哮喘遗传学研究进展.doc

哮喘遗传学研究进展生垦垦盏盘查旦墨查茎XjMedJ,January2004,Vo133,No.1哮喘遗传学研究进展青岛市市南区浮山医院(266071)刘璐沈滨谭宁兰丽华哮喘是一种气道的慢性炎症性疾病,发病机制复杂,其家族的聚集性早已为人们广泛关注.随着分子生物学技术的迅猛发展,哮喘的遗传学研究已成为国际热点.现认为哮喘是一种多基因遗传性疾病,是由一些基因与环境因素共同作用而致病,呈现家族聚集倾向,其遗传率为7O8O.现将近年来对于支气管哮喘的研究方法,研究发现综述如下.1哮喘基因的研究进展表现型的确立是基因学研究的第一步,对于单基因遗传性疾病来说,表现型可以根据存在或缺少某一表型而定义;但对于多基因遗传性疾病,这样定义是不够准确的.在流行病学调查研究中,一般依靠既往的喘息病史并结合特应性表现和气道高反应性诊断哮喘.特应性表现包括血清总IgE升高和变应原皮试阳性两个方面.吸入组胺或乙酰甲胆碱是测定气道高反应性常用的激发试验,以降低1S最大呼气容量的2O(Pc20FEV1)所需的试剂浓度剂量为气道反应性的指标.如果一种遗传性疾病的生化或生理基础不清楚,可通过两条途径寻找基因1:候选基因途径:将哮喘基因以连锁分析或染色体分析基本定位后,通过检索该标志附近与该区域之中所有的已知的基因,与哮喘已有联系或未建立联系的基因,已知的运动应力测验(EST),已知的模式生物对应的同源板块上的基因EST,用它们直接进行致病突变的筛选.也可将已知但与哮喘尚未建立联系的基因定位,再在定位区域附近检索已定位的哮喘.定位克隆:定位克隆的起点是定位,即建立表型(包括疾病)与基因组中的某一部位之间的联系,然后根据这一位置的信息,来筛选可表达的结构基因,然后比较患者与正常人中这些结构基因的区别,以确定与哮喘相关的改变,然后确定哮喘相关基因.连锁分析既是最早传统的基因定位方法,又是与现代生物技术相结合有新发展的重要基因定位方法.应用人类染色体基因的连锁分析进行基因定位就是应用被定位的基因与另一遗传座位在同一染色体上的连锁关系这一特点进行的.生殖细胞在减数分裂时,发生交叉交换,一对同源染色体有两个相邻的座位,距离较远,两者间就可能发生交换,出现重组.如两个座位相距较近,发生重组机会极少,呈连锁传递.这种重组值用重组率表示,即基因之间的遗传距离.用连锁分析法进行基因定位需要利用大量的遗传标记,这些遗传标记按孟德尔方式遗传,标记位点要求有多态性.某一基因,特别是致病基因与某个标记非常接近时,通过家系的连锁分析,即可确定该基因在同一染色体上,甚至是某一点上.常用的遗传标记经历了从粗到细的转变过程,即从第一代标记到第三代标记的发展.第一代标记为限制性片段长度多态性(RFLP).第二代标记为短串联重复序列(STR),第三代标记为单个核苷酸多态性(SNP).连锁分析绘出的基因图区域很大,需要更精确地局限某基因位点时,用连锁不平衡法.连锁分析的传统方式称对数优势记分法(LODs分析).根据标记位点和致病位点连锁,分析其可能发生在家系中的重组体,据此信息计算二者的距离.LODs分析即两对以上等位基因以某一重组率连锁时,产生所观察到的家庭与不存在连锁情况下产生该家庭的概率之比的对数.最适用于单基因疾病的连锁分析,亦可用于多基因疾病的连锁分析l_2,可得到多态性位点与存在连锁的基因之间的距离.需已知数个家庭中几代人的患病资料作为研究对象.使用LODs法进行连锁分析时,需明确基因的遗传方式,对于哮喘等多基因遗传疾病,可由分离分析选定遗传模式,若遗传模式选错,则会得出错误结论,但不会出现假阳性结果.连锁分析时还应排除双系遗传.即一个家族中有两个致病因子在起作用,否则家系连锁分析无效.同胞配对法是通过受累亲属标记座位的基因分布来检验标记等位基因与致病基因的分离是否独立,从而判断两者是否连锁的一种统计方法l3.采用的亲属为同胞,统计方法分为两种:世代一致性法(IBD)和状态一致性法(IBS).