过夜。用封口膜封闭平板后4避光保存，最长可达一个月。 4. 用于感染噬菌体的ER2738菌液既可以在LB也可以在LB-Tet培养基中生长。只要不对培养物进行连续稀释，在非选择性培养基中F因子的丢失并不严重。 避免噬菌体污染 M13噬菌体的衣壳蛋白pIII通过与受体菌的F性纤毛相结合而介导感染。与野生型噬菌体相比，外源蛋白或多肽融合在pIII蛋白的N端展示明显降低了文库噬菌体的感染力。因此，当有任何野生型噬菌体污染时，每轮淘选试验之间的扩增步骤会强烈倾向于扩增野生型噬菌体，如果同时没有一个强有力的体外噬菌体结合选择程序来避免，即使痕量水平的污染也会在三轮淘选后使淘选出的噬菌体多数为野生型。 1. 在本手册所述的所有步骤中均使用带滤芯吸头，可以使污染外界环境中噬菌体的可能性大大降低。 2. 由于文库噬菌体源于常规克隆载体M13mp19，其含有lacZ基因，当铺在含IPTG和Xgal的平板上时，噬菌斑将呈蓝色。而外界污染的丝状噬菌体在同样的平板上将呈白色噬菌斑，同时这些噬菌斑还会比文库噬菌体的噬菌斑更大更模糊。因此所有的滴度检测步骤，建议一定要在LB/IPTG/Xgal培养基上铺板，如果有白色噬菌斑，则只挑取蓝色噬菌斑进行测序。 测定噬菌体滴度 只有当噬菌体的感染复度MOI (multiplicity of infection)值远低于1时（即细胞过量时），噬菌斑的数量才会随着加入噬菌体的量而呈线性增加。正因如此，建议检测噬菌体贮液的滴度时，在感染前进行稀释，而不是在高MOI值的情况下稀释被感染的细胞。低MOI值有助于确保每个噬菌斑仅含一个DNA序列。 1. 接种ER2738单菌落于5-10 ml LB培养基中，摇床培养至对数中期（OD600 0.5）。 2. 细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成3 ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。保存于45备用。 3. 37预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。 4. 在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体。 建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104。每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。 5. 当菌体培养物达对数中期，分成200 l等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。 6. 每管加入10 l不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5 min。 7. 将感染细胞加入45预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37预温的LB/IPTG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。 8. 待平板冷却5 min后，倒置于37培养过夜。 9. 检查平板，计数有102个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10 l噬菌体的空斑形成单位（pfu）滴度。 淘选程序 最简单直接的淘选方法有：直接将靶分子包被于塑材表面（通过非特异的疏水作用或静电相互作用），洗去过量的未吸附分子，然后将噬菌体库覆盖在已包被的靶分子的表面。根据靶分子的不同，直接包被法偶尔会导致配体结合位点难以进入，这或许是由于分子的立体封阻或许是由于靶分子表面的部分变性而引起。在这些情况下，可先将噬菌体库在液相中与靶分子进行预结合，然后将噬菌体-靶分子复合物亲和捕获于链霉亲和素包被的表面（见15页）或其他亲和介质上（见16页）。由于直接包被法相对简单，建议先按以下步骤试用此方法。如果没有淘选到明显的共有结合序列，再进行上述液相结合试验中的一种。 