当受累同胞的标记等位基因的亲代来源容易判断时可使用IBD法,否则可用IBS法.采用此法分析时,若遗传标记与致病基因无关,那么同胞中其一带有某个遗传标记特定等位基因条带的几率是50/50若某个特定条带出现率>5O,则提示此遗传标记与疾病基因相关,在大量同胞对检测中,若某一标记与疾病基因相关,则被检群体中>5O的人携带此遗传标记特定等位基因条带.同胞配对法分析不需明确遗传方式,对家系材料要求低,但此法对连锁的判别效能差于家系连锁分析,且不能确定连锁的程度,同样需要排除双系遗传.相关分析是研究多基因疾病的传统方法l_4,研究时在同一人群中寻找患者组和正常对照组,比较在患者组和对照组中某一遗传标记特定等位基因条带的出现率来确定相关的可能性.假若这种相关情况在其他人群中同样如此,那么此候选基因与疾病相关.相关的意义:该基因即致病基因;该基因与疾病存在连锁不平衡.2哮喘相关基因2.1B一肾上腺素能受体基因的多态性与哮喘及其临床表型的关系:B2一肾上腺素能受体(&一adrenergicreceptor,&一AR)是具有7个跨膜结构的G蛋白偶联受体家族成员之一,可与内源性儿茶酚胺以及外源性受体激动剂,拮抗剂结述4?46?堕医药杂志2004年1月第33卷第1期ShanxiMedJ,January2004,V0133,N0.1合,将它们的信号传导到细胞内产生作用Is.编码人一AR的基因定位于染色体5q31.32区,无内含子的基因.该基因长约1239bp,编码413个氨基酸.已有几个多态性位点被发现,其中编码区第16,27和164位氨基酸的变异己在体外实验中证实可以改变pzAR的功能,是近年来国际上研究哮喘易感性及疾病调节基因的重要候选基因之一.研究报道很多,但结果不尽相同Reihsaus等研究肾上腺素能受体基因上存在9个突变位点.哮喘患者这9个突变位点中有4个可能导致氨基酸序列的改变,75的重症患者第16位氨基酸(核苷酸48)为甘氨酸(Gly)而非精氨酸(Arg)的纯合子个体.Martinez等7的研究发现,Arg16纯合型及Arg/Gly杂合型患儿在吸入&一AR激动剂后FEV1改善大于15.3的例数分别是Gly16纯合变异型患儿的5.3倍和2.3倍.Dewar等8在对家系样本的研究中发现,谷氨酰胺(GIn)27谷胺酸(Glu)位点基因型与高血清总IgE有显着相关性;在对独立个体成人哮喘样本的研究显示,B一AR基因多态性位点与发生变态反应性疾病或哮喘的危险性间不存在肯定的相关性.Weir等10j在研究&一AR基因多态性与哮喘病情严重性的关系时,未见任何多态性位点及其单体型与致死性及重症哮喘相关,表明&一AR基因多态性不是重症哮喘的主要决定因素.综合目前的研究结果表明,&一AR基因对哮喘遗传易感性以及疾病严重性的调节作用不是由单一多态性位点决定的,而是多个位点通过不同的机制对&一AR受体产生调节作用.&一AR基因多态性与IgE升高有明显相关性.B.AR基因多态性影响哮喘的表型及严重程度,影响药物的治疗效果1.但也有相反的报道.2.2血管紧张素转换酶(ACE)基因多态性:ACE基因位于常染色体17q23,基因长度约为21000,包括26个外显子和25个内含子,1988年由Sonbrier等克隆出来.ACE基因的多态性主要有一个287bpDNA片段在第16内含子中存在或丢失所决定.含有此片段的ACE等位基因称为I型等位基因,不含此片段的称为D型等位基因.从而产生了3个不同的基因型,即在17号染色体上均插入这一片段为插入型纯合子(I/I),均缺失这一片段为缺失型纯合子(D/D型),如在一条染色体上插入而另一条染色体缺失这一片段为杂合子(I/D).大量研究表明,ACE基因多态性与血浆和细胞内ACE水平密切相关,其ACE水平以D/D型最高,ACE是血管紧张素系统的关键酶,血管紧张素转换酶高度表达于肺,其作用有两方面1:可使血管紧张素(AT)I转换为ATI,AT一通过与气道平滑肌的作用参与哮喘的发病;使某些哮喘的炎性介质如缓激肽,速激肽及P物质失活.AT能引起气道平滑肌及肺血管收缩,促进微血管渗漏和气道内炎症反应;并可通过促进释放有收缩作用的炎性介质如内皮素等而作用于平滑肌.因此,推测携带D/D基因型的个体由于循环中ACE水平较高,诱发肺内ATI产生增多,后者可直接作用于气道平滑肌而参与哮喘的发病.ACE基因I/D多态性的检测可为哮喘早期诊断和预防提供依据.2.3组织相容性白细胞抗原(HLA)与哮喘:HLA的II类抗原(包括DP,DQ,DR)在抗原呈递过程中起关键作用,因而影响免疫反应的特应性.从大量的HLA与过敏性状的遗传相关性研究表明,人类第6号染色体上HLA区域的DR位点存在着决定对某种特异性抗原起反应的免疫反应基因,其遗传方式为常染色体显性遗传.大量遗传流行病学研究表明,HLA一类基因多态性与哮喘发病相关联,但不同作者在不同种族进行研究所得结果不一样.原因可能如下:不同种族遗传背景不一样,疾病的免疫遗传学特征不同,即使我国南北方群体的遗传背景也存在一定差异J.对哮喘表型的定义不同,不同哮喘患者的过敏原各不相同,机体所产生的免疫应答类型会有所差异,因此将特应性个体混杂起来分析会产生假阳性和假阴性的结果.今后应合作研究采用大样本量,在各个种族进行分层分析.HLADQ基因在HLADR基因和HLADP基因之间,它们之间存在连锁不平衡,因此会影响群体和家系结果的一致性.例如,法国作者采用了聚合酶链反应(PCR)结合寡核苷酸杂交的方法研究了HLADQB1基因与甲苯双异氰酸酯(TDI)诱发哮喘间的关系,发现HLADQB10501DQB10201/301等位基因的频率在(TD1)诱发哮喘患者中明显升高,认为二者是TDI诱发哮喘的危险因素,而HLADQA10501/DQB10601基因型在长期接触TDI的健康对照者中的频率明显升高,这提示该基因型可能为TDI诱发哮喘的保护性因素.而有人1.报道HLADQB10503是意大利TDI诱发哮喘的危险基因型,HLADQB10501为保护性基因型.Mapp等1在另外一个群体研究的结果却显示HLADQA10104/DQB10503基因型在TDI诱发哮喘患者中频率显着升高.HLADQA1O1O1/DQB10501基因型在哮喘患者中却明显减低.2.4白细胞介素(IL)一4和IL一1O基因启动子区多态性IL一5与哮喘:IL一4基因启动子区多态性与哮喘IL一4启动子多态性的功能与体内增强的IL一4表达活性有关,与哮喘的发病有关.IL一4基因启动子区多态性与哮喘的关系通过家系研究已经证实染色体5q31.33区是哮喘发病的一个很重要的候选基因,它包含有IL一3,IL一4,IL一5,IL一9,IL一13和粒单核细胞集落刺激因子(GMCSF)基因的基因簇,这些细胞因子介导了许多参与哮喘发病的生物反应,如IL一4,IL一13诱导IgE的同型转换,IL一5,IL一13和GMCSF与嗜酸细胞的存活与活化有关,IL一3,IL一9促进肥大细胞的增生.IL一4基因就位于5q31.3附近.近年来,IL一4基因启动子区多态性已成为国外许多学者的研究热点.国外学者发现IL一4基因中存在一系列的多态性,与哮喘的多种表型相关联.Burchard等研究发现IL一4基因启动子区域第589位点的基因多态性可影响哮喘患者的气道阻塞程度,并可能与哮喘发作的严重程度相关.Rosenwaseer等1.对位于5q31.1区域的多个细胞因子基因的调控序列应用PCRSSCP术进行研究,发现IL一4启动子区域开放阅读框上游590bp处有CT的变异,而这一变异明显与血清高水平IgE相关.IL生鱼堡垫盘:量旦茎鲞茎1期ShanxiMedJ,January2004,Vol33,No.110启动子多态性与哮喘,IL一10具有很强的炎症抑制作用,并能够诱导T细胞对抗原的免疫耐受,是哮喘发病中的一种抗炎因子.许多实验证实,哮喘患者中IL一10的分泌是减少的.有人在体外培养外周血单核细胞时发现IL一10可减少IL一4诱导的e转录表达及IgE的合成,同时还加强IL一4诱导7转录,使得保护性抗体IgG4合成增加.