第一天 根据需同时在其上进行文库淘选的靶分子的数量和种类不同，淘选试验可以在单个灭菌聚苯乙烯培养皿、12-或24-孔板、96孔微量板中进行。每种靶分子至少包被一个板（或一个孔）。下述方法中给出的量是6015 mm培养皿的用量，括号中为微孔板的用量，其他中等尺寸的孔相应地调整此用量。但每种情况下，加入的噬菌体数量都是相同的：1.51011个病毒子。 1. 准备100 g/ml的靶分子溶液（溶于0.1 M pH 8.6的NaHCO3）。 如果需要稳定靶分子，也可使用其他相似离子强度的缓冲液（含金属离子等）。 2. 每板（孔）加入1.5 ml（微孔板每孔150 l）上述溶液，反复旋转直到表面完全湿润（小心不要使溶液溅出）。 3. 在增湿容器（如：排列有湿纸巾的可封口塑料盒）中4轻微震荡，孵育过夜。平板可在此容器中4贮存备用。 第二天 4. 挑ER2738单克隆（噬菌体滴度测定时铺的板）于10 ml LB液体培养基中。如果同一天扩增洗脱的噬菌体，也可将ER2738接种于20 ml LB液体培养基，这时请用250 ml三角瓶（不要用50 ml锥形管）。37剧烈震荡培养。 5. 倒掉每板中的包被液，板倒置在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液。每板（或孔）加满封阻液，4作用至少1 hr。 6. 按5中所述方法除去封阻液。再用TBST (TBS+0.1% v/v Tween-20)缓冲液快速洗板6次。每次均旋转以使板或孔的底部及边缘均被洗到，倾去缓冲液，倒置在干净纸巾上拍甩以除去残余溶液（或使用自动洗板机）。此操作要快以避免板干燥。 7. 用1 ml（微孔板则用100 l）的TBST缓冲液稀释41010的噬菌体（即10 l的原始文库），然后加到已包被好的板上，室温温和摇动10-60 min。 8. 倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液。 9. 按6中所述方法用TBST缓冲液洗板10次，每次换一干净纸巾以避免交叉污染。 10. 根据所研究的分子间相互作用，用1 ml（微孔板则用100 l）适当的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。一般情况下，是将靶分子的已知配体以0.1-1 mM的浓度溶于TBS溶液中或者用游离靶分子溶液（100 g/ml溶于TBS中）从固定靶分子上将结合的噬菌体竞争性洗脱下来。室温温和摇动10-60 min，将洗脱液吸入另一干净微量离心管中。 10a.另外，也可用非特异性缓冲液如0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2), 1 mg/ml BSA来分离已结合的分子：温和摇动10 min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中。然后再用150 l（微量孔则用 15 l）1M Tris-HCl（pH 9.1）中和上述洗脱液。 11. 按上述常规M13方法中的程序测定少量（1 l）洗脱物的滴度。如需要，可对第一或第二轮洗脱物滴度测定所得的噬菌斑进行测序，方法见下述。（必要时可将剩余洗脱物4贮存过夜，第二天扩增。这时，可将ER2738在LB-Tet培养基中过夜培养，第二天将培养物1:100稀释于20 ml LB中（用250 ml三角瓶盛装），加入未扩增洗脱物。37剧烈摇动培养4.5 hr，继续第13步）。 12. 剩余洗脱物应当被扩增：将洗脱物加入到20 ml ER2738培养物中（菌体应当处于对数前期），37剧烈摇动培养4.5 hr。 13. 将培养物转入一离心管中，然后，4 10,000 rpm离心10 min。上清液转入另一离心管中，再离心。 14. 将上清的上部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。让噬菌体4沉淀至少60 min，最好过夜。 第三天 15. 410,000 rpm离心PEG沉淀15 min。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。 16. 沉淀物重悬于1 ml TBS中，悬液转入微量离心管中，4离心5 min使残余细胞沉淀。 17. 上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育15-60 min。 4离心10 min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。 18. 沉淀物重悬于200 l TBS, 0.02% NaN3中。离心1 min，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新鲜管中。此即为扩增后的洗脱物。 19. 根据上述常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物。4贮存。 20. 再包被一个板或孔准备第二轮淘选时用，见第8页步骤1-3。 第四和第五天 21. 计数板上蓝斑数确定滴度。用这个值来计算相应于1-21011 pfu的加入量。如果滴度太低，接下来的几轮淘选可用低至109 pfu的噬菌体加入量进行试验。 22. 进行第二轮淘选：用第一轮淘选扩增的洗脱物中1-21011 pfu的噬菌体量重复步骤4-18，在清洗步骤中将Tween的浓度增至0.5% (v/v)。 23. 在LB/IPTG/Xgal平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度。 24. 再包被一个板或孔准备第三轮淘选时用，见第8页步骤1-3。 第六天 25. 进行第三轮淘选：用第二轮淘选扩增的洗脱物中21011 pfu的噬菌体量重复步骤4-11，清洗步骤中同样用0.5% (v/v)的Tween。 26. 在LB/IPTG/Xgal平板上测定第三轮淘选所得洗脱物未扩增时的滴度。第三轮洗脱物不必再扩增，除非还要进行第四轮淘选（可选步骤，见附录）。滴度测定时得到的噬菌斑可做测序用：只要注意平板培养时间不要超过18小时，培养时间过长容易出现缺失。其余洗脱物4贮存。 27. 挑一ER2738单克隆于LB-Tet培养基中培养过夜（不要接种稀释后的铺板培养物）。 对照淘选试验 按照上述程序，以链霉亲和素作为靶分子，在封阻液中加入0.1 g/ml的链霉亲和素以结合BSA中混有的少量生物素。用0.1 mM的生物素（溶于TBS中）洗脱结合噬菌体，至少作用30 min。经三轮富集/扩增后，得到的链霉亲和素结合肽的共有序列应当含有如下基序： His-Pro-Gln (HPQ) (8)。 K = G or T; M = A or C 图3 随机十二肽-gIII融合蛋白的N末端序列。融合蛋白表达时N端有一段信号肽前导序列，蛋白分泌后前导序列被切除，使随机肽直接位于成熟蛋白的N末端，下箭头指示前导序列的切割位点。-28和-96引物的互补位置也在图中标出。 图4 精简遗传密码表。文库的随机序列区域仅用32个密码子编码所有20种氨基酸。这使单密码子氨基酸的出现频率相对较高，同时排除了三个终止密码子中的两个。在构建该文库的菌株中，琥珀终止子TAG (*)可被Gln抑制。 结合克隆的特征鉴定 噬菌斑的扩增 1. 将ER2738过夜培养物按1:100稀释接种于LB培养基，分1 ml到培养管中。每个要鉴定的克隆一管。一般情况下，由第三轮淘选物中取10个克隆便足以检测结合肽中的共有序列。 2. 用灭菌牙签或吸头，挑一蓝色噬菌斑到上述1 ml培养管中。注意：要从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选，以便保证每个被挑的噬菌斑仅含一个DNA序列。 3. 37摇床培养4.5-5 hrs（不要过长）。 4. 备选步骤。除测序单个克隆外，也可以对整个被选噬菌体集合进行测序。这样只通过一个步骤就可以得到共有结合序列，但这种情况只是当公有序列元件出现在每个克隆的12残基“框架”内相同位置的时候。加10 l未扩增的洗脱物到1 ml稀释的过夜培养物中，37摇床培养4.5-5 hrs。 5. 培养物转入微量离心管中，离心30 sec。上清转入以新鲜管中，再离心。用移液器将80%的上清转入新鲜离心管，此即为扩增噬菌体贮液，可以4贮存几个星期而对滴度影响不大。