由于IL一10的强大抗炎作用,使得IL一10基因成为研究哮喘发病的重要候选基因之一.人的IL一10基因位于1号染色体,双胞胎家系研究表明,IL一10的分泌75是由遗传决定的,而且IL一10的产生主要是受转录水平的调控,在哮喘病人中其IL一10mRNA水平低于正常人.在哮喘发作期,支气管组织,BALF中细胞有IL一5mRNA表达,其表达强度与病情程度相关,与肺功能第1秒用力呼出量(FEV1)及呼气峰流速率(PEFR)呈负相关2.IL一5是一种在哮喘发病中起重要作用的炎症细胞因子,近年有资料表明2,嗜酸性粒细胞(E0S)尤其低密度嗜酸性粒细胞是引起气道反应性反应的关键细胞.E0S为IL一5调控的效应细胞,但活化后的EOS又能产生包括IL一5在内的数种炎症细胞因子.2.5原癌基因与哮喘:原癌基因参与调节细胞因子的表达和释放2,clos基因通过它的编码核蛋白(1eucinezipper,LZ)形成异质二聚体,并与酸性磷酸酶(API)的DNA结合位点(TGATA)结合,从而激活或抑制各种靶基因转录,导致细胞的生长和分化,它在细胞增生时表达增强,细胞静止时很少或不表达2,诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达可诱发支气管上皮clos表达,los还是反式激活IL一3基因表达的转录因子之一2.cmyc原癌基因,其产物myc蛋白,表达于增生细胞中,经丝裂原刺激后可表达高水平的CmycmRNA,而cmyc的反义寡核苷酸可抑制细胞进入s期,使之不能增生2.另有人认为,cmyc表达与机体细胞增生与凋亡之间周转状态密切相关,有研究结果表明:正常豚鼠气道及肺组织内仅有很低水平的clos,cmyc基因表达,说明气道及肺内细胞处于正常增生分化状态,而哮喘发作豚鼠气道及肺组织内上述原癌基因表达明显增强,分别为正常的3.5,7倍,揭示细胞增生分化明显.原癌基因几乎参与信号传递通路的每一环节,该类基因对神经递质,激素,炎性介质等外界刺激引起的传入信息在数分钟内作出反应,进行表达,对生命活动起重要作用.哮喘是一种以慢性增生为病理基础的气道炎症,原癌基因的增强表达可加速细胞因子及炎症介质的表达与释放,促进细胞的增生与分化,增加细胞对炎症介质的敏感性,同时炎症介质组织胺IL一5,IL一8,内毒素(ET),肿瘤坏死因子(TNF)等可促进原癌基因的表达.2.6支气管高反应性(BHR)的基因调控:BHR是支气管哮喘的特征之一,是哮喘发生和发展的一个重要因素.动物实验显示哮喘者和非哮喘者的离体平滑肌的反应性无差异,提示哮喘者的反应性增高并非是平滑肌细胞本身差异所致.有研究表明,BHR与血清中总IgE密切相关,目前很多研究将BHR调节基因定位于染色体5q和llq上.Postma?47?等通过同胞配对分析和LOD评分分析显示BHR与染色体上5q上的遗传标记物D5S436及D5S658存在连锁关系.研究证明,高水平血清总IgE与BHR呈连锁遗传,且BHR易感基因位于染色体5q上IgE调节基因附近,这与染色体5q31,Q33附近存在一个或多个BHR易感基因的假设一致.有人研究表明,染色体llql3上高亲和性IgE受体(FcqRII3)基因第5内含子上微卫星DNA标记的高度多态性与BHR呈连锁关系,而在无BHR的特应性患者却未表现出连锁关系.另有研究发现,BHR基因与11q上DllS527的168等位基因密切相关.但也有人对该结论持否定态度.2.7其他与哮喘有关的基因调控:抗胰蛋白酶(alAT)基因,在哮喘发病中有一定作用.蛋白酶抑制物(alPI)对血小板活性因子的合成,释放有调节作用.而血小板活性因子则是引起哮喘的重要介质之一.PI系统有70多个基因类型,呈常染色体共显性遗传.Townley发现MS型与气道的高反应性有关.Hayes等认为哮喘患者1一PI功能下降,对炎性介质的调节能力下降致使气道炎症发展.