长期贮存应用灭菌甘油1:1稀释后，-20贮存。 测序模板的快速纯化(22) 本方法非常快速，无需酚或层析，可以产生足够纯的模板进行手工或自动双脱氧测序。 1. 按上述方法进行噬菌斑扩增，在第一步离心后，将500 l含噬菌体上清转入一新鲜离心管。 2. 加200 l PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10 min。 3. 离心10 min，弃上清液。 4. 短暂离心，小心吸去残余上清。 5. 沉淀物彻底重悬于100 l碘化物缓冲液中，加入250 l乙醇。室温温育10 min。短时间的室温温育使单链噬菌体DNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。 6. 离心10 min，弃上清。用70%的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。 7. 沉淀重悬于30 l TE 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA中。 8. 5 l的上述模板溶液足够进行35S或33P标记的手工双脱氧测序, 或染料标记的自动循环双脱氧测序。根据测序方法的不同, 适当增减模板用量。 测序指南 1. 建议用-28引物进行手工双脱氧测序，而-96引物应用于自动测序。 2. 所读序列相应于模板的反义链。然后将互补链写出，与图3中的上链对照进行检查。检查随机区域内每个密码子的第三位是否为G或T。根据图4所列的遗传密码表由此链翻译得到氨基酸序列。 3. 本文库的宿主菌为ER2738 (supE), 在此菌株中，终止密码子TAG被谷氨酰胺(Gln)所抑制。因此翻译时，应将TAG翻译为谷氨酰胺（见图4）。 用ELISA检测所选多肽对靶分子的结合 1. 在扩增噬菌斑进行DNA测序（见12页）时，将所剩余的含噬菌斑上清4保存。 2. 对每一个要鉴定的噬菌斑克隆，接种一管ER2738于20 ml LB培养基中，37培养至稍微浑浊。或者，也可以将过夜培养的ER2738按1:100的比例稀释于20 ml LB培养基中。 3. 于每管ER2738培养液中加入5 l噬菌体上清，37通气培养4.5hrs。 4. 上述培养物转入离心管中，10,000 rpm离心10 min。上清移入新鲜离心管，再离心。 5. 取80%上清于新鲜离心管中，加1/6体积的PEG/NaCl。4沉淀至少1 hr或过夜。 6. 4 10,000 rpm 15 min离心沉淀，弃上清，再进行短暂离心，吸去残余上清。 7. 沉淀重悬于1 ml TBS中，悬液转入微量离心管，4离心5 min除去沉淀中的残留细胞。 8. 上清转入新鲜微量离心管，加1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上作用15-60 min。 4离心10 min，弃上清，再进行短暂离心，吸去残余上清。 9. 沉淀重悬于50 l TBS中，按6-7页常规M13方法中所述测定噬菌体滴度。4贮存。 10. 用100-200 l 100 g /ml的靶分子(溶于0.1 M pH 8.6 NaHCO3中)包被ELISA板的每个孔，每个待鉴定克隆一排包被孔。在密封的湿盒（如：排有湿纸巾的封口塑料盒）中4包被过夜。 11. 甩出多余靶分子溶液，并倒置平板在纸巾上拍甩除去残液。每孔加满封阻液。另外，每个待鉴定克隆的一排未包被孔也加入封阻液，以检测所选序列对BSA包被塑料板的结合力。在将噬菌体加入靶分子包被板前，还要再准备一个微量滴定板进行噬菌体的系列稀释，这个板也要封阻。单独在另外一个封阻板中进行稀释是为了避免稀释过程中有噬菌体吸附到靶分子上。最后，所有封阻板4封阻1-2 hrs。 12. 甩出封阻液，用1TBS/Tween洗板6次，每次均倒置平板在干净纸巾上拍甩去洗液，Tween浓度应当与淘选清洗步骤中所用浓度相同。 13. 在单独的封阻板中每孔预先加入200 l TBS/Tween，由每排第一孔加入1012个病毒子开始对噬菌体进行4倍系列稀释至第12孔2105个病毒子。 14. 用多通道移液器将每排稀释好的噬菌体加入包被有靶分子的板中。室温震荡作用1-2 hrs。 15. 用1TBS/Tween洗板6次（同步骤12）。 16. 在封阻液中以1:5,000的比例稀释HRP标记的抗-M13抗体（Pharmacia #27-9411-01）。每孔加入200 l稀释抗体，室温震荡作用1 hr。 17. 用1TBS/Tween洗板6次（同步骤12）。 18. 按下述方法准备HRP底物溶液： ABTS贮液可以提前准备：将22 mg ABTS（Sigma #A1888）溶于100 ml 50 mM的柠檬酸钠溶液（pH 4.0）中，过滤除菌，4贮存。对每个待检测板，于检测步骤前将36 l 30%的H2O2加入21 ml ABTS贮液中。 19. 每孔加200 l底物溶液，室温作用10-60 min。 20. 用读板仪记录405-415 nm处的吸光值。 其他淘选方法 (液相结合法) 除直接用靶分子包被平板外，也可以使靶分子和噬菌体在液相中反应，然后亲和捕获噬菌体/靶分子复合物。根据靶分子的不同，液相结合可能会产生比表面结合更好的结合动力学特征，还会避免塑料表面的靶分子有部分变性的问题。亲和捕获要求在靶分子上有某种亲和tag，通常的做法是将靶分子生物素化，然后用固定化的链霉亲和素捕获靶分子/噬菌体复合物。 靶分子的生物素化 1. 将2 mg靶蛋白溶于1 ml 50 mM的NaHCO3 (pH 8.5) 中，为了保持靶蛋白的稳定性，也可用其他缓冲液，但不要用含游离氨基的缓冲液（如：Tris）。 2. 用前，溶解1 mg Sulfo-NHS-LC-生物素(可从Pierce购买，货号 #21335)于1 ml水中，震荡混匀。加74 l此溶液到靶蛋白溶液中，本试剂为生物素的水溶性活性酯，可以特异性地结合到溶液中（或表面）赖氨酸残基的-氨基上。剩余的未用溶液应抛弃，因为贮存期内此酯很容易就会水解掉。 3. 将管冰上放置2 hrs。 4. 透析除去未反应的生物素，对1升TBS缓冲液进行透析，至少更换两次透析液，也可用凝胶过滤或CentriconTM（Amicon）等超滤装置。 5. 用Bradford或Lowry方法对生物素化蛋白进行定量。靶蛋白的生物素化可用商品抗生物素抗体进行Western检测或ELISA得以证实。通过染料HABA 2-(4-hydroxyazobenzene)benzoic acid (可从Pierce购得, 货号 #28010)颜色转换比色试验可以对靶蛋白的生物素化程度进行定量测定。根据NEB的结果显示，上述反应条件可使每个蛋白分子平均标记两个生物素化赖氨酸。 淘选 基本与8-10页的程序相同，只是用链霉亲和素100 g/ml链霉亲和素溶于0.1 M NaHCO3 (pH 8.6)中而不是用靶蛋白分子包被板。封阻液应含有0.1 g/ml的链霉亲和素以结合BSA封阻液中含有的生物素。并用下述步骤代替淘选试验中的步骤7。 7a. 封阻板时（步骤5），预先将噬菌体与生物素化靶蛋白分子结合。即：在微量离心管中混合0.1 g生物素化靶蛋白（对25 kDa蛋白来说 10 nM终浓度）和1.51011 pfu的投入噬菌体（原始文库10 l的量）于400 l TBS中, 室温作用10-60 min。为了保证靶蛋白的稳定性，也可使用相同离子强度的其他缓冲液（含金属离子等）。 7b. 将噬菌体-靶蛋白溶液加入到已清洗过的封阻板中，室温温育10 min。 7c. 加入生物素至终浓度0.1 mM继续温育5 min，这一步骤将直接结合在链霉亲和素上的噬菌体（即那些展示有HPQ序列的噬菌体）从板上置换下来。而生物素化靶蛋白从链霉亲和素上解离的速度是非常慢的，所以该浓度的生物素不会将生物素化靶蛋白置换下来。继续第8页第8步。 其他测定抗原表位的方法 (用Protein A/G捕获法进行液相结合) 除了在固定于表面的抗体上进行淘选试验外，还可以先让文库与抗体在液相中反应，然后用Protein A和/或Protein G-琼脂糖珠对抗体-噬菌体复合物进行亲和捕获。这种液相淘选每个试验所需的抗体量远少于表面淘选试验，而且噬菌体展示肽更容易接近抗体上的抗原结合位点，也避免了抗体在塑料板表面的部分变性现象。