此外,7一干扰素基因可能与机体的特异性有关.7-IFN作为IL一4的拮抗剂可以下调B细胞产生IgE的能力.12个月婴儿血中高,中,低水平7-IFN可作为以后出现特异性症状的预测因子.3哮喘的遗传学研究与临床治疗相结合哮喘基因的确定将对哮喘病的临床治疗产生巨大的影响.首先,哮喘相关基因的产物将为治疗提供新的标靶.其次,越来越可能完全而准确地界定高危人群,对其采取早期措施,防止慢性严重哮喘和伴随的气道重建.第三,基因治疗成为可能.基因治疗是指运用DNA重组技术设法修复患者细胞内有缺陷的基因,使细胞恢复正常的功能而达到治疗遗传病的目的.基因治疗的基本策略包括基因修正,基因添加,重新开放已关闭的基因,使有类似功能的基因表达超过异常基因的表达.基因抑制在于阻断有害基因的表达,基因封闭,反义RNA能封闭mRNA的表达,引入特定基因,以提高免疫力.基因治疗方法包括目的基因的转移,采用直接注射法,电穿孔法,病毒介导转移法等,选择适当的靶细胞.虽然基因治疗存在着导入基因的持续表达,高效表达,安全性和伦理道德问题,但目前已有哮喘小规模的尝试,例如转入抑制变态反应的细胞因子基因.Thl/Th2平衡在免疫调节中起着重要作用.已证实,哮喘患者存在着T细胞向Th2细胞的优势转化,这种优势的Th2免疫反应在哮喘发病机制中起重要作用.IL一2可诱导T细胞向Thl细胞方向转化,Thl细胞产生的细胞因子7-IFN可抑制Th2细胞因子的产生.因此,转入这些细胞因子的基因,使之在体内表达,从而可达到治疗哮喘的目的.随着哮喘分子生物学和分子遗传学研究的进展,哮喘基因的研究和基因诊断会有突破性进展.参考文献1SchorkNJ.Pc20FEVIinnespiratior.AmRespirCritCareMed,1997,4(supp1):103109.2SchorkNJ,BeohnkeM,TerwilligerJD,eta1.Distribntorand?48?西医复杂e2004年月第33卷第1期ShanxiMedJ,January2004,Vol33,No.1regulatiorofLIFrelease.AmJHumGenet,1993:11271136.3郭政,李霞,何颖.医学遗传学与遗传流行病数据分析.哈尔滨:黑龙江科学技术出版社,1996.165166.4LaneSL,ArmJP,StaynovDZ.eta1.Circulatingadhcsionmoleculesindisease.AmJRespirCellMolBiol,1994,11:4248.5LiggettSB.Molecularandgeneticbasisof一adrenergicreceptorfunction.JAllergyClinImmunol,1999,103:4246.6ReihisausE,INNisM,MaxintureN,eta1.Mutationsinthegeneencodingforthep2一adrenergicreceptorinnormalandasthmaticsubject.AmJRespirCellMolBiol,1993,8:334339.7MartinezFD,GravesPE.BaidinimCF,eta1.Associationbetweengeneticpolymorphismsofthe口2一adrenoceptorandresponsetoalbuterolinchildrenwithandwithoutahistoryofwheezing.JClinInvest,1998,100:31843188.8DewarJC,WheatleyAP,VennA,eta1.02一adrenoeeptorpolymorphismsareinlinkagedisequilibriumbutarenotassociatedwithasthmainanadultpopulation.ClinExpAllergy,1998,28:442448