用Protein A-琼脂糖和Protein G -琼脂糖交替淘选可以避免偶尔选择到特异性结合到Protein A或Protein G上的肽序列的可能性。不能与Protein A很好结合的抗体（如：绵羊、山羊、鸡和大鼠多克隆抗体，以及人IgG3和小鼠IgG1单克隆抗体），可以在所有淘选实验中选用Protein G-琼脂糖。 本方法简便易行，只要有合适的捕获融合蛋白的亲和介质，就可以用任何与亲和tag融合的靶蛋白对多肽文库进行淘选。 1. 接种ER2738 (可用滴度测定时铺板的菌)于10 ml LB液体培养基中, 如果同一天还要扩增洗脱下来的噬菌体，就同时接种ER2738于20 ml LB液体培养基中（用250 ml的三角瓶培养，不要用50 ml的培养管）。37剧烈震摇培养。 2. 吸取50 l Protein A-琼脂糖介质（50%的水悬液）于微量离心管中，加1 ml TBS+0.1% Tween (TBST)溶液。轻弹管壁或温和震荡重悬介质。对于山羊、鸡、绵羊和大鼠多克隆抗体，以及人IgG3亚类单克隆抗体，每轮淘选中的这一步均用Protein-G。如果结合及清洗缓冲液(TBS)的pH可达8.6，小鼠IgG1亚类单克隆抗体也可使用Protein A。 3. 用台式微量离心机（CapsulefugeTM或其他）低速离心30 sec沉淀介质，小心吸去上清，注意不要使介质悬起。 4. 介质重悬于1 ml封阻缓冲液中，4作用60 min。 5. 作用其间，用TBS缓冲液将1.51011个噬菌体粒子（相当于10 l原始文库）和300 ng抗体稀释至终体积200 l，抗体终浓度为10 nM。室温作用20 min。 6. 封阻反应后，按步骤3沉淀介质，并用1 ml TBS洗4次，每次均需沉淀介质。 7. 将噬菌体-抗体混合物加入洗过的介质中，温和混匀，室温作用15 min并不时混匀。 8. 按步骤3沉淀介质，弃上清，用1 ml TBTS洗10次。 9. 重悬沉淀介质于1 ml 0.2 M的Glycine-HCl (pH 2.2), 1 mg/ml BSA中, 洗脱结合的噬菌体，室温作用10 min。 10. 用台式微量离心机离心洗脱混合液1 min，小心将上清转入一新鲜微量离心管中，注意不要吸起沉淀的介质。 11. 立即用150 l 1 M Tris-HCl, pH 9.1中和洗脱液。 12. 在LB/IPTG/Xgal平板上测定一小量洗脱液的滴度。方法按常规M13方法中所述，6-7页。 13. 剩余洗脱液应被扩增：加洗脱液到20 ml ER2738培养物（此时应处于对数早期）中，37剧烈摇动培养4.5 hrs。（或者，洗脱物4贮存过夜，第二天扩增。这样的话，应做ER2738在LB-Tet中的过夜培养，第二天，按1:100的比例稀释于20 ml LB中，同时加入未扩增洗脱液，250 ml三角瓶37剧烈震摇培养4.5 hrs。） 14. 培养物转入离心管中，4 10,000 rpm离心10 min。上清转入新鲜离心管再离心。 15. 80%的上清转入另一新鲜离心管，加1/6体积的20% PEG, 2.5 M NaCl。使噬菌体4沉淀2 hrs或过夜。 16. 4 10,000 rpm离心PEG沉淀15 min。弃上清，再短暂离心后吸去残余上清。 17. 沉淀重悬于1 ml TBS中，悬液转入一微量离心管，4离心5 min沉淀残留细胞成分。 18. 上清转入一新鲜微量离心管，再用1/6体积的PEG/NaCl重新沉淀。冰上作用15-60 min。 4微离心10 min。弃上清，再短暂离心，用吸头除去残余上清。 19. 沉淀重悬于200 l TBS, 0.02% NaN3中。离心1 min沉淀任何不溶性物质。上清转入一新鲜管中。此即为扩增的洗脱液。 20. 按常规M13方法（6-7页）中所述，在LB/IPTG/Xgal平板上测定扩增洗脱液的滴度。4贮存。 21. 第二天，计数板上蓝斑数目确定噬菌体滴度。并用这个值计算对应于1-21011 pfu的输入噬菌体体积。如果滴度太低，可以用低至109 pfu的输入噬菌体量再进行几轮淘选。 22. 进行第二轮淘选试验：用第一轮扩增洗脱物中相应于1-21011 pfu的量作为输入噬菌体量重复步骤1-21。用Protien G-琼脂糖而不是Protein A-琼脂糖，并将结合和清洗缓冲液中Tween的浓度提高至0.5%（v/v）。 23. 进行第三轮淘选试验：用第二轮扩增洗脱物中相应于1-21011 pfu的量作为输入噬菌体量重复步骤1-21。如果第一轮用的是Protein A-琼脂糖，那么这一轮还用Protein A-琼脂糖，保持结合和清洗缓冲液中Tween的浓度仍为0.5%（v/v）。预算好滴度测定步骤地时间，使LB/IPTG/Xgal板培养时间不超过18 hrs，因为培养时间过长可能会产生缺失。 24. 挑选10个或更多的噬菌斑扩增噬菌体，并按12-13页所述方法制备DNA测序模板。 25. 如果第三轮测序的克隆中没有明显的共有序列，则扩增第三轮的剩余洗脱物（步骤13-21），用Protein G-琼脂糖进行第四轮淘选。 附录 优化肽结合相互作用 有几个变量会影响淘选过程中的选择严格程度。根据所研究的相互作用的不同，调整选择或洗脱的强度对获得结合肽共有序列是必需的。 1. 去污剂：在结合或清洗Buffer中添加去污剂（通常是Tween-20）能降低噬菌体与靶分子和/或封阻试剂BSA之间的非特异性相互作用。最初几轮淘选中用较低浓度的Tween会增加洗脱物滴度，然后每轮逐渐增加Tween浓度（最大可到0.5%）来逐步提高选择的严格性。然而，在同步实验中，我们用0.5%恒定Tween浓度和逐步增加的Tween浓度（0.1, 0.3, 0.5%）分别进行三轮淘选，获得了相同的共有序列。当所研究的相互作用特异性比较强，以至于最初几轮淘选洗脱物的滴度（即：可结合序列的数目）可能会非常低时，建议初始几轮淘选使用较低的Tween浓度。 2. 温度：根据所研究的结合相互作用是焓驱动还是熵驱动，可以通过提高结合步骤的温度来分别增加和降低选择的强度。建议试用的结合温度为：4、室温和37。温度可以高至55而不失活噬菌体。 3. 结合和洗脱时间：结合时间短，易于筛选到快速结合（kon）的小肽；相反，洗脱时间长，容易筛选到解离速度（koff）慢的小肽。由于小肽结合到靶分子上的结合平衡常数ka等于kon /koff，那么，就可以通过缩短结合时间和延长洗脱时间的方式来提高筛选的严格度。在最后几轮淘选试验中，洗脱可以在两个阶段进行：在短时间内洗脱的噬菌体抛弃，长时间洗脱下来的噬菌体进行下一轮淘选或铺板。如果用pH 2.2的甘氨酸缓冲液洗脱，时间不要长于10 min，否则噬菌体的感染性会降低。 4. 靶分子的浓度：如果在液相中对靶分子进行淘选，可以通过降低靶分子的浓度来提高淘选的严格程度 (23)。建议用10 nM的初始靶分子浓度，在最后几轮筛选纳摩尔级亲和力配体时也可将浓度降低到1 nM。 5. 淘选轮数：每经一轮淘选扩增试验，就会使能与靶分子结合的肽序列在噬菌体库中得到 富集。保持每轮的噬菌体加入浓度相同，就会使展示特定结合序列的病毒子在库中的含量逐步增加，直到大多数或所有洗脱粒子都会展示一个共有序列。根据所研究的相互作用和所施加的筛选严格度的不同，通常会在2-3轮淘选后能达到这种情况。如果3轮淘选后也没有明显的共有序列发现，则第三轮的洗脱物应当继续扩增进行第四轮淘选试验。 6. 文库的选择：如果三或四轮淘选后，仍没有明显的配体共有序列发现（或者所有的噬菌斑都呈白色），可能就是所用文库中不含有能与靶分子紧密结合的序列克隆。对这种现象的解释是：统计上理想配体序列太少或不存在（不具代表性）（见21-22页）；或者，肽分子不能以足够强的亲和力与靶分子结合而被筛选，这种情况下用Ph.D.-C7C文库会更好一些，此文库中，所有展示肽结构均被局限于一个7-残基二硫loop环内，其结合构象比以线性形式表达的肽文库更有效、结合更紧密（由于结合熵得到改善）；最后，如果配体仅要求在一个短的区域内有几个结合位点，那么Ph.D.-7肽文库可能是一个更好的选择。由于十二肽库提供了更大的随机区域，就会有利于选择到有多个弱结合位点的序列，而不是只有少数几个强结合位点的序列。这时，Ph.D.-7肽文库可能更有利于共有序列的出现。然而遗憾的是，在缺乏靶分子-配体相互作用的详细结构信息时，是不可能预测哪一种文库能产生最好的结合配体的。 请浏览我们的网站: ，查阅适时更新的常见问题与回答（FAQ）。 