.9DewarJC,WilkinsonJ,WheatleyA,eta1.Theglutamoyl2732一adrenoeeptorpolymorphismisassociatedwithelevatedIgElevelsinasthmaticfamilies.JAllergyClinImmunol,1997,1OO:261265.10WeirTD,MallekN,SandfordAJ,eta1.02一adrenergicreceptorhaplotypesinmild,moderateandfatal/nearfatalasthma.AmJRespirCritCareMed,1998,158:787791.11McGrawDW,LiggettSB.Codingblockand5leadereistronpolymorphismsofthep2一adrenergicreceptor.ClinExpAllergy,1999?4(Supp1):4345.12ErdosEG.AngiotensinIconvertingenzymeandthechangesinourconceptthroughtheyears.Hypertension,1900,16:363367.13OberC,MoffattMF.Contributingfactorstothepathobiologythegeneticsofasthma.ClinicsChestMedicine,2000,21:245261.14赵桐茂,主编.HLA分型原理和应用.上海:上海科学技术出版社,1984.173.15BigonJS,AronY,JulyBH,eta1.HLAclassIIallelesinisocyanateinducedasthma.AmJRespirCritCareMed,1994,l49:7l一75.16BakbinuiA,BaricordiDR.FabbriLM.eta1.AssociationbetweentoluenediisocyanateinducedasthmaandDOBImarkers:apossibleroleforasparticacidatposition57.EurRespirJ.1996,9:207210.17MappCE,BegheB,BalboniA.eta1.AssociationbetweenHLAgenesandsusceptibilitytotoluenediisoeyanateinducedasthmaticandnonatopiccontrolsubjects.ClinExpAllergy,2000,30:651656.18RisebwasserLJ,KlemmDJ,DresbackJK,eta1.Promoterpolymorphisminthechromosomegeneclusterinasthmaandatopy.ClinandAllergy,1995,255:7475.19YounesM.AsthmainKuwaitiArabs.IntArchAllergyImmunol,2000.122:19O一194.20AntoolJM,VanOA.RudolfCL,eta1.ElectofantiIL一5andIL一5onairwayhyperreactivityandeosinophilsinguineapig.AmRewRespirDis,1993,147:548552.21KuoHP,YuTR,YuCT,eta1.Hypodenseeosinophilnumberrelatestoclinicalseverityofairwayhyperresponsivenessandresponsestoinhaledcorticosteroidsinasthmaticsubjects.EurRespirJ,1994,7:14521459.22MarxJL.Thelosge