Ph.D.TM文库中的氨基酸分布 由原始文库中随机挑选104个克隆进行测序，有6个克隆（5.8%）不含展示肽插入序列。剩下的1176个测序密码子（98个克隆12个随机密码子）中氨基酸分布如下： *预期频率= 该氨基酸的密码子数32个密码子100%。注意在文库构建过程中精简了遗传密码的使用：NNK（32个密码子）。 展示肽序列中含有精氨酸或单个半胱氨酸会干扰pIII蛋白的分泌和噬菌体的感染力；因此十二肽序列中含有精氨酸或半胱氨酸的克隆很难选到（24）。 在文库增殖菌株中终止密码子TAG被的抑制，可以接受Gln残基。 文库中特定肽基序出现概率的计算 十二肽噬菌体展示文库中含某一给定肽基序的可能性（概率）可用下述经验数据来计算： 1. 将特定肽基序中每个残基的观测频率即observed frequency（以小数形式表示，见上表）相乘，即得到获得该序列的绝对概率p值 。如果此肽基序的长度小于12氨基酸残基，则p应当再乘以此肽基序可在十二肽“框架”内出现的各种方式数（即：6肽乘以7，5肽乘以8等等）。 2. p乘文库复杂度n (2.7109)得到文库内展示目的肽基序的克隆的预期数。 3. 文库中有k个克隆展示目的肽基序的可能性P (k)可用Poisson分布来计算， P (k) = e-k/k!。当k=0（即：文库不含目的肽基序）时, P (0) = e- = e-np 。 4. 因此，文库中至少有一个克隆展示目的肽基序的可能性即为P (k0) = 1- P (0) =1- e-np 。 示例：噬菌体展示文库中含六肽基序Gly-Ala-Arg-Cys-Ile-Ala的可能性为多少？ 1. 由前表可知: p (Gly-Ala-Arg-Cys-Ile-Ala) = (.026)(.060)(.047)(.005)(.034)(.060)7 = 5.210-9。一定要乘以7，因为目的六肽基序可以从随机十二肽的第1-7位开始。 2. = np = (2.7109) (5.210-9) = 14。我们可望文库中有大约14个克隆展示序列Gly-Ala-Arg-Cys-Ile-Ala。 3. P (k0) = 1- e-np= 1- e-14 = 0.9999。可见文库中至少含有一个拷贝目的肽基序的可能性几乎达到100%。参考文献 1. Parmley, S. F. and Smith, G.P. (1988) Gene 73, 305318. 2. Smith, G. P. and Scott, J. K. (1993) Methods Enzymol. 217, 228257. 3. Reviewed in Cortese et al. (1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6, 7380. 4. Scott, J. K. and Smith, G. P. (1990) Science 249, 386390. 5. Cwirla, S. E., Peteres, E. A., Barrett, R. W. and Dower, W. J. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 63786382. 6. Felici, F., Castagnoli, L., Musacchio, A., Jappelli, R. and Cesarini, G. (1991) J. Mol. Biol. 222, 301310. 7. Hong, S. S. and Boulanger, P. (1995) EMBO J. 14, 47144727. 8. Devlin, J. J., Panganiban, L. C. and Devlin, P. E. (1990) Science 249, 404406. 9. Oldenburg, K. R., Loganathan, D., Goldstein, I. J., Schultz, P. G. and Gallop, M.A. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 539